Umwandlung von Fettsäuremethylestern durch Verseifung für die U^k'₃₇-Paläothermometrie

Conversion of Fatty Acid Methyl Esters by Saponification for U<sup>k’</sup><sub>37</sub> Paleothermometry

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Conversion of Fatty Acid Methyl Esters by Saponification for U^k’₃₇ Paleothermometry

3.8: An Overview of bGDGT Biomarker Analysis for Paleoclimatology

3.14: Purification of a Total Lipid Extract with Column Chromatography

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08:28 min

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February 27, 2015

Overview

Quelle: Labor von Jeff Salacup – University of Massachusetts Amherst

Das Produkt ein Bio solvent-Extraktion, eine totale Lipid-Extrakt (TLE), ist oft eine komplexe Mischung von Hunderten, wenn nicht Tausende von verschiedenen Verbindungen. Der Forscher ist oft nur eine Handvoll Verbindungen interessiert oder bei Interesse an vielen, müssen möglicherweise unerwünschte Bestandteile zu entfernen, die “im Weg” sind oder Co eluierenden. Beispielsweise werden die Konzentrationen der einzelnen Substanzen in einer Probe oft auf einen Gaschromatographen, gekoppelt an eine Flamme ionisierende Detektor (GC-FID) bestimmt, da die Beziehung zwischen FID Reaktion (in pA) und die Menge der Verbindung in einer Probe (z.B. ng/µL) sowohl lineare als auch empfindlich ist. Der GC-Teil des Instruments trennt verschiedene Verbindungen in einer Probe, basierend auf ihren Siedepunkt, chemische Struktur und Affinität zu einer festen Phase, die je nach Anwendung ändern können. Das Ergebnis ist ein Chromatogramm (Abb.Ure 1) zeigt die Trennung der verschiedenen chemischen Bestandteile in Zeit als auch die relative Konzentration (berechnet als die Fläche unter der Kurve). Aber elutes manchmal mehr als eine Verbindung aus dem GC zu einem Zeitpunkt (Abb.Ure 1). Probereinigung ist in diesem Fall erforderlich, bevor Verbindungen sicher quantifiziert werden können.

Abbildung 1. Ein Chromatogramm zeigt die Trennung der verschiedenen chemischen Bestandteile über Zeit und ihre relative Konzentration (Fläche unter der Kurve). Co Medikamentenfreisetzende und getrennte Peaks werden angezeigt.

Principles

FAMEs (Fettsäure-Methylester) sind wichtige Bestandteile der terrestrischen und marinen Mikroben und sind häufig benutzt, in Verbindung mit genetische Techniken, mikrobielle Vielfalt der Ökosysteme in Antike und moderne Systeme beschreiben. Das Vorhandensein von FAMEs in einer Probe ist jedoch nicht immer hilfreich. Aufgrund ihrer ähnlichen Größe und Chemie eluieren Co FAMEs genannt Alkenonatescommonly mit langkettige Alkyl-Ketonen, genannt Alkenone (Abbildung 2). Die Verteilung der Alkenone in einer Probe bezieht sich Informationen zur Temperatur der Meeresoberfläche auf Zeit und/oder den Ort, dass die Probe entnommen wurde, und deren genaue und präzise Charakterisierung ist wichtig.

Verseifung ist eine häufige Reinigung Technik, FAMEs in Fettsäuren, so verändern ihre chemischen Eigenschaften genug zu entfernen aus Co Elution mit Alkenone (Abbildung 3) umgewandelt. Saponificationis eine Form der Hydrolyse. In Hydrolyse wird Wasser verwendet, um Moleküle gespalten. Verseifung ist eine Hydrolyse, die in der Gegenwart eine Basis, wie z. B. Kalilauge (KOH) beschleunigt wird. KOH löst sich in K⁺ und OH^–im Wasser. Die Hydroxid-Anion (OH^–, negativ geladene Ionen) verleiht dem leicht, positiv geladenen tertiären Kohlenstoffatom das Herzstück des Ruhmes (Abbildung 3, oben). Aber diese chemischen Konfiguration ist instabil, (Kohlenstoff hat zu viele andere Atome verbunden) und die Dehydrierung (ROH^–) ist ausgeschlossen. Aber die H Basis konjugiert Vertreibung bildet schnell bewegt sich die Dehydrierung Alkohol Methanol und Fettsäure-Kaliumsalz (Abbildung 3, Mitte) zu bilden. An dieser Stelle wurde die beanstandete FAME (Alkenoate), eine Chemikalie umgewandelt, die nicht mehr mit ihm zusammen elutes. Allerdings will man auch FAME Chemie analysieren, können sie zurückgefordert werden durch die Zugabe von Säure (HCl) zur Lösung, bis pH ~ 2 erreicht. Bei diesem pH-Wert ist das Kaliumsalz der Fettsäure aufgeteilt, um eine Carbonsäure und ionische Salz (KCl; bilden Abbildung 3, unten).

