Kultivierung und Auflisten von Bakterien aus Bodenproben

Die Bestimmung einer genauen Anzahl von Umweltbakterien ist entscheidend für die Beurteilung der Gesundheit eines Bodenökosystems. Dies kann durch die Kultivierung von Bakterienkolonien mit geeigneten Verdünnungen erreicht werden.

Bodenbakterien sind ein wichtiger Bestandteil eines gesunden Bodenökosystems und spielen eine Rolle bei der Zersetzung, der Stickstofffixierung und dem Nährstoffkreislauf. Oberflächenböden sind ein Substrat aus organischen und anorganischen Partikeln, die eine komplexe Matrix bilden, die Poren umgibt, die sich mit Luft oder Wasser füllen. Diese Bedingungen schaffen ein ideales Ökosystem für Bakterien, wobei Oberflächenböden typischerweise mehr als eine Million Bakterien pro Gramm enthalten.

Aufgrund dieser hohen Bakterienkonzentration ist eine Verdünnung erforderlich, bevor sie auf Wachstumsmedien aufgetragen wird. Serielle Verdünnungen können die Konzentration der ursprünglichen Bodenprobe auf ein Niveau reduzieren, das niedrig genug ist, um einzelne Kolonien auf Medienplatten zu züchten, was die Berechnung der anfänglichen Bakterienzahlen in der Bodenprobe ermöglicht.

In diesem Video wird veranschaulicht, wie serielle Verdünnungen von Bodenproben vorbereitet werden, wie diese Bakterienproben beschichtet werden und wie die Keimzahlen im Boden aus den Verdünnungsplatten berechnet werden.

Bakterien sind einfache prokaryotische Organismen, die jedoch in Bezug auf Arten und Ökosysteme sehr vielfältig sind. Actinomyceten sind eine Untergruppe von Bakterien, die aufgrund ihrer fadenförmigen Struktur, in der sie aneinandergereiht zu Hyphen wachsen, häufig als einzigartige Gruppe angesehen werden.

In der Regel machen Actinomyceten 10 % der gesamten Bakterienpopulation im Boden aus. Bakterien und Actinomyceten sind in fast allen Umgebungen der Erde reichlich vorhanden, aber im Boden sind sie in beispielloser Vielfalt und Häufigkeit zu finden.

Bodenbakterien werden gezählt und möglicherweise kultiviert und durch Verdünnungsbeschichtung identifiziert. Dabei wird eine Bodenprobe seriell in Wasser verdünnt und dann auf Agar-Wachstumsplatten dispergiert. Die entstehenden Völker werden dann gezählt. Dieser Wert wird zusammen mit dem Verdünnungsfaktor verwendet, um die Anfangskonzentration von Bakterien im Boden zu klären.

Die Verdünnungsplattierung ist eine gängige, kostengünstige und einfache Methode zur Bakterienzählung, die jedoch unter mehreren Nachteilen leidet. Der Boden sollte sich bei Verdünnungen nicht absetzen, da dies zu einem verzerrten Wachstum führen könnte. Einige Bodenbakterien kultivieren sich nicht auf den Platten oder wachsen zu langsam, um beobachtet zu werden. Darüber hinaus geht diese Methode davon aus, dass Kolonien aus einem einzigen Bakterium gebildet werden, aber auch aus Klumpen mehrerer Zellen entstehen können.

Bestimmte Bakterienarten wachsen besser auf verschiedenen Wachstumsmedien. Ein gängiges Substrat für die Kultivierung einer Vielzahl von Bakterien ist eine Agar-Pepton-Hefeplatte. Actinomyceten wachsen bevorzugt auf Glycerin-Kasein-basierten Platten, die besser für das Wachstum dieser filamentösen Bakterien geeignet sind.

Nachdem Sie nun das Konzept hinter der Bakterienzählung verstanden haben, sehen wir uns an, wie dieser Prozess im Labor durchgeführt wird.

