Aufreinigung eines Gesamtlipidextrakts mit Säulenchromatographie

Die Säulenchromatographie ist eine flexible Technik zur Reinigung des komplexen Gemisches von Verbindungen, die im Sediment vorkommen. Die Gemische trennen sich auf ihrem Weg durch die Säule und werden in Fraktionen gesammelt, die jeweils eine andere chemische Klasse von Verbindungen enthalten. Daher wird die Säulenchromatographie häufig als zusätzlicher Reinigungsschritt nach der anfänglichen Isolierung der gewünschten Verbindung eingesetzt. Organische Extrakte wie Gesamtlipidextrakte können komplexe Mischungen aus vielen Verbindungen sein. Bei einigen Reinigungstechniken, wie z. B. der Verseifung, werden Verbindungen eingeführt, die analytische Instrumente beschädigen können und daher vor der Analyse entfernt werden müssen. Dieses Video ist Teil einer Serie über die Extraktion, Reinigung und Analyse von Lipiden aus Sedimenten. Sobald ein Gesamtlipidextrakt aus einer Sedimentprobe entnommen wurde, wird die Säulenchromatographie verwendet, um sowohl Alkenone als auch GDGTs zu reinigen, je nach gewünschter Analyse.

Bei der Säulenchromatographie wird ein Gemisch chemischer Verbindungen auf eine feste stationäre Phase, wie z. B. Kieselgel, geladen. Eine mobile Phase, wie z. B. ein organisches Lösungsmittel, wird dann verwendet, um die Verbindungen aus der Säule zu eluieren oder zu entfernen. Die Reihenfolge, in der die Verbindungen eluiert werden, hängt von der Stärke der Wechselwirkungen der Verbindungen mit dem Kieselgel und mit dem Eluenten ab.

Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt, die jeweils unterschiedliche Verbindungen aus dem Gemisch enthalten. Abhängig von den Eigenschaften der Verbindungen kann ein einzelnes Lösungsmittel eine ausreichende Trennung gewährleisten und alle interessierenden Verbindungen eluieren. Andernfalls werden mehrere Lösungsmittel verwendet, um jede interessierende Verbindung nacheinander zu eluieren.

Polare Verbindungen, die eine ungleichmäßige Ladungsverteilung aufweisen, adsorbieren stark an das polare Kieselgel, während unorganische Verbindungen schwach adsorbieren. Polare Lösungsmittel haben eine größere Affinität zu Kieselgel und sind daher leistungsfähigere Eluenten als unpolare Lösungsmittel. So eluieren apolare Lösungsmittel nur unpolare Verbindungen, während polare Lösungsmittel sowohl unpolare als auch polare Verbindungen eluieren.

Wenn die gewünschten Verbindungen mäßig polar sind, sollten unpolare Verbindungen mit einem unpolaren Lösungsmittel von der Säule abgewaschen werden, bevor ein polares Lösungsmittel verwendet wird. Um die Eluierung unerwünschter hochpolarer Verbindungen wie Säuren zu vermeiden, sollte ein polarer Eluent nicht mehr Eluierungskraft haben, als für die polarste gewünschte Verbindung erforderlich ist.

Nachdem Sie nun die Prinzipien der Säulenchromatographie verstanden haben, gehen wir ein Verfahren zur Aufreinigung von Lipid-Biomarkern aus einem Gesamtlipidextrakt durch Kieselgel-Säulenchromatographie durch.

Um organische Verunreinigungen zu entfernen, verbrennen Sie Borosilikatglaspipetten, Borosilikatglasfläschchen und Glaswolle für 6 Stunden bei 550 °C. Sobald die Gläser gebrauchsfertig sind, stellen Sie ein Gestell für Pipetten und Fläschchen auf. Besorgen Sie sich Pipettenkolben, eine saubere Pinzette, einen Laborspatel, Kieselgel, Hexan, Dichlormethan und Methanol. Legen Sie mit einer sauberen Pinzette ein kleines Büschel Glaswolle in die Öffnung einer Pipette. Schieben Sie die Glaswolle mit dem Stiel einer anderen Pipette vorsichtig auf den Boden der Pipette, sodass ein loser Stopfen entsteht. Laden Sie vorsichtig Kieselgel in die Pipette, bis es halb voll ist. Befestigen Sie die Pipette aufrecht im Rack. Befestigen Sie ein 4-ml-Fläschchen aus Borosilikatglas unter der Spitze der Pipette für die Abfallsammlung. In einem anderen Fläschchen aus Borosilikatglas werden bis zu 10 mg der trockenen Probe aus dem Verseifungsprozess in Hexan suspendiert. Wenn die Probe an den Wänden des Fläschchens klebt, beschallen Sie das Fläschchen 5 Minuten lang. Nun kann die Chromatographie beginnen.