Abbildung 2 . Die chemischen Strukturen von einer Alkenone mit 37 Kohlenstoffatomen und 2 Doppelbindungen (oben) und die damit verbundenen alkenoate Ruhm (unten).

Abbildung 3 . Eine schematische Darstellung der Verseifung von Palmitinsäure mit Kalilauge (KOH) zu einer erhöhten Rate von Hydrolyse (http://www.mpbio.com/).

Verseifung ist eine Technik, die häufig verwendet, um die Fettsäure-Methylester aus einer komplexen organischen Mischung zu entfernen.

Komplexe organischen Proben sind oft durch Gaschromatographie analysiert, die verwendet wird, um die relativen Konzentrationen einzelner Komponenten bestimmen.

Jedoch können Verbindungen, die ähnlich in Größe und Struktur des Instruments, neigen die Ergebnisse unterschieden werden. Daher müssen unerwünschte Verbindungen, die überlappende Signale erzeugen entfernt werden, um genaue Ergebnisse zu erhalten.

Dieses Video enthält die Verwendung von Verseifung Alkenone für Paläoklimatologie zu reinigen. Es ist das erste in einer Serie über die Reinigung von komplexen Biomarker Proben. Das Verfahren, wie auch einige andere Verwendungen der Technik abgedeckt werden.

Mehrfach ungesättigten langkettigen Alkyl Ketone, genannt Alkenone, wurden gezeigt, um nützliche Informationen über vergangene Meeresoberflächentemperatur.

Jedoch erstellen die Organismen, die häufig Alkenone produzieren Fettsäure Methylester, die ähnlich in Größe und chemische Struktur, genannt Alkenoates. Wegen dieser Ähnlichkeiten müssen Alkenoates entfernt werden, bevor eine genaue Analyse erreicht werden kann.

Verseifung ist eine verbreitete Methode, Co Elution dieser Moleküle zu verhindern. Verseifung nutzt Wasser um die molekulare Bindung eines Esters zu teilen. Eine Basis misst der Kohlenstoff das Herzstück der Alkenoate. Diese Additionsreaktion entsteht ein instabiles Zwischenprodukt, und die Dehydrierung ist ausgeschlossen.

Wasserstoff aus der neu gebildeten Säure bewegt sich um die Vertriebenen Dehydrierung und der daraus resultierenden Carboxylat-Anion bildet eine ionische Bindung mit dem kation von der Basis. Das Ergebnis ist ein Alkohol und eine Fettsäure-Salz. Hinzufügen einer starken Säure wird die Carbonsäure neu generieren. An dieser Stelle hat der säumige Alkenoate in eine Form umgewandelt worden, die nicht mehr mit der Alkenone Interesse Co elutes.

Nun, Sie wissen, wie Verseifung verwendet werden kann, um eine organische Mischung zu reinigen, sind Sie bereit, das Verfahren zu beginnen.

Zunächst erwerben Sie eine getrocknete insgesamt Lipid-Extrakt- oder TLE -, die mit einer solvent-Extraktion-Methode abgerufen wurde. Als nächstes bereiten Sie die Verseifung Lösungen wie im Text Protokoll beschrieben. Stellen Sie sicher, dass alle Komponenten rein und frei von Kohlenwasserstoffen sind. Sobald die Lösungen vorbereitet sind, fügen Sie die getrockneten TLE zu einem Borosilikatglas 60-mL-Fläschchen. Fügen Sie 2 mL 2 normale Kaliumhydroxid und versiegeln Sie das Fläschchen zu. Als nächstes erhitzen Sie das Fläschchen auf 60 ° C für 2,5 h bis die Esterbindung Spalten. Wenn dieser Vorgang abgeschlossen ist, lassen Sie die Probe auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Sobald die Probe abgekühlt ist, das Fläschchen mit fügen Sie 2 mL 5 % Natriumchlorid-Lösung hinzu. Kappe der Flasche und schütteln Sie kurz. Fügen Sie 6 N Salzsäure tropfenweise hinzu, bis ein pH-Wert von 2 mit pH-Papier erreicht ist um zu testen -. Die Zugabe dieser Säure wird Protonate die Carboxylat-Anion, das Endprodukt – der stabile Carbonsäure zu bilden.