Um den Vorgang zu beginnen, wiegen Sie 10 g Bodenprobe ab und fügen Sie 95 ml deionisiertes Wasser hinzu. Schütteln Sie die Suspension gut und beschriften Sie sie mit "A". Bevor sich der Boden setzt, entfernen Sie 1 mL der Suspension mit einer sterilen Pipette und geben Sie sie in 9 mL deionisiertes Wasser. Vortexen Sie gründlich und beschriften Sie es mit "B".

Wiederholen Sie diesen Verdünnungsschritt 3 Mal, jeweils mit 1 mL der vorherigen Suspension und 9 mL deionisiertem Wasser. Beschriften Sie diese nacheinander als Röhrchen C, D und E. Dies führt zu seriellen Verdünnungen von 10-1 bis 10-5 Gramm Erde pro ml.

Um Bakterienkolonien zu züchten, nehmen Sie 3 vorbereitete Pepton-Hefe-Agar-Platten und beschriften Sie sie als C, D und E. Wirbeln Sie die entsprechenden Proben vor und pipettieren Sie 0,1 ml auf jede Platte. Da KBE pro ml angegeben werden, erhöht die Verwendung von 0,1 ml die Verdünnung um den Faktor zehn.

Tauchen Sie als Nächstes einen Glasstreuer in Ethanol. Legen Sie den Streuer für einige Sekunden in eine Flamme, um das Ethanol zu entzünden und zu verbrennen. Dadurch wird der Streuer sterilisiert.

Halten Sie den Spreizer über die erste Platte, bis die Flamme erloschen ist. Öffnen Sie die Platte schnell und halten Sie den Deckel in die Nähe. Berühren Sie den Streuer mit dem Agar weg vom Inokulum, um abzukühlen, und verteilen Sie dann den Tropfen Inokulum auf der Oberfläche, bis die Spuren der freien Flüssigkeit verschwunden sind. Setzen Sie den Tellerdeckel wieder auf.

Flammen Sie den Streuer erneut an und wiederholen Sie den Vorgang mit der nächsten Platte, wobei Sie schnell arbeiten, um die Platte nicht mit Organismen in der Luft zu kontaminieren. Drehen Sie die Platten um, um zu verhindern, dass Feuchtigkeitstropfen auf den Agar fallen, und inkubieren Sie die Platten eine Woche lang bei Raumtemperatur.

Um Actinomyceten zu züchten, nehmen Sie drei vorgefertigte Glycerin-Kasein-Platten und markieren Sie sie als B, C und D. Unter Verwendung der zuvor gezeigten Techniken verteilen Sie die Platte 0,1 ml von den Suspensionen B, C und D. Die niedrigeren Verdünnungen werden verwendet, da Actinomyceten typischerweise als 1/10 der Bakterienpopulation vorhanden sind.

Zum Schluss diese Platten umdrehen und zwei Wochen bei Raumtemperatur lagern.

Untersuchen Sie nach der Inkubation alle Bakterienplatten sorgfältig und notieren Sie Unterschiede in der Größe und Form der Kolonie. Wenn sie auf Agar gezüchtet werden, produzieren Bakterien schleimige Kolonien, die von farblos bis leuchtend orange, gelb oder rosa reichen. Im Gegensatz dazu sind Actinomyceten-Kolonien kalkhaltig, fest, ledrig und brechen unter Druck, wo andere Bakterienkolonien verschmieren. Dies ermöglicht die Unterscheidung von Bienenvölkern durch Berührung mit einer sterilen Schlaufe.

Zählen und notieren Sie die Anzahl der Bakterienkolonien, einschließlich aller Actinomyceten. Zählen Sie nur Platten mit 30-200 Völkern pro Platte.

