Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

(1) macht der mobilen Phase

1. Bereiten Sie die mobile Phase von ca. 1,5 L Trinkwasser DI 400 mL Acetonitril hinzufügen.
2. 2,4 mL Eisessig sorgfältig diese Projektmappe hinzufügen.
3. Verdünnen Sie die Lösung für ein Gesamtvolumen von 2,0 L in einem volumetrischen Kolben mit gereinigtem DI Wasser. Die resultierende Lösung sollte einen pH-Wert zwischen 2,8 bis 3.2 aufweisen.
4. Stellen Sie den pH-Wert auf 4.2 durch Zugabe von 40 % Natronlauge tropfenweise mit dem Einsatz von einem kalibrierten digital pH-Meter. Fügen Sie sehr langsam, sobald der pH-Wert 4.0 erreicht. Dies dauert rund 50 Tropfen zu erreichen.
5. Filtern Sie die mobile Phase durch ein 0,47-µm-Nylon 66-Membranfilter unter Vakuum um die Lösung zu entgasen und Feststoffe zu entfernen, die die chromatographische Säule stecken könnte. Es ist wichtig zu entgasen die mobile Phase zu vermeiden, dass eine Blase, die entweder eine Lücke in der stationären Phase am Einlass der Spalte verursachen oder Arbeit ihren Weg in der Detektorzelle verursacht Instabilität mit der UV-Absorption.

2. erstellen die Komponentenlösungen

Die drei Komponenten, die getroffen werden müssen sind Koffein (0,8 mg/mL), Kalium-Benzoat (1,4 mg/mL) und Aspartam (L-Aspartyl-L-Phenylalanin Methylester) (6,0 mg/mL). Diese Konzentrationen verdünnt einmal in der gleichen Weise setzen die Standards auf den Ebenen in den Soda-Proben gefunden.

1. Eine volumetrische 500-mL-Flasche 0,40 g Koffein hinzufügen, dann auf die 500-mL-Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen.
2. Eine volumetrische 500-mL-Flasche 0,70 g Natriumbenzoat hinzufügen, dann auf die 500-mL-Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen.
3. Eine volumetrische 100 mL-Flasche 0,60 g von Aspartam hinzufügen, dann auf den 100-mL-Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen. Legen Sie diese Lösung in einem Kühlschrank, Zersetzung während der Lagerung zu vermeiden.

3. machen die 7 Standard-Lösungen

Alle drei Komponenten haben unterschiedliche Verteilung Koeffizienten, die beeinflusst, wie jeder mit den beiden Phasen interagiert. Je größer der Verteilung Koeffizient, desto mehr Zeit verbringt die Komponente in der stationären Phase, was zu längerer Verweildauer in den Detektor erreichen Zeiten.

1. Nach der Tabelle in Tabelle 1, pipettieren die korrekte Menge der einzelnen Komponenten in eine volumetrische 50-mL-Flasche.
2. Verdünnen Sie die Stammlösungen, die 50-mL-Markierung auf die volumetrische Fläschchen mit mobilen Phase.
3. Gießen Sie jede standard-Lösung in beschrifteten kleinen Fläschchen in einem Probenrack.
4. Die Regale von Proben im Kühlschrank, zusammen mit den restlichen Lösungen in die volumetrische 50-mL-Fläschchen aufbewahren.

4. überprüfen die Grundeinstellungen der HPLC-Anlage

1. Bestätigen Sie, dass die Abwasserlinie in einem Abfallbehälter und ist nicht wieder in der mobilen Phase recycling.
2. Stellen Sie sicher, dass die Durchflussmenge der mobilen Phase auf 0,5 mL/min eingestellt ist. Dies ist hoch genug, um ermöglichen allen Gipfeln eluieren innerhalb von 5 min und langsam genug, um schöne Auflösung zu ermöglichen.
3. Stellen Sie sicher, dass die minimalen und maximalen Druck und die Durchflussmenge auf die korrekten Werte auf der Vorderseite der Lösungsmittel Delivery Systems (die Pumpe) festgelegt sind.
   1. Minimale Druckeinstellung: 250 Psi (Dies ist die Pumpe abgeschaltet, wenn ein Leck auftritt).
   2. Maximale Druckeinstellung: 4.000 Psi (Dies ist zum Schutz der Pumpe vor dem brechen, wenn ein Clog bildet).
4. Drücken Sie "Null" auf den Detektor Frontplatte um die Leerzeichen gesetzt (die leere ist die reine mobile Phase).
5. Spülen einer 100 µL Spritze mit entionisiertem Wasser, dann mit mehreren Bänden eines Arbeitsstandards werden analysiert, und füllen die Spritze mit der Lösung. Beginnen Sie mit 3 Einkomponenten-Proben, wodurch für die Ermittlung der Höhepunkt jeder Komponente von Interesse.