Nun, da die gesäuerte Lösung Ester-frei ist, fügen Sie 5 mL Hexan. Verschließen Sie und schütteln Sie kräftig für 5 Sekunden um die organischen Verbindungen aus dem Wasser zu extrahieren. Lassen Sie die Lösung zu ruhen, bis die organischen und wässrigen Phasen völlig zu trennen. Salze, Ionen und nicht umgesetztes Salzsäure verbleibt in der wässrigen Phase, während organische Verbindungen in das Hexan getrennt werden. Sobald die Phasen völlig getrennt haben, etwa 75 % der das Hexan mit einer Pipette entfernen und in einem anderen 40-mL-Fläschchen zu verzichten. Wiederholen Sie diese Extraktion zusätzliche Zeiten, 5 mL Hexan jedes Mal hinzufügen. Sobald dies abgeschlossen ist, entsorgen Sie die übrig gebliebenen wässrige Lösung in einen richtigen Abfallbehälter. Beschriften Sie das Fläschchen mit der frisch saponified organischen Phase. Die Karboxylhaltige Säuren produziert kann nicht in die häufig Alkenone Analyse ohne weitere Reinigung verwendeten Instrumente injiziert werden. Karboxylhaltige Säuren schnell in einen Gaschromatographen injiziert sammeln und Buchten, Inlet Liner und dem vorderen Ende der Spalten zu ruinieren. Um diese Säuren zu entfernen, muss die Probe zuerst eine andere Technik der Reinigung zu unterziehen: Trennung durch Säulenchromatographie.

Verseifung hat mehrere Anwendungen in der Extraktion und Reinigung von organischen Molekülen.

Verseifung kann verwendet werden, nicht nur um Biomarker zu trennen, sondern auch einzelne Komponenten für den Einsatz in kommerziellen Produkten zu extrahieren. In diesem Beispiel wurden Verbindungen vom Tabak Baum – Nicotiana Glauca – isoliert und analysiert, um ihr Potential als Rohstoff für eine Vielzahl von Bio-basierte Produkte, wie Treibstoff, Wärme und eine Reihe von chemischen Verbindungen zu untersuchen.

Die Blätter wurden zunächst homogenisiert, dann zentrifugiert, um die Moleküle des Interesses zu konzentrieren. Das konzentrierte Pflanzenmaterial wurde dann verseift. Das extrahierte Material wurde analysiert, mit flüssigen Gaschromatographie-Massenspektrometrie, zur Bestimmung der Konzentration von Tocopherol – eine Familie von Vitamin E-Verbindungen in der Regel in Pflanzen gefunden.

Das extrahierte Material kann auch rekonstituierte in Vitro zu seiner ursprünglichen Zusammensetzung sein. In diesem Beispiel wurde die Verseifung zur Carotinoide aus Spinatpflanzen, später rekonstituierte in Vitrozu gewinnen. Der Spinat war zunächst homogenisiert, dann zentrifugiert, um die Farbmoleküle zu ernten. Diese Moleküle wurden dann in einer Lösung von Kaliumhydroxid in einem separatory Trichter, Einleitung Verseifung ausgesetzt. Die saponified Carotinoide getrennt in einem Äther-Schicht, die gesammelt und getrocknet wurde. Mit einer Reihe von Lösung Puffer, Carotinoide und andere Pigmentierung Moleküle – wurden später rekonstituierte in Vitro. Diese Reinigung für die Analyse dieser Pigmente ohne die Einmischung des ähnlich strukturierten organische Verbindungen erlaubt.

Verseifung ist wegen seiner Fähigkeit, Ester Hydrolyseneigung lässt sich “frei” Verbindungen, die sonst an Makromoleküle gebunden sind. In diesem Beispiel wird ein wasserfreies Verseifung Schritt zur Ethyl 4-Fluorobenzoate in der Carbonsäure Salz der potassium4-Fluorobenzoate zu konvertieren. Diese Deprotection durch Verseifung ermöglicht die Produktion von Rohöl SFB – eine Reaktion, die nicht möglich wäre das Molekül geblieben “stecken”.

