Extraktion von Biomarkern aus Sedimenten - beschleunigte Lösemittelextraktion
Quelle: Labor von Jeff Salacup - University of Massachusetts Amherst
Die Verteilung von einer Gruppe von organischen Biomarker genannt Glycerin-Dialky…
1. Erhebung der notwendigen Materialien
- Proben zu extrahieren. Proben (in diesem Fall, Sediment) sind eingefroren, gefriergetrocknet, zerkleinert, und vor der Extraktion homogenisiert und in Gruppen, um die Effizienz zu maximieren extrahiert.
- Abhängig von der Größe der Stichprobe Sammlung Fläschchen mit einem Volumen von 40 oder 60 mL verwendet. Für dieses Experiment Borosilikat Glasvials (40 mL) und Lösungsmittel sicher Kappen verwendet. Verbrennen Vials, Borosilikatglas Pipetten und mit einem Gewicht von Dosen bei 550 ° C 6 h vor der Beseitigung der möglichen organischen Verunreinigungen zu gewährleisten.
- Dichlormethan (DCM) und Methanol sind häufig in den meisten organischen Geochemie Laboratorien. Einzeln zu verwenden, (Methanol zuerst, gefolgt von DCM) Labor-Tools und Glaswaren vor Gebrauch abspülen. Eine Mischung von Dichlormethan, Methanol (MeOH; 9:1) ist in vielen Labors verwendet, um effizient Biomarker mit einer breiten Palette von Polaritäten zu extrahieren. Lösungsmittel sollte frei von organischen Verunreinigungen sein.
- Erhalten Sie eine beschleunigte Lösungsmittel Extraktor für dieses Experiment zu verwenden.
2. Vorbereitung des Sample-Zellen
- Montieren Sie eine Sample-Zelle für jede Probe extrahiert werden, plus ein Leerzeichen.
- Schrauben Sie für jede Zelle eine Endkappe auf ein Ende der Zellkörper.
- Legen Sie einen verbrannt-Glas-Faser-Filter auf jede Zelle mit einer Pinzette Lösungsmittel gespült. Dann, langsam und vorsichtig den Filter nach unten drücken in die Zelle mit der Filter-Kolben.
- Beschriften Sie die Zellkörper von Nummer (z.B. 1-22) für jede Probe und schreiben Sie "leer" auf die leere Zelle.
- Füllen Sie die Lücke mit Kieselgur (oder Sand) und Kappe mit einem zweiten Endkappe. Handfest anziehen.
3. Vorbereitung der Proben
- Legen Sie ein mit einem Gewicht von Zinn auf den Labormaßstab und dann Tara verbrannt.
- Spülen Sie die Labor-Spachtel mit Lösungsmittel, dann verwenden Sie, um eine entsprechende Masse der Probe in das mit einem Gewicht von Zinn zu übertragen, und zeichnen Sie die Masse.
- Die Masse der Probe variiert je nach seinen Gehalt an organischer Substanz. Schlanke Material relativ organischer Substanz (marine Schlamm) erfordern mehrere Gramm, während organische Substanz Reiches Material (Blattgewebe) viel weniger erfordern.
- Übertragen Sie das gesamte Material in der Waage Dose in eine vorbereitete ASE Zelle.
- Legen Sie ein weiteres Glasfaser Filter auf den oberen Teil der Zelle, dann drücken Sie langsam und sanft nach unten, bis es erreicht die Spitze der Stichprobe mit der Filter-Kolben.
- Hinzufügen von Kieselgur (oder Sand) für die Zelle, bis es fast voll ist. Achten Sie darauf, um jeglichen Schmutz aus den Zellkörper Threads zu entfernen.
- Kappe am oberen Rand der Zelle mit einem anderen Endkappe.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.6 für jede Probe.
4. Vorbereitung der Sammlung Fläschchen
- Beschriften Sie jedes Fläschchen mit der Nummer eines entsprechenden Zelle (z. B. 1-22 oder leer) und Kappe mit ASE Sammlung Fläschchen Kappe.
(5) Extraktion
- Platzieren Sie jedes Sample-Zelle in einen nummerierten Steckplatz auf dem oberen ASE-Tablett.
- Legen Sie den entsprechenden Sammelbehälter in der gleichen Nummer Steckplatz auf dem unteren ASE-Tablett.
- Erstellen der Extraktionsmethode mit Hilfe der Tastatur auf die ASE. Bei 100 ° C und 1.200 Psi zu extrahieren. Extrakt probieren jeweils 3 X mit ein statisches Halten von 10 min und spülen die Zellkörper mit 50 % der Gesamtmenge zwischen statische hält.
- Sicherstellen Sie, dass die Lösungsmittel Flasche enthält genügend Lösungsmittel um alle Beispiele zu extrahieren.
- Spülen Sie die ASE 3 X vor dem Start des Laufs durch Drücken der Taste "Spülen" auf dem Steuerkreuz ASE.
- Drücken Sie Start.
