Entfernung von verzweigten und zyklischen Verbindungen durch Harnstoff-Adduktion für die Uk'37-Paläothermometrie
Quelle: Labor von Jeff Salacup - University of Massachusetts Amherst
Wie bereits in vorherigen Videos, das Produkt ein Bio solvent-Extraktion, ist ein…
1. Setup und Vorbereitung der Materialien
- Erhalten Sie eine totale Lipid Extrakt (TLE) Lösemittelextraktion Verfahren (Ultraschall, Soxhlet oder beschleunigte Lösungsmittel Extraktion (ASE)).
- Die folgenden Materialien bei jedem chemischen Händler erwerben: verbrannt Borosilikat Glas, Pipetten und Birnen; reines Wasser; Hexan; Dichlormethan (DCM); Methanol; Harnstoff.
- Die Reagenzien sollte rein und frei von Kohlenwasserstoffen. Alternativ kann reines Wasser in einem Labor mit einer Wasseraufbereitungsanlage erfolgen.
- Erhalten Sie Borosilikatglas 4 mL Fläschchen mit PTFE-ausgekleidet Kappen.
(2) Methoden
- Machen Sie eine Mischung von 2:1 DCM:Hexane (V: V).
- Mischen Sie in einem Erlenmeyerkolben 200 mL von DCM und 100 mL Hexan.
- Machen Sie eine Mischung von Harnstoff in Methanol (100 mg/mL).
- Ein Erlenmeyerkolben Gießen Sie 300 mL Methanol.
- Fügen Sie 300 mg Harnstoff.
- Unter Rühren auf eine automatische Platte Rühren der Harnstoff vollständig gelöst ist.
- Beginnen Sie mit der trockenen Probe in einem 4-mL-Fläschchen.
- Unterbrechen Sie die Probe in 1,5 mL einer 2:1-Mischung aus DCM:Hexane (V: V).
- Wenn die Probe nicht vollständig löst, für 5 min beschallen.
- Diese Mischung fügen Sie 1,5 mL von Harnstoff in Methanol hinzu.
- Achten Sie nach dieser Zusatz auf einen weißen Niederschlag zu bilden. Dies signalisiert die Schaffung von Harnstoff Kristalle.
- Trocknen Sie schonend die Kristalle unter Stickstoff, mit sanfter Wärme. Stellen Sie sicher, alle Lösungsmittel verdunstet ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Spülen Sie die Kristalle 3 X mit ca. 1 mL Hexan. Entfernen Sie das Hexan zwischen jedem Spülen mit einer Glaspipette übertragen in ein Fläschchen mit der Bezeichnung "nicht-Addukt."
- Lösen sich die Kristalle in 2 mL reines Wasser. Schütteln Sie, um vollständige Auflösung zu gewährleisten.
- Extrahieren die wässrige Phase mit Hexan durch Hinzufügen von 1 mL und sanft schütteln für 5 s.
- Ermöglichen Sie das Hexan und Wasser, völlig getrennt vor dem Entfernen von etwa 75 % der das Hexan mit einer Glaspipette und übertragen sie in ein Fläschchen mit der Aufschrift "Addukt."
- Wiederholen Sie Schritt 2.10 zweimal.
- Die Wasser und Harnstoff Lösung in einen geeigneten Abfallbehälter entsorgen.
Die Harnstoffadduktion ist eine Technik, die geradkettige Alkenone von hochverzweigten und zyklischen Verbindungen trennt.
Harnstoff ist eine organische Verbindung, die eine poröse kristalline Struktur bildet. Der Kristall kann bestimmte Moleküle einfangen und ein Addukt bilden, während andere nicht in die Struktur passen.
Die Harnstoffadduktion nutzt die unterschiedlichen Größen und Formen der Verbindungen, um sie zu trennen ? Ähnlich wie eine Münzzählmaschine ein Glas mit Kleingeld sortiert.
Dieses Video ist Teil einer Serie über die Extraktion, Reinigung und Analyse von Lipiden aus Sedimenten. Es wird die Verwendung der Harnstoffadduktion zur Durchführung einer Größenausschlussreinigung an einer Probe für die Alkenon-Paläothermometrie veranschaulicht.
Die Harnstoffadduktion ist eine Reinigungsmethode, die auf dem Größenausschluss basiert. Es trennt geradkettige oder selten verzweigte Verbindungen ? wie z.B. N-Alkane und Alkenone - von solchen, die stark verzweigt und/oder zyklisch sind.? ? ? ? ??