5. manuell Einspritzen der Probe und Datenerhebung

1. Injizieren Sie mit dem Injektor Griff in Ladeposition langsam 100 µL der Lösung durch das Septum Port.
2. Überprüfen Sie, ob Datenbeschaffungsprogramm ist für die Datensammlung für 300 s, die genügend für alle 3 Gipfel Zeit, durch den Detektor eluieren.
3. Wenn Sie bereit zum Starten der Testversion, drehen Sie den Injektor Griff in die Spritzen-Position (die Probe in der mobilen Phase injiziert) und klicken Sie auf "Test starten" auf dem Computer Datenbeschaffungsprogramm sofort. Erscheinen Sie für Standards 1-3, nur einer der drei sequenziellen Gipfel auf dem Bildschirm während des Laufs (Abbildung 1).
4. Einmal 300 s vergangen, die Datenerhebung sendet eine Aufforderung zum Speichern der Datei. Sichern Sie die Daten unter einem passenden Dateinamen (z. B.STD #1).
5. Beachten Sie die Zeit in Sekunden für die Peak von jeder Studie, die bei der Ermittlung dieser Komponente verwendet wird.
6. Ziehen Sie die Spritze aus dem Septum, und wiederholen Sie den Vorgang für jede der verbleibenden Arbeitsstandards, mit der gleichen Zeit pro Chromatogramm wie aus dem ersten Lauf ermittelt.

Abbildung 1: Das Chromatogramm der 3 Komponenten. Von links nach rechts sind sie Koffein, Aspartam und Natriumbenzoat.

(6) die Proben der Diät Limonaden

Diet Coke, Diet Pepsi und Coke Zero sind die "unbekannten". Sie haben in offenen Behältern über Nacht get rid of die Kohlensäure ausgelassen worden wie Luftblasen nicht gut für die HPLC-Anlage sind. Dies beseitigt ausreichend keine Gase in den Proben.

1. Ziehen Sie etwa 2 mL die Diätsoda in einer Kunststoffspritze.
2. Legen Sie die Filterspitze auf die Spritze über Luer-Lok durch Drehen an Ort.
3. Drücken Sie die Flüssigkeit in der Spritze durch den Filter und in ein kleines Glas-Fläschchen. Dies beseitigt unerwünschte Partikel, die potenziell die Trennsäule verstopfen könnten.
4. Jede Probe mit einer gleichen Menge von VE-Wasser zu verdünnen, so sind sie bei 50 % Reinheit.
5. Injizieren Sie 100 µL der Probe in die Probenschleife, und laufen Sie Studien mit den gleichen Parametern wie die Standards.

(7) Berechnungen

1. Berechnen Sie von den Konzentrationen der Komponentenlösungen die Konzentration aller Komponenten in den Standards, basierend auf die Verdünnungen, die für die 7 Proben vorgenommen wurden.
2. Bestimmen Sie Peakflächen auf die Chromatogramme für jeden Standard und der unbekannten Proben durch die dreieckigen Methode, die Höhe Spitzenzeiten die Breite auf ½ Höhe (Abbildung 2 entspricht). Treten Sie nach der Festlegung, welchen Gipfel entspricht jede Komponente basiert auf den Zeitaufwand für die einzelnen Komponenten zu ihren jeweiligen Höhepunkt zeigen diese Peakflächen in einem Tabellenkalkulationsprogramm auf dem Computer.
3. Kalibrierkurven von Peak vs. Konzentration (mg/L) in den Normen für alle drei Komponenten zu erstellen.
4. Bestimmen der kleinsten Quadrate für jede Kalibrierungskurve passen.
5. Berechnen Sie die Konzentration der einzelnen Komponenten in der Diät-Limonaden aus der Peakflächen der HPLC-Studien für die Beispiele gezeigt. Denken Sie daran, dass die Diät-Cola, um den Faktor 2 vor dem Einspritzen in das HPLC-System verdünnt wurde.
6. Berechnen Sie die Menge in mg/L, der einzelnen Komponenten in der Diät-Limonaden.
7. Basierend auf den Ergebnissen, berechnen Sie die Milligramm der einzelnen Komponenten in der 12-Unze-Dose Soda gefunden. 12 Unzen = 354,9 mL zu übernehmen.

Abbildung 2. Ein einfaches Beispiel für einer Kurve Peakhöhe und Breite, die multipliziert werden sollen (Peakhöhe x Breite in ½ Höhe).