RNA-Analyse von Umweltproben mittels RT-PCR

Die Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ermöglicht den Nachweis von RNA-Viren und mikrobieller Genexpression in der Umwelt.

Im Gegensatz zu zellulären Organismen vom Menschen bis zu Bakterien, die DNA als genetisches Material verwenden, haben einige Viren Genome aus RNA, darunter viele pathogene Viren wie Grippe, Ebola und HIV. Während einige Viren durch Beobachtung des pathogenen Phänotyps nachgewiesen werden können, der sich entwickelt, wenn Zellen in Zellkulturen infiziert werden, gibt es für die meisten keine kulturbasierten Charakterisierungsmethoden. Die RT-PCR kann verwendet werden, um das Vorhandensein dieser Viren in der Umwelt mit hoher Empfindlichkeit nachzuweisen.

Gleichzeitig "exprimieren" Organismen mit DNA-basierten Genomen die in ihren DNA-Genomen kodierte genetische Information, indem sie sie in Boten- oder "m"-RNA "transkribieren", die dann in Proteine "übersetzt" werden kann, um enzymatische oder strukturelle Funktionen in Zellen zu erfüllen. Da Mikroben auf Veränderungen in der Umwelt reagieren und sich daran anpassen, indem sie verschiedene genetische Signalwege ein- oder ausschalten, kann die RT-PCR zur Überwachung solcher Veränderungen in der Genexpression eingesetzt werden, um als potenzielle Ökosystem-Bewerter zu dienen.

In diesem Video werden die Prinzipien der RT-PCR erläutert, ein verallgemeinertes Verfahren zur Durchführung dieser Technik skizziert und schließlich einige der Möglichkeiten untersucht, wie diese Methode heute in der Umweltmikrobiologie angewendet wird.

Dieses Verfahren besteht aus zwei Hauptteilen: der Extraktion von RNA aus biologischen Proben, gefolgt von ihrer reversen Transkription in DNA.

Bei der Isolierung von RNA werden die Zellen in der Probe durch Zugabe eines Detergens, das Lipide und Proteine abbaut, lysiert, gefolgt von einem mechanischen Aufschluss. Die Extraktion von RNA aus Viren erfordert in der Regel die Zugabe von Proteinasen, bei denen es sich um proteinverdauende Enzyme handelt, um die Kapside der Viren abzubauen - die zähen Proteinhüllen, aus denen die Viruspartikel bestehen. Auf der anderen Seite muss bei der Gewinnung von RNA aus zellulären Organismen das Lysat möglicherweise mit DNA-abbauenden Enzymen oder DNAasen behandelt werden, um zu vermeiden, dass nachgelagerte Ergebnisse durch das Vorhandensein der chemisch ähnlichen DNA verfälscht werden.

RNA kann dann auf zwei Arten aus Lysaten aufgereinigt werden. Bei einer Methode, die als saure Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion bekannt ist, wird das Lysat mit einem organisch-wässrigen Gemisch vermischt, das dann zentrifugiert wird, um die Phasen zu trennen. Proteine werden in die organische Phase aufgeteilt, lysierte Zelltrümmer in die trübe Zwischenphase und Nukleinsäuren in die wässrige Phase. Die obere wässrige Phase kann dann aufgefangen werden, und die RNA wird durch Zugabe von Alkohol wie Isopropanol gefällt, wodurch die Löslichkeit der Nukleinsäure in Wasser verringert wird.

Bei der säulenbasierten RNA-Isolierung wird das Lysat mit Alkohol gemischt und dann mit einem negativ geladenen Harz, wie z. B. Siliziumdioxid, durch eine Gelfiltrationssäule geleitet. Das Lysat wird so hergestellt, dass positiv geladene Ionen im Puffer "Salzbrücken" bilden, die es dem negativ geladenen Phosphatrückgrat der Nukleinsäuren ermöglichen, an das Harz zu binden. Alle anderen Verunreinigungen werden dann weggespült. Die Nukleinsäuren werden mit einem salzarmen Puffer oder Wasser aus der Säule "eluiert". Da einzelsträngige RNA weniger negative Ladungen aufweist als doppelsträngige DNA, kann sie bevorzugt mit Puffern bestimmter Konzentrationen eluiert werden.

Nach der Isolierung wird die RNA in die chemisch stabilere DNA umgewandelt. Wissenschaftler haben sich ein Enzym zunutze gemacht, das auf natürliche Weise von Retroviren wie HIV kodiert wird. Dieses Enzym ist als reverse Transkriptase oder "RT" bekannt.