Sie sah nur Jupiters Einführung in die Reinigung von U^k’₃₇ Proben durch Verseifung. Sie sollten jetzt verstehen, wie Verseifung funktioniert und wie man es benutzt, um Alkenone in einem total Lipid-Extrakt zu reinigen. Weitere Reinigungsprozesse werden in nachfolgenden Videos vorgeführt.

Danke fürs Zuschauen!

Procedure

1. Setup und Vorbereitung der Materialien

Erhalten Sie eine totale Lipid Extrakt (TLE) Lösemittelextraktion Verfahren (Ultraschall, Soxhlet oder beschleunigte Lösungsmittel Extraktion (ASE)).
Bereiten Sie eine Lösung von 2 N KOH in 5 % H₂O in Methanol.
1. KOH und Methanol können chemische Fachhandel erworben werden. Diese Chemikalien sollte rein und frei von Kohlenwasserstoffen.
  1. Die molare Masse von KOH ist ~ 56 amu 1 Mol Oh^– für jedes Mol KOH nachgeben. Also, um eine 2 N-Konzentration zu erreichen, lösen Sie 112 g KOH in 0,95 L reines Wasser und 0,05 L Methanol auf.
  2. Beachten Sie, dass die Auflösung der KOH in Wasser exotherm ist und eine große Menge an Wärme schafft. Achten Sie darauf, die KOH-Pellets hinzufügen, das Wasser langsam um eine heftige Reaktion zu vermeiden.
2. 112 g KOH Pellets in 0,95 L reines Wasser auf der Platte eine automatische Rühren auflösen.
3. Fügen Sie 0,05 L Methanol, sobald alle die KOH wird aufgelöst, um die Auflösung der organischen Biomarker in der wässrigen Lösung zu unterstützen.
Bereiten Sie eine Lösung von 6 N Salzsäure (HCl) in H₂O.
1. HCl kann chemischen Fachhandel erworben werden. Diese Chemikalie sollte rein und frei von Kohlenwasserstoffen.
2. HCl kommt in der Regel konzentriert als 13 N. So erzeugt eine 1:1 Mischung von HCl und reines Wasser eine 6,5 N Mischung von HCl, das ist nahe genug, um 6 N für die Zwecke dieses Experiments.
  1. Achten Sie darauf, das Wasser der HCl hinzu und nicht anders herum, als Zugabe von Wasser zu konzentrierter HCl ist exotherm und erzeugt Wärme. Dadurch kann HCl zu spritzen.
3. Gießen Sie langsam und vorsichtig 100 mL HCl in ein Becherglas mit 100 mL reines Wasser, wirbeln die Mischung zwischen Ergänzungen von HCl.
Bereiten Sie eine Lösung von 5 % NaCl (Kochsalz) in H₂O.
1. NaCl kann chemische Fachhandel erworben werden. Diese Chemikalie sollte rein und frei von Kohlenwasserstoffen.
2. Berechnen Sie und wiegen Sie die Masse des Salzes ~ 1 L 5 % Lösung (w/w) machen musste. 1 L Wasser wiegt ~ 1 kg oder 1000 g. 50 g NaCl in 950 mL aufgelöst gibt somit eine 5 % ige Lösung (50 g + 950 g = 1000 g, 50 g / 1000 g = 0,05 oder 5 %).
3. Sanft Reinwasser auf eine automatische rühren Platte 50 g NaCl hinzu und warten Sie, bis es aufzulösen.
Erhalten Sie die folgenden Materialien: 2 sauber und verbrannt (550 ° c für 6 h) 40 mL Borosilikatglas Fläschchen mit PTFE-Gefütterte Mütze; einem wärmenden Ofen oder Heizung Blöcke; verbrannt (550 ° c für 6 h) Borosilikatglas Pipetten und Birnen; pH-Band (saurer Bereich); Hexan (Hexan chemische Fachhandel erworben werden. Diese Chemikalie sollte Optima Grade oder gleichwertig sein).

