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Die Verseifung ist eine Technik, die häufig verwendet wird, um Fettsäuremethylester aus einem komplexen organischen Gemisch zu entfernen.
Komplexe organische Proben werden häufig mittels Gaschromatographie analysiert, mit der die relativen Konzentrationen einzelner Komponenten bestimmt werden.
Verbindungen, die in Größe und Struktur ähnlich sind, können jedoch vom Instrument nicht unterschieden werden, was die Ergebnisse verzerrt. Daher müssen unerwünschte Verbindungen, die überlappende Signale erzeugen, entfernt werden, um genaue Ergebnisse zu erhalten.
Dieses Video behandelt die Verwendung der Verseifung zur Reinigung von Alkenonen für die Paläoklimatologie. Es ist die erste in einer Reihe, in der die Aufreinigung komplexer Biomarker-Proben detailliert beschrieben wird. Es wird das Verfahren sowie einige andere Anwendungen der Technik behandelt.
Es hat sich gezeigt, dass mehrfach ungesättigte langkettige Alkylketone, sogenannte Alkenone, nützliche Informationen über die vergangene Meeresoberflächentemperatur liefern.
Die Organismen, die Alkenone produzieren, bilden jedoch häufig Fettsäuremethylester, die in Größe und chemischer Struktur ähnlich sind, sogenannte Alkenoate. Aufgrund dieser Ähnlichkeiten müssen Alkenoate entfernt werden, bevor eine genaue Analyse durchgeführt werden kann.
Die Verseifung ist eine gängige Technik, um die Co-Elution dieser Moleküle zu verhindern. Bei der Verseifung wird Wasser verwendet, um die molekulare Bindung eines Esters zu spalten. Eine Base wird an den Kohlenstoff im Herzen des Alkenoats gebunden. Durch diese Additionsreaktion entsteht ein instabiles Zwischenprodukt, und das Alkoxid wird ausgestoßen.
Der Wasserstoff aus der neu gebildeten Säure bewegt sich zu dem ausgestoßenen Alkoxid, und das resultierende Carboxylatanion bildet eine ionische Bindung mit dem Kation aus der Base. Das Ergebnis ist ein Alkohol- und ein Fettsäuresalz. Durch die Zugabe einer starken Säure wird die Carbonsäure regeneriert. Zu diesem Zeitpunkt wurde das beleidigende Alkenoat in eine Form umgewandelt, die nicht mehr mit dem interessierenden Alkenon koeluiert.
Jetzt, da Sie verstanden haben, wie die Verseifung zur Reinigung einer organischen Mischung verwendet werden kann, können Sie mit dem Verfahren beginnen.
Erwerben Sie zunächst einen getrockneten Gesamtlipidextrakt - oder TLE -, der mit einer Lösungsmittelextraktionsmethode gewonnen wurde. Bereiten Sie als Nächstes die Verseifungslösungen vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Stellen Sie sicher, dass alle Komponenten rein und frei von Kohlenwasserstoffen sind. Sobald die Lösungen hergestellt sind, geben Sie das getrocknete TLE in ein 60-ml-Durchstechflasche aus Borosilikatglas. Fügen Sie 2 ml 2 normales Kaliumhydroxid hinzu und verschließen Sie die Durchstechflasche. Erhitzen Sie anschließend das Fläschchen auf 60 ? C für 2,5 h zur Spaltung der Esterbindung. Wenn dies abgeschlossen ist, lassen Sie die Probe auf Raumtemperatur abkühlen. Sobald die Probe abgekühlt ist, geben Sie 2 ml 5%ige Natriumchloridlösung in das Fläschchen. Verschließen Sie das Fläschchen und schütteln Sie es kurz. 6 N Salzsäure tropfenweise zugeben, bis ein pH-Wert von 2 erreicht ist - mit pH-Papier testen. Durch die Zugabe dieser Säure wird das Carboxylatanion protoniert, um das Endprodukt - die stabile Carbonsäure - zu bilden.