Die beschleunigte Lösungsmittelextraktion ist eine schnelle, effiziente und hochdurchsatzfähige Technik, die zur Trennung organischer Biomarker aus einer großen Anzahl geologischer Sedimentproben verwendet wird.
Traditionell werden Extraktionsmethoden wie Ultraschall oder Soxhlet verwendet, aber der Nachteil dieser Protokolle ist, dass sie zu langsam sind, um genügend Material für eine detaillierte Paläoklimarekonstruktion zu verarbeiten. Eine neuere Technik, die beschleunigte Lösungsmittelextraktion (ASE-Methode), wurde mit Blick auf Effizienz und hohen Durchsatz entwickelt.
Die ASE-Methode verwendet eine Kombination aus hohen Temperaturen und hohem Druck, um Proben zu extrahieren, und kann mehrere Proben in einem einzigen, relativ schnellen Vorbereitungslauf durchführen.
Dieses Video ist das dritte in einer Reihe, in der detailliert beschrieben wird, wie Biomarker aus Sedimenten extrahiert werden können. Es wird das Verfahren behandelt und einen Einblick in die Vorteile von ASE gegenüber der Beschallung oder Soxhlet-Extraktion geben.
Bei der beschleunigten Lösungsmittelextraktion werden die Proben in Stahlzellen geladen, die dann auf ein Karussell geladen werden. Die Entnahmefläschchen für jede Probenzelle werden ebenfalls auf ein separates Karussell geladen. Das Gerät lädt eine Probenzelle in einen internen Ofen. Das Lösungsmittel wird aus einer Lösungsmittelflasche durch eine Reihe von Ventilen gepumpt, bis ein ausreichender Druck erreicht ist.
Dieser Druck wird für eine Zeit gehalten, die von der Probe und dem Analyten vorgegeben wird. Anschließend wird das Lösungsmittel aus der Probenzelle durch eine Stahlleitung in das entsprechende Auffanggefäß gespült. Der Vorgang kann mehrmals wiederholt werden. Temperatur, Druck und Dauer können für die Probe angepasst werden.
Die hohe Temperatur erhöht die Kinetik der Extraktion, während der hohe Druck verhindert, dass das Lösungsmittel flüssig wird. Das Sammelfläschchen enthält nun einen Gesamtlipidextrakt, und was in der Probenzelle übrig bleibt, wird als Rückstand bezeichnet. Es besteht sowohl aus anorganischem Material als auch aus organischem Material, das nicht lösungsmittelextrahierbar ist, das sogenannte Kerogen.
Nachdem wir nun mit den Prinzipien der beschleunigten Lösungsmittelextraktion vertraut sind, werfen wir einen Blick darauf, wie dies im Labor durchgeführt wird.
Nach dem Sammeln von interessanten Proben; Gefriertrocknen, homogenisieren und dekontaminieren, wie in einem anderen Video dieser Serie gezeigt.
Sobald alle Proben vorbereitet sind, stellen Sie eine Zelle für jede zu extrahierende Probe und eine zusätzliche für eine Blindprobe zusammen. Schrauben Sie dazu eine Endkappe auf den Zellkörper. Platzieren Sie mit einer lösungsmittelgespülten Pinzette einen verbrannten Glasfaserfilter auf jedem Filter. Drücken Sie den Filter langsam und vorsichtig mit dem Kolben nach unten.
Beschriften Sie die Zellkörper für jede Probe mit Nummern und beschriften Sie den Rohling separat. Stellen Sie eine verbrannte Wiegedose auf eine Laborwaage und tarieren Sie. Spülen Sie einen Spatel mit Lösungsmittel aus, geben Sie damit 5 bis 10 g Probe in die Wiegedose und notieren Sie die Masse.
Füllen Sie das gesamte Material in der Wiegedose in die entsprechende Zelle. Setzen Sie einen weiteren Glasfaserfilter darauf und stampfen Sie ihn vorsichtig an, bis er die Oberseite der Probe erreicht.
Fügen Sie ein Dispergiermittel wie Kieselgur oder Sand hinzu, bis es fast voll ist, und achten Sie darauf, dass keine Ablagerungen in die Zellkörperfäden gelangen. Verschließen Sie die Oberseite der Zelle mit einer weiteren Endkappe. Wiederholen Sie diese Schritte für jede Probe und den Rohling.
Beschriften Sie jedes Entnahmefläschchen mit der Nummer einer entsprechenden Probenzelle oder eines Rohlings und verschließen Sie es mit einer Fläschchenkappe. Platzieren Sie jede Zelle in einem nummerierten Schlitz im oberen ASE-Fach. Stellen Sie die Parameter für die Extraktionsmethode über die Tastatur an der ASE auf 100 ? C?und 1.200 psi. Extrahieren Sie jede Probe 3 Mal mit einem statischen Halten von 10 Minuten und spülen Sie den Zellkörper mit 50 % seines Gesamtvolumens zwischen den statischen Haltevorgängen.
