UV/Vis-Spektroskopie
Quelle: Labor von Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Sichtbare Ultraviolett (UV-Vis) Spektroskopie ist eines der beliebtesten analytische Tec…
1. kalibrieren Sie das Spektrometer
- Schalten Sie die UV-Vis-Spektrometer und lassen Sie die Lampen zum Aufwärmen für einen angemessenen Zeitraum (ca. 20 min) um sie zu stabilisieren.
- Füllen Sie eine Küvette mit dem Lösungsmittel für die Probe und stellen Sie sicher, dass außen sauber ist. Dies wird als eine leere dienen und helfen, leichte Verluste durch Streuung und Absorption durch das Lösungsmittel entfallen.
- Legen Sie die Küvette in das Spektrometer. Achten Sie darauf, die Küvette richtig auszurichten, so oft die Küvette hat zwei Seiten, die sind für Handhabung (kann genutet) gedacht und sollen nicht durch Licht.
- Nehmen Sie eine Lesung für den Rohling. Die Extinktion sollte minimal sein, aber Extinktion sollten künftige Proben abgezogen werden. Einige Instrumente könnten die leere Daten speichern und die Subtraktion automatisch durchführen.
2. führen Sie ein Absorptionsspektrum
- Füllen Sie die Küvette mit der Probe. Um sicherzustellen, dass die Übertragung quantitativ ist, spülen Sie die Küvette zweimal mit der Probe und dann etwa ¾ voll zu füllen. Stellen Sie sicher, dass außen sauber von Fingerabdrücken usw. ist.
- Legen Sie die Küvette in das Spektrometer in die richtige Richtung.
- Decken Sie die Küvette um jede Umgebungslicht zu verhindern.
- Sammeln Sie ein Absorptionsspektrum dadurch, dass das Instrument, um durch verschiedene Wellenlängen zu scannen und die Extinktion zu sammeln. Der Wellenlängenbereich eingestellt werden, mit Informationen über die spezifischen Probe, aber eine Reihe von 200 – 800 nm ist standard. Ein Diodenarray Instrument ist in der Lage, eine gesamte Absorptionsspektrum in einem Durchlauf zu sammeln.
- Bestimmen Sie aus den gesammelten Absorptionsspektrum, das Absorption Maximum (λMax.). Die Sammlung von Spektren in λMax.eine Schätzung der Fehler zu wiederholen.
- Um eine Kalibrierungskurve zu machen, sammeln Sie die UV-Vis-Spektrum einer Vielzahl von unterschiedlichen Konzentration Proben. Spektrometer sind oft im linearen Bereich beschränkt und werden nicht in der Lage, einen Extinktion-Wert größer als 1,5 zu messen. Wenn die Extinktion-Werte für die Stichprobe außerhalb des Instruments linearen Bereich sind, Verdünnen der Probe um die Werte innerhalb des linearen Bereichs zu erhalten.
(3) Kinetik Experimente mit UV-Vis Spektroskopie
- UV-Vis kann für Kinetik Experimente verwendet werden, durch die Änderung der Extinktion im Laufe der Zeit zu untersuchen. Für ein Experiment Kinetik eine erste Meßwert der Probe.
- Fügen Sie schnell das Reagenz um die chemische Reaktion zu starten.
- Rühren sie gut um mit der Probe zu mischen. Wenn eine kleine Menge hinzugefügt wird, könnte dies in eine Küvette erfolgen. Alternativ mischen Sie das Reagenz mit Probe und gießen Sie schnell etwas in eine Küvette für eine Messung.
- Die Extinktion bei der λMax. für den Analyten von Interesse im Laufe der Zeit zu messen. Wenn das Reagenz wird Messung verwenden (d. h. Absorption steigt da gibt es weniger Reagenz aufnehmen), dann der Zerfall der Ordnung der Reaktion zeigen wird.
- Machen Sie mit Hilfe einer Eichkurve, ein Grundstück von Analyten Konzentrationszeit Vs, Umwandlung den Extinktion Wert in Konzentration. Von dort kann dieses Diagramm mit entsprechenden Gleichungen fit sein, um die Reaktion Rate Konstanten bestimmen.
Die Ultraviolett-Spektroskopie (UV-Vis-Spektroskopie) ist eine der beliebtesten Analysetechniken im Labor.
Bei der UV-Vis-Spektroskopie wird Licht mit einer bestimmten Wellenlänge im UV- oder sichtbaren Spektrum durch eine Probe geleitet. Wenn die Probe einen Teil des Lichts absorbiert, wird nicht das gesamte Licht durchgelassen oder übertragen. Die Transmission ist das Verhältnis der Intensität des durchgelassenen Lichts zum einfallenden Licht und korreliert mit der Absorption. Die Extinktion kann quantitativ verwendet werden, um die Konzentration einer Probe zu erhalten. Es kann auch auf qualitative Weise verwendet werden, um eine Verbindung zu identifizieren, indem die gemessene Extinktion über einen Wellenlängenbereich, das sogenannte Absorptionsspektrum, mit den veröffentlichten Daten abgeglichen wird. In diesem Video wird die UV-Vis-Spektroskopie vorgestellt und ihre Verwendung im Labor bei der Bestimmung der Probenkonzentration und der Reaktionskinetik demonstriert.