Um die Chromatographie zu starten, waschen Sie die Kieselgelsäule mit 3 Volumen Hexan, um Luftblasen und Verunreinigungen zu entfernen. Ersetzen Sie dann das Abfallfläschchen durch ein leeres Fläschchen für die apolare Fraktion. Laden Sie die Probe mit einer Glaspipette auf die Säule und lassen Sie die Suspension in das Kieselgel einziehen. Arbeiten Sie schnell, damit die Säule während des Eingriffs nicht austrocknet. Spülen Sie das Probenfläschchen zweimal mit kleinen Portionen Hexan und übertragen Sie jede Spülung auf die Säule. Fahren Sie mit der Zugabe von Hexan zur Säule fort, bis die Durchstechflasche fast voll ist. Lassen Sie das gesamte Hexan in das Kieselgel eindringen. Tauschen Sie dann das gefüllte Fläschchen gegen ein leeres Fläschchen gegen die mittelpolare Fraktion aus. Spülen Sie anschließend das Probenfläschchen mit DCM und geben Sie es 3 Mal in die Säule. Fahren Sie mit der Zugabe von DCM zur Säule fort, bis das Auffangfläschchen fast voll ist. Lassen Sie das DCM vollständig in das Kieselgel einziehen und tauschen Sie dann das gefüllte Fläschchen gegen ein leeres Fläschchen gegen die polare Fraktion aus. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit Methanol.

Sobald die Durchstechflasche fast voll ist, lassen Sie das Methanol in die Durchstechflasche tropfen und verschließen Sie dann alle Durchstechflaschen. Die mittelpolare Fraktion enthält die gewünschten Alkenone, während die GDGTs in der polaren Fraktion liegen. Bei besonders verschmutzten oder komplexen Alkenonproben muss die mittelpolare Fraktion vor der Analyse mit Harnstoffadduktion weiter gereinigt werden.

Die Säulenchromatographie wird in der Chemie häufig als Analyse- und Reinigungstechnik eingesetzt.

Kohlenstoff-Nanoröhren (CNTs) werden zunehmend in vielen Branchen eingesetzt, aber es gibt wachsende Bedenken hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit. Die Variation der Eigenschaften von CNTs verändert ihr Verhalten in Wasser und Boden. Um zu untersuchen, wie gut poröse Medien wie Sand und Schmutz CNTs zurückhalten, wurde eine Säule mit porösem Boden als stationärer Phase hergestellt. Zunächst wurden Fraktionen während der Beladung der CNT-Lösung auf die Säule gesammelt, um den Transport der CNTs durch den Boden zu analysieren. Dann wurden die noch an den Boden adsorbierten CNTs eluiert und die Fraktionen auf die Menge an CNTs analysiert, die im Boden verblieben waren. Die Ergebnisse geben Aufschluss über den Zusammenhang zwischen der Funktionalisierung von CNT-Oberflächen und ihren Transportmechanismen in der Umwelt.

Die Säulenchromatographie kann sowohl im großen als auch im kleinen Maßstab betrieben werden und wird daher bei der Entwicklung von Synthesen für industrielle Anwendungen eingesetzt. Spinnenseide hat eine ausgezeichnete Zugfestigkeit und Duktilität, kann aber nicht im industriellen Maßstab geerntet werden. Nach der Seidenproteinsynthese werden die rekombinanten Seidenproteine durch Affinitätschromatographie aufgereinigt, wobei die stationäre Phase so ausgelegt ist, dass nur das gewünschte Molekül eingefangen wird. Gründliches Waschen und Elution liefern die reinen Proteinfraktionen, die zum Spinnenspinnen von Spinnenseide in großen Maßstäben benötigt werden.

Für die Säulenchromatographie stehen viele stationäre Phasen zur Verfügung. Eine stationäre Phase ist möglicherweise nicht für alle potentiellen Produkte einer Synthese mit einem breiten Substituentenbereich geeignet, wie z. B. diese Iodoaziridinsynthese. Das Rohprodukt wird mit verschiedenen stationären Phasen vermischt und die Zersetzung wird durch Protonen-NMR bewertet. Da die Protonen-NMR hochempfindlich ist, können viele stationäre Phasen mit einer kleinen Menge Rohprodukt auf Produktzersetzung untersucht werden. Die Säulenchromatographie wird dann mit der optimalen stationären Phase durchgeführt, was die Aufreinigung neuartiger und hochreaktiver Verbindungen ermöglicht.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Säulenchromatographie zur Reinigung eines Gesamtlipidextrakts gesehen. Das folgende Video zeigt, wie komplexe Gemische, die Alkenone enthalten, weiter gereinigt werden können.

Danke fürs Zuschauen!