Stellen Sie als Nächstes sicher, dass die Lösungsmittelflasche genug enthält, um alle Proben zu extrahieren. Spülen Sie die Instrumentenleitungen 3 Mal, bevor Sie den Lauf starten. Drücken Sie abschließend auf Start.
Nehmen Sie die Durchstechflasche aus der ASE. Nachdem die Biomarker extrahiert wurden, müssen sie vor der Analyse gereinigt werden.
Die beschleunigte Lösungsmittelextraktion ist eine vielseitige Technik, die für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden kann, von denen einige hier untersucht werden.
Die beschleunigte Lösungsmittelextraktion kann auch bei anderen Arten von Proben, einschließlich Lebensmitteln, eingesetzt werden. Rückstandsanalytik zur Prüfung auf Pestizidkontamination wird häufig in behördlichen und industriellen Einrichtungen durchgeführt, um die Sicherheit und Qualität von Lebensmitteln wie Obst oder Gemüse zu ermitteln. ASE kann verwendet werden, um Organochlor-Pestizide aus Lebensmittelproben zu extrahieren und die Art oder den Gehalt an Rückständen in den Produkten zu bestimmen. Anhand dieser Informationen kann dann festgestellt werden, ob die Produkte für den menschlichen oder tierischen Verzehr geeignet sind. Zum Beispiel sollte Dieldrin je nach Produkt innerhalb von 0 bis 0,1 ppm auf Lebensmitteln zu finden sein.
Nahrungsbestandteile können auch mit ASE extrahiert werden. So können beispielsweise Produkte wie Schokolade, die einen hohen gravimetrischen Fettgehalt aufweisen können, extrahiert werden. Durch die Verwendung von ASE mit Petrolether als Lösungsmittel kann Fett aus Schokoladenproben abgetrennt und einer quantitativen Analyse unterzogen werden, um einen genauen prozentualen Fettgehalt pro bekannter Menge Schokolade zu bestimmen. Anhand dieser Informationen können Aufsichtsbehörden die Angaben von Schokoladenherstellern überprüfen, oder Hersteller können Informationen erhalten, um genaue Lebensmitteletiketten zu erstellen.
Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Extraktion von Lipid-Biomarkern mittels beschleunigter Lösungsmittelextraktion (ASE) gesehen. Methoden zur Weiterverarbeitung und Analyse finden Sie in nachfolgenden Videos.
Danke fürs Zuschauen!
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Q1: Why is accelerated solvent extraction better than sonication or Soxhlet extraction?
Accelerated solvent extraction is faster and more efficient than traditional methods like sonication or Soxhlet extraction. ASE combines high temperature and high pressure to extract biomarkers from sediment samples in a single, relatively fast preparation run. This high-throughput capability enables researchers to process hundreds or thousands of samples needed for detailed paleoclimate reconstruction, which older extraction methods cannot achieve.
Q2: How do temperature and pressure work together in accelerated solvent extraction?
In accelerated solvent extraction, high temperature increases the kinetics of the extraction process, speeding up biomarker separation from sediment. High pressure simultaneously keeps the solvent from volatizing, or evaporating, during extraction. This combination of elevated temperature and pressure allows the ASE method to efficiently extract organic compounds while maintaining solvent integrity throughout the procedure.
Q3: What materials are used to prepare samples for accelerated solvent extraction?
Samples are loaded into steel cells with combusted glass fiber filters placed above and below the sediment material. A dispersant such as diatomaceous earth or sand is added to fill the cell and improve solvent contact. End caps seal the cell, and collection vials receive the extracted material. All glassware and filters are combusted to remove organic contaminants before use.
Q4: What is the difference between a total lipid extract and kerogen in ASE?
A total lipid extract is the organic material dissolved by the solvent and collected in the vial after accelerated solvent extraction. Kerogen is the non-extractable organic material that remains in the sample cell after extraction. The residue left behind comprises both non-organic material and kerogen, representing compounds that are not solvent-extractable.
Q5: How can accelerated solvent extraction be used for food safety testing?
Accelerated solvent extraction can extract organochlorine pesticides and other residues from food samples like fruits and vegetables. ASE determines the types and levels of pesticide contamination present, helping regulatory and industrial facilities verify whether produce is safe for human or animal consumption. For example, dieldrin levels must remain within 0 to 0.1 parts per million depending on the product.
Q6: What role do biomarkers play in paleoclimate reconstruction?
Biomarkers like glycerol-dialkyl glycerol-tetraethers (GDGTs) are produced by archaea and bacteria and change predictably in response to air or water temperature. The distribution of these biomarkers in sediment sequences of known age allows scientists to reconstruct past temperature changes on decadal to millennial timescales. This paleoclimate data requires rapid analysis of hundreds or thousands of samples, making accelerated solvent extraction essential.
Q7: What happens to the extracted biomarkers after accelerated solvent extraction?
After accelerated solvent extraction, the total lipid extract containing biomarkers must be purified before analysis. The purification process removes unwanted compounds and concentrates the target biomarkers. Purification of a total lipid extract with column chromatography is a common next step in preparing samples for detailed chemical and paleoclimate analysis.