Wenn ein Photon auf ein Molekül trifft und absorbiert wird, wird das Molekül aus seinem Grundzustand in einen höheren Energiezustand befördert. Die Energiedifferenz zwischen den beiden ist die Bandlücke. Die Energie des Photons muss genau mit der Bandlücke übereinstimmen, damit das Photon absorbiert werden kann. Die chemische Struktur bestimmt die Bandlücke; Daher haben Moleküle jeweils einzigartige Absorptionsspektren.
Die Absorption folgt dem Beerschen Gesetz, das besagt, dass die Absorption gleich dem molaren Dämpfungskoeffizienten multipliziert mit der Weglänge und der Konzentration ist. Der molare Dämpfungskoeffizient hängt mit der Fähigkeit der einzelnen Verbindung zusammen, Licht einer bestimmten Wellenlänge zu absorbieren. Die Weglänge bezieht sich auf die Entfernung, die das Licht durch die Probe zurücklegt, die bei Standardküvetten typischerweise 1 cm beträgt. Das Biersche Gesetz kann zur Berechnung der Probenkonzentration verwendet werden, wenn das Absorptionsvermögen bekannt ist, oder es kann eine Kalibrierkurve verwendet werden.
UV-Vis wird oft als allgemeine Technik bezeichnet, da die meisten Moleküle Licht im UV-sichtbaren Wellenlängenbereich absorbieren. Der UV-Bereich reicht von 100 bis 400 nm und das sichtbare Spektrum von 400 bis 700 nm. Die meisten Spektralphotometer arbeiten jedoch nicht im tiefen UV-Bereich von 100-200 nm, da Lichtquellen in diesem Bereich teuer sind. Die meisten UV-Vis-Spektralphotometer verwenden eine Deuteriumlampe für den UV-Bereich, die Licht ab 170-375 nm erzeugt, und eine Wolfram-Glühlampen für den sichtbaren Bereich, die Licht ab 350-2.500 nm erzeugt.
Da es sich bei der Lichtquelle in der Regel um eine Lampe mit breiten Wellenlängenbereichen handelt, wird die spezifische Absorptionswellenlänge mithilfe von Filtern oder einem Monochromator ausgewählt. Ein Monochromator ist ein Gerät, das die Wellenlängen des Lichts räumlich trennt und dann einen Austrittsspalt an der Stelle platziert, an der sich die gewünschte Wellenlänge des Lichts befindet. Der Monochromator kann über einen Wellenlängenbereich abgetastet werden, um ein vollständiges Absorptionsspektrum bereitzustellen. Dies macht die Technik nützlich für die Quantifizierung und Identifizierung einer Vielzahl von Molekülen.
Nachdem nun die Grundlagen der UV-Vis-Spektroskopie skizziert wurden, werfen wir einen Blick auf ein einfaches UV-Vis-Experiment im Labor.
Schalten Sie vor Beginn der Messung das Spektralphotometer ein und lassen Sie die Lampen für eine angemessene Zeit erwärmen, um sie zu stabilisieren.
Bereiten Sie eine Leerprobe vor, indem Sie eine saubere Küvette mit dem Probenlösungsmittel füllen und dann die Außenseite mit fusselfreiem Papier abwischen, um Fingerabdrücke zu entfernen.
Stellen Sie sicher, dass die Küvette richtig mit den gerillten Seiten aus dem Strahlengang ausgerichtet ist, und setzen Sie sie in das Spektralphotometer ein. Sichern Sie den Deckel, um zu verhindern, dass Umgebungslicht in das System eindringt.
Messen Sie die Absorption des Rohlings bei einer Wellenlänge oder über einen Wellenlängenbereich. Die Extinktion ist zu erfassen oder aufzubewahren, da sie von der Extinktion der Probe abgezogen werden muss.
Entsorgen Sie anschließend den Rohling und spülen Sie die Küvette zweimal mit der Probe aus. Füllen Sie dann die Küvette etwa ? voll mit Probe. Wischen Sie die Außenseite der Küvette erneut ab, um sicherzustellen, dass sie sauber und frei von Fingerabdrücken ist.
Legen Sie die Küvette in der richtigen Ausrichtung in das Spektralphotometer und verschließen Sie den Deckel.