(2) Methoden

Beginnen Sie mit den getrockneten TLE (mit Ester) in einem der 40 mL-Borosilikat-Glas-Fläschchen.
Fügen Sie ca. 10 mL 2 N KOH TLE und Cap.
Hitze im Ofen oder auf einem Heizblock zu 60 ˚C für 2,5 h, Spalten die Esterbindung (Abbildung 3).
Die Probe vom Herd nehmen und auf Zimmertemperatur abkühlen lassen.
Die TLE (Abbildung 3) ca. 10 mL 5 % NaCl-Lösung hinzufügen. Dies hilft, die Schnittstelle zwischen der wässrige und organische Phase (um hinzugefügt werden) von Schäumen. Deckel und schütteln Sie kurz.
Fügen Sie 6 N HCl zu den gesalzenen TLE tropfenweise hinzu, bis pH 2 O^–zum Protonate erreicht ist und bilden Sie das Endprodukt eine stabile Carbonsäure (Abbildung 3; Verwendung pH-Papier zum Testen) zu. Wenn die TLE gefärbt wurde, möglicherweise eine Verschiebung in der Farbe, die zeitgleich mit pH 2.
Die gesäuerte Lösung, die jetzt frei von Ester ist fügen Sie etwa 20 mL Hexan hinzu. Verschließen und kräftig schütteln, für 5 s, organische Verbindungen aus dem Wasser zu extrahieren.
Dürfen Sie bis wässrige und organische Phasen völlig getrennt einstellen. Salze, Ionen, Wasser und nicht umgesetztes HCl bleiben in der wässrigen Phase. Organische Verbindungen sind jetzt in das Hexan.
Ungefähr 75 % von den Überstand Hexan mit einer Pipette zu entfernen und in die anderen 40 mL Borosilikatglas Durchstechflasche zu verzichten.
2.7-2.9 zweimal, Hinzufügen von etwa 10 mL Hexan jedes Mal zu wiederholen.
Entsorgen Sie übrig gebliebene wässrige Mischung in einem richtigen Abfallbehälter.
Beschriften Sie das Fläschchen mit Hexan und Ester-freie Organics “TLE – verseift.”

Results

Diese Reinigung produziert eine TLE Ester, die gemeinsam mit der Alkenone Medikamentenfreisetzende möglicherweise kostenlos. Allerdings erzeugt die Reinigung Karboxylhaltige Säuren, die auf Instrumente zur häufig Alkenone Konzentrationen aufgrund ihrer geringen Volatilität Proben injiziert werden kann nicht. Beispielsweise der Siedepunkt von Hexan, ein 6-Carbon Kohlenwasserstoff ist 68 ° c, aber der Siedepunkt von seiner Säure (Hexanoic Säure) ist 205 ˚C. Die meisten GC zugänglich Biomarker haben von 20 bis 35 c-Atomen (Siedepunkt nimmt in der Regel mit einer wachsenden Zahl von Atomen) aus, bis die meisten GC Temperaturprogrammen rund 300 ˚C. Carbonsäuren injiziert eine GC schnell ansammeln und Buchten, Inlet Liner und dem vorderen Ende der Spalten zu ruinieren. Um diese Säuren zu entfernen, muss die Probe zuerst eine andere Reinigung Technik Trennung durch Säulenchromatographie unterziehen.

Applications and Summary

Wie bereits erwähnt, ist Verseifung in organische Geochemie Labs verbreitet, um Fettsäure-Methylester (Kamera) von Alkenone, genannt Alkenoates, die zusammen mit Alkenone am Gaschromatographen (Abb.Ure 1) eluieren zu entfernen. Verseifung dient auch zur “freien” Fettsäuren “verpflichtet”, Sediment oder Makromoleküle. Den Abbau und die Erhaltung von organischen Stoffen und Biomarker in Sedimenten umfasst die Beseitigung von funktionellen Gruppen (N, O und S) und die eventuelle Polymerisation von einzelnen Biomarker in Makromoleküle und/oder die Adsorption von Biomarkern und Makromoleküle auf mineralischen Untergründen. Nicht alle Biomarker in einer Einstellung werden gebunden und das Verhältnis von gebundenen freien Biomarker wechselt nach Einstellung und Sediment Alter Gründen noch nicht vollständig geklärt. Verseifung, manchmal bei Temperaturen höher als die hier diskutierten (> 200 ° c), wird verwendet, um diese gebundenen Biomarker in dem Bestreben, ihnen, ihrer Quelle und die Mechanismen, die für ihre gebundenen Natur beschreiben frei.

Transcript

Saponification is a technique commonly used to remove fatty acid methyl esters from a complex organic mixture.

Complex organic samples are often analyzed by gas chromatography, which is used to determine the relative concentrations of individual components.

However, compounds that are similar in size and structure cannot be distinguished by the instrument, skewing the results. Therefore, unwanted compounds that produce overlapping signals must be removed in order to obtain accurate results.

This video covers the use of saponification to purify alkenones for paleoclimatology. It is the first in a series detailing the purification of complex biomarker samples. It will cover the procedure, as well as some other uses of the technique.