RT synthetisiert komplementäre oder "c"-DNA aus einem kurzen Abschnitt von Nukleotiden, der als Primer bekannt ist. Dieser Primer kann je nach Zweck des Experiments unterschiedliche Sequenzen haben. Zum Beispiel kann der Primer so gestaltet sein, dass er eine bestimmte Sequenz hat, um bestimmte Gene oder Organismen zu erkennen. Nach der Synthese kann diese cDNA des "ersten Strangs" durch reguläre PCR amplifiziert werden.

Nachdem wir nun die Prinzipien der RT-PCR verstanden haben, schauen wir uns ein Protokoll für die Durchführung dieser Technik an RNA-Proben an, die aus der Umwelt entnommen wurden.

Um mit dem Vorgang zu beginnen, suchen Sie anhand von GPS-Koordinaten oder Visier einen Ort für die Probenentnahme. Wählen Sie zufällige Punkte innerhalb eines Gebiets, um einen allgemeinen Überblick über mikrobielle Lebensräume zu erhalten.

Um die feste Probe zu sammeln, schieben und drehen Sie eine Handschnecke bis zur vorgegebenen Tiefe in den Boden. Wenn die Schnecke angehoben wird, befindet sich Erde im hohlen Schaft der Schnecke.

Diese Erde wird direkt in einen Erdauffangsack geschabt und der Sack wird mit dem Ort, dem Namen, dem Datum, der Uhrzeit der Sammlung und allen anderen notwendigen Informationen beschriftet.

Bringen Sie den Boden ins Labor und passieren Sie den Boden durch ein 2-mm-Sieb, um Kies und Gestein zu entfernen. Analysieren Sie eine Probe des Bodens auf ihren Feuchtigkeitsgehalt, der Aufschluss über den Grad der mikrobiellen Aktivität im Boden geben kann. Beziehen Sie sich dazu auf das Video "Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts des Bodens" in dieser Sammlung.

Wählen Sie für die Entnahme von Wasserproben einen interessanten Ort, der der Bodenentnahme ähnelt, und sammeln Sie Wasser in einer sterilen, dickwandigen Plastikflasche. Achten Sie auf die Menge des gesammelten Wassers. Testen Sie das Wasser sofort auf Parameter wie Temperatur, pH-Wert und Salzgehalt, die wichtige Informationen über die zu erwartenden mikrobiellen Werte in der Probe liefern können. Stellen Sie dann die Flasche in den Kühler und bringen Sie sie ins Labor.

Mikroorganismen wie Viren werden aus der Umweltprobe gesammelt und konzentriert.

RNA kann aus den gesammelten Viren durch die Spin-Column-Methode unter Verwendung kommerzieller RNA-Extraktionskits gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert werden. Zuerst wird Lysepuffer, ergänzt mit Ethanol, mit der Probe vermischt. Legen Sie die entsprechende Anzahl von Spin-Säulen in Sammelröhrchen und tragen Sie dann die Proben auf die Säulenmatrix auf. Zentrifugieren Sie die Säulen bei ca. 12.000 x g für 1-2 Minuten, damit die Nukleinsäuren an die Säule binden können, und verwerfen Sie den Flüssigkeitsdurchfluss.

Geben Sie Waschpuffer in die Säulen und zentrifugieren Sie erneut. Setzen Sie die Säulen in neue, sterile 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen mit geringer Adhäsion ein. Geben Sie dann Wasser in die Säulen, das frei von RNasen ist, bei denen es sich um Enzyme handelt, die RNA abbauen, und zentrifugieren Sie 30 s lang, um die RNA zu eluieren. Die eluierte RNA kann bei -80 ? C bis zum Gebrauch.

Vor dem Versuch sollten geeignete Primer entworfen werden, um die interessierenden Sequenzen zu detektieren, die als Marker für das Vorhandensein spezifischer Mikroorganismen dienen können.

Nehmen Sie die RT-Reagenzien heraus, die bei -20 ? C und tauen Sie die gefrorenen Reagenzien auf Eis (oder bei Raumtemperatur) auf. Dazu gehören Nukleotide, Reverse-Transkriptionspuffer und Primer. Bewahren Sie die Reagenzien nach dem Auftauen auf Eis auf; Das Reverse-Transkriptase-Enzym und der RNase-Hemmer sollten immer auf Eis gelegt werden.

Während die Reagenzien auftauen, berechnen Sie die Volumina und Konzentrationen der Komponenten der Reaktion. Sobald die Reagenzien aufgetaut sind, wirbeln und drehen Sie jedes Röhrchen vorsichtig, um sicherzustellen, dass der Inhalt gut vermischt ist.