Möglich wird dies durch die besondere kristalline Struktur von Harnstoff. Bei der Bildung eines Harnstoffkristalls entstehen winzige Zwischenräume zwischen den einzelnen Molekülen. Diese Räume sind lang und schmal - so können geradkettige oder selten verzweigte Verbindungen in das Kristallgitter passen, während stark verzweigte und zyklische Verbindungen zu groß sind.
Die Harnstoffkristalle werden dann mit einem apolaren Lösungsmittel gewaschen, wobei die ausgeschlossenen Moleküle von den eingeschlossenen linearen Molekülen getrennt werden. Die gewaschenen Moleküle können direkt extrahiert und analysiert werden, während die Kristalle in Wasser aufgelöst werden müssen, um die linearen Verbindungen zuerst wieder in Lösung zu bringen. Ein weiteres unpolares Lösungsmittel wird dann verwendet, um die gewünschten Verbindungen aus dem Wasser zu extrahieren.
Sowohl die eingeschlossenen als auch die ausgeschlossenen Moleküle können wertvolle Informationen liefern. Zum Beispiel können stark verzweigte Isoprenoide, die von Meereiskieselalgen produziert werden, ein Indikator für die Existenz von saisonalem Meereis in hohen Breiten sein. Zyklische Verbindungen können das Vorhandensein früherer Brände widerspiegeln. Geradkettige Alkane und Alkenone sind gängige Proxies für die Ökosystemstruktur und die Meeresoberflächentemperatur.
Die Reinigung durch Harnstoffadduktion ist nicht immer notwendig, da einige interessante Verbindungen direkt aus der unveränderten extrahierten organischen Probe analysiert werden können. In extremen Fällen - wie z.B. in Sedimenten aus stark verschmutzten Gebieten, wie z.B. Mündungen in der Nähe von Industriezentren - kann eine Harnstoffadduktion notwendig sein, um unbekannte Verbindungen zu entfernen, die während der Analyse koelutieren.
Jetzt, da Sie die Harnstoffadduktion verstehen, sind Sie bereit, mit dem Verfahren zu beginnen.
Erwerben Sie zunächst einen getrockneten Gesamtlipidextrakt ? oder TLE ? das aus der Probe extrahiert und durch Verseifung und Säulenchromatographie gereinigt wurde.
Bereiten Sie anschließend die Harnstoffadduktionslösungen vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Stellen Sie sicher, dass alle Komponenten rein und frei von Kohlenwasserstoffen sind.
Die Probe wird in 1,5 ml der DCM/Hexan-Lösung suspendiert. Wenn sich das TLE nicht vollständig auflöst, 5 Minuten lang beschallen. 1,5 mL Harnstoff- und Methanollösung hinzufügen. Achten Sie auf die Bildung eines weißen Niederschlags, da dies die Bildung von Harnstoffkristallen signalisiert. Trocknen Sie anschließend die Harnstoffkristalle vorsichtig unter Stickstoff bei sanfter Hitze. Achten Sie darauf, das gesamte Lösungsmittel zu verdampfen. Sobald die Kristalle vollständig getrocknet sind, spülen Sie sie 3 Mal mit ca. 1 mL Hexan aus. Verwenden Sie eine Glaspipette, um das Hexan zwischen jedem Spülgang zu entfernen, und geben Sie es in ein frisches Fläschchen. Dies wird als "Nicht-Addukt" bezeichnet. Als nächstes lösen Sie die Kristalle in 2 mL reinem Wasser auf. Schütteln, um eine vollständige Auflösung sicherzustellen.
Um die Biomarker aus dem zugegebenen Wasser zu extrahieren, fügen Sie 1 ml Hexan hinzu, verschließen Sie es und schütteln Sie es vorsichtig für 5 s.
Lassen Sie die Lösung ruhen, bis sich Hexan und Wasser vollständig trennen. Entfernen Sie dann mit einer Glaspipette etwa 75 % des Hexans und überführen Sie es in ein neues Fläschchen. Dies wird als "Addukt" bezeichnet.
Wiederholen Sie diesen Extraktionsvorgang zweimal und fügen Sie jedes Mal 1 ml Hexan hinzu. Kombinieren Sie die drei Addukte in einem Fläschchen. Entsorgen Sie das Wasser und die Harnstofflösung in einem geeigneten Abfallbehälter. Die Probe ist nun bereit für die Analyse.
Die Harnstoffadduktion hat mehrere Anwendungen bei der Trennung und Reinigung organischer Moleküle.