Polyunsaturated long chain alkyl ketones, called alkenones, have been shown to provide useful information about past sea surface temperature.

However, the organisms that produce alkenones often create fatty acid methyl esters that are similar in size and chemical structure, called alkenoates. Because of these similarities, alkenoates must be removed before an accurate analysis can be obtained.

Saponification is a common technique used to prevent co-elution of these molecules. Saponification utilizes water to split the molecular bond of an ester. A base attaches to the carbon at the heart of the alkenoate. This addition reaction creates an unstable intermediate, and the alkoxide is expelled.

The hydrogen from the newly formed acid moves to the expelled alkoxide, and the resulting carboxylate anion forms an ionic bond with the cation from the base. The result is an alcohol and a fatty acid salt. Adding a strong acid will re-generate the carboxylic acid. At this point, the offending alkenoate has been converted to a form that no longer co-elutes with the alkenone of interest.

Now that you understand how saponification can be used to purify an organic mixture, you are ready to begin the procedure.

First, acquire a dried total lipid extract – or TLE – that was obtained using a solvent extraction method. Next, prepare the saponification solutions as outlined in the text protocol. Ensure that all components are pure and free of hydrocarbons. Once the solutions are prepared, add the dried TLE to a 60-mL borosilicate glass vial. Add 2 mL of 2 normal potassium hydroxide, and seal the vial. Next, heat the vial to 60 °C for 2.5 h to cleave the ester bond. When this is complete, allow the sample to cool to room temperature. Once the sample has cooled, add 2 mL of 5% sodium chloride solution to the vial. Cap the vial, and shake briefly. Add 6 N hydrochloric acid dropwise until a pH of 2 is reached – using pH paper to test. The addition of this acid will protonate the carboxylate anion to form the final product – the stable carboxylic acid.

Now that the acidified solution is ester-free, add 5 mL of hexane. Cap and shake vigorously for 5 seconds to extract the organic compounds from the water. Allow the solution to rest until the organic and aqueous phases separate completely. Salts, ions, and unreacted hydrochloric acid will remain in the aqueous phase, while organic compounds will separate into the hexane. Once the phases have completely separated, remove approximately 75% of the hexane using a pipette, and dispense into another 40-mL vial. Repeat this extraction process two additional times, adding 5 mL of hexane each time. Once this is complete, discard the leftover aqueous solution into a proper waste container. Label the vial containing the freshly saponified organic phase. The carboxylic acids produced cannot be injected into the instruments commonly used for alkenone analysis without further purification. Carboxylic acids injected into a gas chromatograph quickly accumulate and ruin inlets, inlet liners, and the front end of the columns. To remove these acids, the sample first needs to undergo another purification technique: separation via column chromatography.

Saponification has several applications in the extraction and purification of organic molecules.

Saponification can be used not only to separate biomarkers, but also to extract individual components for use in commercial products. In this example, compounds from the tobacco tree – Nicotiana glauca – were isolated and analyzed to investigate their potential as feedstock for a wide variety of bio-based products, such as fuel, heat, and an array of chemical compounds.

The leaves were first homogenized, then centrifuged, to concentrate the molecules of interest. The concentrated plant material was then saponified. The extracted material was analyzed with liquid chromatography-mass spectrometry, to determine the concentration of tocopherol – a family of vitamin E compounds typically found in plants.

The extracted material can also be reconstituted in vitro to its original composition. In this example, saponification was used to extract carotenoids from spinach plants, to be later reconstituted in vitro. The spinach was first homogenized, then centrifuged, to harvest the pigment molecules. These molecules were then suspended in a solution of potassium hydroxide in a separatory funnel, initiating saponification. The saponified carotenoids separated into an ether layer, which was collected and dried. Using a series of solution buffers, the carotenoids – and other pigmentation molecules – were later reconstituted in vitro. This purification allowed for analysis of these pigments without the interference of similarly structured organic compounds.

Because of its ability to hydrolyze esters, saponification can be used to “free” compounds that are otherwise bound to macromolecules. In this example, an anhydrous saponification step is used to convert ethyl 4-fluorobenzoate to the carboxylic acid salt of potassium4-fluorobenzoate. This deprotection through saponification allows for the production of crude SFB – a reaction that wouldn’t be possible had the molecule remained “stuck”.

You’ve just watched JoVE’s introduction to the purification of Uk’37 samples through saponification. You should now understand how saponification works, and how to use it to purify alkenones in a total lipid extract. Further purification processes will be demonstrated in subsequent videos.

Thanks for watching!

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