Um eine Kontamination zu vermeiden, arbeiten Sie in einer Laminar-Flow-Haube und fügen Sie die Komponenten in einem Mastermix zusammen, der jedem PCR-Röhrchen hinzugefügt wird. Wenn Sie den Mastermix in ein Eppendorf-Röhrchen einbauen, achten Sie darauf, die Pipettenspitzen zwischen den einzelnen Reagen zu wechseln, um eine Kontamination zu vermeiden. Nachdem alle Reagenzien in das Eppendorf-Röhrchen gegeben wurden, wirbeln Sie das Mastermix-Röhrchen vorsichtig durch und schleudern Sie es hinunter, um eine homogene Mischung zu gewährleisten.

Beschriften Sie einen Satz PCR-Röhrchen und stellen Sie sicher, dass Sie Kontrollen enthalten. Aliquotieren Sie ein gleiches Volumen des Mastermixes in jede Röhre. Fügen Sie dann reaktionsspezifische Komponenten hinzu, wie z. B. die RNA-Extrakte oder Wasser für die Negativkontrolle.

Sobald alle Komponenten hinzugefügt wurden, legen Sie die Röhrchen in einen Thermocycler und stellen Sie das Reverse-Transkriptionsprogramm auf Laufen. Die cDNA kann dann einer PCR-Amplifikation unterzogen werden. Eine detaillierte Beschreibung dieses Schritts finden Sie im Video dieser Sammlung zum Thema PCR.

Wenn die PCR abgeschlossen ist, kann ein Teil des PCR-Produkts abgetrennt und auf einem Agarosegel visualisiert werden. So wurde hier beispielsweise ein genspezifischer Primer verwendet, um das Vorhandensein eines RNA-Virus nachzuweisen. Banden der erwarteten Größe werden aus der RT-PCR-Reaktion, aber nicht aus den Negativkontrollen erhalten, was auf das Vorhandensein dieses Virus in der zu testenden Wasserprobe hinweist.

Die Identifizierung von RNA-basierten Mikroorganismen mittels RT-PCR ermöglicht die Analyse der ökologischen Gesundheit, der Umweltrisiken und der Erhaltung der Artenvielfalt.

Der Einsatz von Mikroorganismen zur Reinigung von Kohlenwasserstoffen und Lösungsmitteln aus verschmutzten Böden und Gewässern stellt eine ökologisch nachhaltige Sanierungsalternative dar. Das Verständnis der nativen mikrobiellen Genexpression kann spezifische mikrobielle Signalwege aufzeigen, die Kontaminanten unter diesen Bedingungen abbauen. Die RT-PCR wird häufig verwendet, um mRNA aus solchen Umweltproben zu amplifizieren.

Maßnahmen im Bereich der öffentlichen Gesundheit erfordern häufig eine rasche Überwachung von Virusinfektionsquellen in der Umwelt. Die Vogelgrippe zum Beispiel ist hochinfektiös und kann sich schnell auf Geflügel, Nutztiere und sogar Menschen ausbreiten. In diesem speziellen Beispiel suchten die Forscher nach der Bedrohung durch die Vogelgrippe, die durch Wildvögel übertragen wird.

Mit einem tragbaren RT-PCR-Aufbau und -Gerät untersuchten sie eine Reihe von Wildvögeln, auch in abgelegenen Gebieten, um Infektionen frühzeitig zu erkennen und eine Übertragung zu verhindern.

Schließlich kann die RT-PCR zur Charakterisierung von "Biopestiziden" verwendet werden, die entwickelt werden, um Schädlinge wie den Glasflügel-Scharfschützen Homalodisca vitripennis zu bekämpfen, den Wirt einer Krankheit, die Weinreben in Nordamerika schwer schädigt. Ein neuartiges einzelsträngiges RNA-Virus wird entwickelt, um dieses Insekt zu infizieren. Mit einer Kombination aus Homalodica-Zellkultur und RT-PCR-Bestätigung der Viruslast konnten diese Autoren eine hohe Viruskonzentration für die Verwendung als biologisches Kontrollmittel vermehren.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Analyse von RNA-basierten Umweltorganismen mittels RT-PCR gesehen. Sie sollten nun die Theorie hinter dem Protokoll verstehen, wie Sie die Technik auf Ihre Forschung anwenden können und wie sie heute in der Praxis eingesetzt wird. Danke fürs Zuschauen!