Ein Isotop ist eine Variante eines chemischen Elements, die sich in der Neutronenmenge und damit in ihrer Atommasse unterscheidet. Ein Element kann mehrere Isotope haben, von denen jedes eine andere Masse hat. Isotope können auch chemische und molekulare Eigenschaften haben, die sich voneinander unterscheiden, so dass es wichtig sein kann, zu bestimmen, welche Isotope in einer bestimmten Probe vorhanden sind. In diesem Beispiel wurden die Kohlenstoff- und Wasserstoffisotopenverhältnisse in Blattwachsen gemessen, um Informationen über die Stoffwechselwege einer Pflanze zu erhalten. Zur Bestimmung der Isotopenverhältnisse werden sehr große Mengen an Material benötigt, und Verbindungen, die bei niedrigen Konzentrationen ähnliche Nachweise aufweisen, können sich bei der Analyse großer Mengen überlappen.
Daher wurde die Harnstoffadduktion verwendet, um die interessierenden n-Alkane von allen störenden Verbindungen zu trennen. Durch die Entfernung dieser unerwünschten Materialien konnte ein genaues Isotopenverhältnis bestimmt werden.
Erdöl ist ein komplexes Gemisch von Kohlenwasserstoffen, von denen jeder einzigartige Eigenschaften und Verwendungsmöglichkeiten hat. Die Abtrennung dieser Verbindungen aus Erdöl ist in der chemischen Industrie sehr wichtig – verzweigtkettige Alkane werden häufig als Leichtschmierstoffe verwendet, während geradkettige Alkane hauptsächlich in Alkylierungsprozessen eingesetzt werden. In diesem Beispiel wurde die Harnstoffadduktion verwendet, um Alkane von Kerosin zu trennen. Durch eine aufeinanderfolgende Reihe von Harnstoffadduktionen wurden diese Alkane mit einer Reinheit von 99 Prozent vom Kerosin getrennt.
Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Reinigung komplexer organischer Mischungen durch Harnstoffadduktion gesehen. Sie sollten jetzt den Größenausschluss, die Bedeutung der Reinigung von Proben für eine genaue Komponentenmessung und die Harnstoffadduktion verstehen.
Danke fürs Zuschauen!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does urea adduction separate straight-chain compounds from branched and cyclic molecules?
Urea forms a porous crystalline structure with long, narrow spaces in its lattice. Straight-chain or rarely-branching compounds like n-alkanes and alkenones fit into these spaces, while highly-branched and cyclic compounds are too large to enter. After washing with an apolar solvent, the excluded molecules separate from the included linear ones, enabling selective purification based on molecular size and shape.
Q2: What is the primary purpose of urea adduction in paleothermometry sample preparation?
Urea adduction purifies complex lipid extracts by isolating compounds of interest from interfering substances. In paleothermometry, it separates alkenones and other biomarkers from unwanted branched and cyclic compounds, enabling accurate measurement of paleoclimate proxies. This size-exclusion purification ensures that only target compounds are analyzed, improving data reliability for reconstructing past sea surface temperatures.
Q3: Why must urea crystals be dissolved in water to recover adducted compounds?
Straight-chain compounds trapped within the urea crystal lattice cannot be extracted directly with apolar solvents because they are physically enclosed. Dissolving the crystals in water releases the included molecules back into solution. An apolar solvent is then used to extract the desired compounds from the aqueous phase, separating them from the dissolved urea.
Q4: What information can branched isoprenoids and cyclic compounds provide in paleoclimate research?
Highly branched isoprenoids produced by sea ice diatoms serve as proxies for seasonal sea ice presence at high latitudes. Cyclic compounds may reflect the occurrence of past fires in the sediment record. These excluded compounds, separated from linear biomarkers through urea adduction, offer complementary paleoenvironmental information alongside straight-chain proxies for ecosystem structure and temperature.
Q5: When is urea adduction necessary versus optional in lipid analysis?
Urea adduction is optional when compounds of interest can be analyzed directly from unaltered extracted organic samples without interference. However, it becomes necessary in extreme cases, such as sediments from highly polluted areas like industrial estuaries, where unknown compounds coelute during analysis. Removing these interfering substances ensures accurate measurement of target biomarkers.
Q6: How is urea adduction applied in petroleum refining to separate alkanes?
In the petroleum industry, urea adduction separates branched-chain alkanes from straight-chain alkanes based on their molecular shapes. Branched-chain alkanes are used as light lubricants, while straight-chain alkanes serve in alkylation processes. Successive urea adductions can achieve high purity separation, with studies demonstrating 99-percent purity separation of alkanes from kerosene.
Q7: What steps follow urea crystal formation during the adduction procedure?
After white precipitate forms, gently dry the urea crystals under nitrogen with gentle heat until all solvent evaporates. Rinse the crystals three times with hexane, transferring each rinse to a fresh vial as the non-adduct fraction. Dissolve the crystals in water, then extract with hexane three times, combining all hexane extracts as the adduct fraction ready for analysis.