Jetzt, da die angesäuerte Lösung esterfrei ist, fügen Sie 5 ml Hexan hinzu. Den Deckel verschließen und 5 Sekunden lang kräftig schütteln, um die organischen Verbindungen aus dem Wasser zu extrahieren. Lassen Sie die Lösung ruhen, bis sich die organische und die wässrige Phase vollständig voneinander trennen. Salze, Ionen und nicht umgesetzte Salzsäure verbleiben in der wässrigen Phase, während sich organische Verbindungen in das Hexan aufspalten. Sobald sich die Phasen vollständig getrennt haben, entfernen Sie mit einer Pipette etwa 75 % des Hexans und geben Sie es in ein weiteres 40-ml-Fläschchen. Wiederholen Sie diesen Extraktionsvorgang zwei weitere Male und fügen Sie jedes Mal 5 ml Hexan hinzu. Sobald dies abgeschlossen ist, entsorgen Sie die übrig gebliebene wässrige Lösung in einen geeigneten Abfallbehälter. Beschriften Sie das Fläschchen mit der frisch verseiften organischen Phase. Die erzeugten Carbonsäuren können nicht ohne weitere Reinigung in die für die Alkenonanalyse üblichen Instrumente injiziert werden. Carbonsäuren, die in einen Gaschromatographen injiziert werden, sammeln sich schnell an und ruinieren Einlässe, Einlassauskleidungen und das vordere Ende der Säulen. Um diese Säuren zu entfernen, muss die Probe zunächst einer weiteren Aufreinigungstechnik unterzogen werden: der Trennung mittels Säulenchromatographie.
Die Verseifung hat mehrere Anwendungen bei der Extraktion und Reinigung organischer Moleküle.
Durch die Verseifung können nicht nur Biomarker getrennt werden, sondern auch einzelne Bestandteile für den Einsatz in kommerziellen Produkten extrahiert werden. In diesem Beispiel werden Verbindungen aus dem Tabakbaum -? Nicotiana glauca wurden isoliert und analysiert, um ihr Potenzial als Rohstoff für eine Vielzahl von biobasierten Produkten wie Kraftstoff, Wärme und eine Reihe chemischer Verbindungen zu untersuchen.
Die Blätter wurden zuerst homogenisiert und dann zentrifugiert, um die interessierenden Moleküle zu konzentrieren. Anschließend wurde das konzentrierte Pflanzenmaterial verseift. Das extrahierte Material wurde mit Hilfe von Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie analysiert, um die Konzentration von Tocopherol zu bestimmen - einer Familie von Vitamin-E-Verbindungen, die typischerweise in Pflanzen vorkommen.
Das extrahierte Material kann auch in vitro in seiner ursprünglichen Zusammensetzung rekonstituiert werden. In diesem Beispiel wurde die Verseifung verwendet, um Carotinoide aus Spinatpflanzen zu extrahieren, die später in vitro rekonstituiert werden sollten. Der Spinat wurde zuerst homogenisiert und dann zentrifugiert, um die Pigmentmoleküle zu ernten. Diese Moleküle wurden dann in einer Lösung von Kaliumhydroxid in einem Scheidetrichter suspendiert, wodurch die Verseifung eingeleitet wurde. Die verseiften Carotinoide trennten sich in eine Ätherschicht, die aufgefangen und getrocknet wurde. Unter Verwendung einer Reihe von Lösungspuffern wurden die Carotinoide - und andere Pigmentmoleküle - später in vitro rekonstituiert. Diese Reinigung ermöglichte die Analyse dieser Pigmente ohne die Interferenz von ähnlich strukturierten organischen Verbindungen.
Aufgrund ihrer Fähigkeit, Ester zu hydrolysieren, kann die Verseifung genutzt werden, um Verbindungen zu "befreien", die sonst an Makromoleküle gebunden sind. In diesem Beispiel wird ein wasserfreier Verseifungsschritt verwendet, um Ethyl-4-fluorbenzoat in das Carbonsäuresalz von Kalium4-fluorbenzoat umzuwandeln. Diese Entschützung durch Verseifung ermöglicht die Herstellung von rohem SFB - eine Reaktion, die nicht möglich wäre, wenn das Molekül "stecken geblieben" wäre.
Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Reinigung von Uk'37-Proben durch Verseifung gesehen. Sie sollten nun verstehen, wie die Verseifung funktioniert und wie Sie sie zur Reinigung von Alkenonen in einem Gesamtlipidextrakt verwenden können. Weitere Reinigungsprozesse werden in nachfolgenden Videos demonstriert.
Danke fürs Zuschauen!