Um Kulturen bestimmter einzelner Bakterien zu züchten, wählen Sie diskrete Kolonien aus einer der Platten aus und wählen Sie Kolonien, die gut von benachbarten Kolonien getrennt sind. Sterilisieren Sie eine Spreizschlaufe, öffnen Sie dann die Platte und berühren Sie die Schlaufe zum Abkühlen an eine leere Stelle. Nehmen Sie als Nächstes eine kleine Menge der interessierenden Kolonie in die Schleife.

Nehmen Sie eine frische Pepton-Hefe-Platte und machen Sie auf einer Seite einen einige Zentimeter langen Streifen. Sterilisieren und erneut abkühlen lassen, dann mache einen Streifen, der den ersten Streifen erst beim ersten Durchgang kreuzt. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zweimal auf die gleiche Weise. Diese schlierende "Verdünnung" führt dazu, dass die Zellen auf der Schleife voneinander getrennt werden. Stellen Sie die Platte an einen dunklen Ort, um sie zwei Wochen lang bei Raumtemperatur zu inkubieren.

Aus den Keim- und Actinomyceten-Koloniezahlen können die koloniebildenden Einheiten pro Gramm Boden bestimmt werden. Die Anzahl der Kolonien pro Gramm Boden entspricht der Anzahl der auf der Platte gezählten Kolonien, multipliziert mit dem Kehrwert der verdünnten Platte. Wenn beispielsweise 46 Bienenvölker auf einer Verdünnungsplatte von 10-5 mit einem 0,1-ml-Impfmittel gezählt werden, entspricht die KBE pro Gramm Boden 10-6 x 46 oder 46 Millionen KBE pro Gramm Boden.

Die Durchführung von Bakterienzählungen und -kulturen ist ein wichtiger erster Schritt in vielen wissenschaftlichen Untersuchungen oder Protokollen.

Gesunder Boden enthält zwischen 106 und 108 Bakterien pro Gramm. Die Bakterienzählung des Bodens kann verwendet werden, um die Gesundheit der interessierenden Böden zu bestimmen, und die Keimzahlen von weniger als 106 und 108 Bakterien pro Gramm deuten auf einen ungesunden oder schlechten Boden hin. Dies kann durch einen Mangel an Nährstoffen oder organischer Substanz, abiotischen Stress aufgrund eines extremen pH-Werts des Bodens oder Bodenkontamination verursacht werden.

Viele Arten von Antibiotika, die heute in der Medizin eingesetzt werden, wurden zuerst aus bodenbewohnenden Bakterien oder Pilzen identifiziert. Die Isolierung reiner Stämme aus Bodenkulturen kann Wissenschaftlern dabei helfen, neue Antibiotikaverbindungen zu identifizieren. Hier können Testbakterien oder isolierte Verbindungen von Interesse auf Platten mit Bakterienrasen aufgebracht und deren Auswirkungen auf das Rasenwachstum erfasst werden. Klare Stellen in bakteriellen Rasenflächen, in denen das Wachstum durch die Testbakterien oder -verbindungen gehemmt wurde, können auf eine antibiotische Aktivität hinweisen.

Hülsenfrüchte wie Erbsen und Bohnen sind auf symbiotische Beziehungen mit stickstofffixierenden Bakterien angewiesen. Diese Bakterien leben frei im Boden oder in Knöllchen im Wurzelsystem und produzieren Stickstoffverbindungen, die von der Pflanze verwertet werden. Auf armen Böden kann die Ergänzung von Leguminosen mit kultivierten stickstofffixierenden Bakterien aus den Böden das Wachstum und die Gesundheit der Pflanzen fördern. Dies kann zu größeren, widerstandsfähigeren Pflanzen führen, die wiederum einen höheren Ernteertrag liefern.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Bakterienzählung gesehen. Sie sollten nun verstehen, wie man Verdünnungen von Bodenproben durchführt, wie man Platten für die Koloniezählung und Kolonieisolierung erstellt und wie man die Anzahl der Bakterien in Bodenproben berechnet. Danke fürs Zuschauen!