Erfassen Sie eine Absorptionsmessung oder ein Spektrum mit derselben Wellenlänge oder demselben Wellenlängenbereich wie der Rohling. Subtrahieren Sie das Blindspektrum oder die Messung, wenn das Gerät dies nicht automatisch tut.
Bestimmen Sie aus dem gesammelten Absorptionsspektrum das Absorptionsmaximum oder ?max.
Um die Menge an Analyt in der Probe zu quantifizieren, erstellen Sie eine Kalibrierungskurve unter Verwendung eines Bereichs bekannter Analytkonzentrationen. Weitere Informationen zum Erstellen und Verwenden einer Kalibrierkurve finden Sie im Video "Kalibrierkurven" dieser Sammlung.
Die Absorptionsmessung kann auch zur Berechnung der Reaktionskinetik verwendet werden, indem die Zunahme oder Abnahme der Konzentration einer Verbindung während der gesamten Reaktion gemessen wird. Beginnen Sie mit einer ersten Messung der Probe, in diesem Fall blauer Farbstoff, bei maximalem Absorptionsgrad vor der Reaktion.
Fügen Sie anschließend schnell das Reagenz hinzu, in diesem Fall Bleichmittel, um die chemische Reaktion zu starten. Rühren Sie es gut um, so dass es sich mit der Probe vermischt.
Messen Sie die Extinktion am Absorptionsmaximum über die Zeit.
Das anfängliche Absorptionsspektrum der blauen Farbstoffprobe ist dargestellt. Die Hintergrundfarben zeigen die Farben des Lichts im sichtbaren Spektrum. Der blaue Farbstoff hat ein Absorptionsmaximum bei etwa 630 nm.
Die Kinetik der Reaktion zwischen blauem Farbstoff und Bleiche wurde über die Zeit gemessen. Die Saugfähigkeit von blauem Farbstoff nimmt mit der Zeit ab, da er mit dem Bleichmittel reagiert. Die Absorption erreicht nach 300 s nahe Null, was darauf hindeutet, dass die Reaktion kurz vor dem Abschluss steht. Weitere Informationen zu Kinetik und Reaktionen finden Sie im JoVE Science Education Video "Reaction Rate Laws".
Die UV-Vis-Spektroskopie wird in vielen verschiedenen Forschungsbereichen stark eingesetzt, um eine Probe zu identifizieren oder zu quantifizieren.
So wird die UV-Vis-Spektroskopie beispielsweise in biologischen Bereichen stark eingesetzt, um die Menge an Protein in einer Probe zu quantifizieren. Ein Bradford-Assay wird häufig verwendet, um Proteine mit Hilfe eines Farbstoffs zu quantifizieren. Zunächst wird eine Kalibrierungskurve bekannter Proteinkonzentrationen erstellt, typischerweise unter Verwendung von Rinderserumalbumin oder BSA. Dann wird Coomassie-Blaufleck zu jedem der Standards und zur Probe hinzugefügt. Die Absorption des Protein-Farbstoff-Komplexes wird dann bei 595 nm gemessen.
Alternativ können Proteine direkt über ihre Absorption bei 280 nm gemessen werden. In diesem Beispiel wird die Proteinkonzentration mit einem Ultra-Low-Volume-Spektralphotometer quantifiziert. Bei vielen Proteinen entspricht eine Extinktion von 1 einer Konzentration von 1 mg/ml.
Die UV-Vis-Spektroskopie wird auch verwendet, um die Anzahl der Bakterienzellen in einer Zellkultur zu quantifizieren. Für diese Messung wird die Absorption, also die optische Dichte, bei 600 nm gemessen. Typischerweise zeigt eine OD600-Messung von 1 das Vorhandensein von 8 x 108 Bakterienzellen pro ml an. Die Messung der Zelldichte während des gesamten Kulturwachstums ermöglicht die Bestimmung der bakteriellen Wachstumskurve und kann helfen zu erkennen, wann sich eine Kultur in ihrer exponentiellen Wachstumsphase befindet.
Stickoxide und Stickstoffdioxid (NOx) sind ein Nebenprodukt von Autoabgasen und können schädlich für die Umwelt sein, da sie schädliches troposphärisches Ozon bilden. NOx kann gemessen werden, indem es mit einer Lösung aus Sulfanilsäure und Napthyl-Ethylendiamin umgesetzt wird. Die resultierende Lösung ist ein rosafarbenes Azofarbstoffmolekül, dessen Intensität direkt mit der NOx-Konzentration korreliert. Diese Konzentration kann dann mit einem UV-Vis-Spektralphotometer bestimmt werden.
Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die UV-sichtbare Spektroskopie gesehen. Sie sollten nun die Grundlagen des UV-Vis-Betriebs verstehen, wie man eine Probe mit einem UV-Vis misst und wie man die Absorption mit der Probenkonzentration korreliert.
Danke fürs Zuschauen!
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Q1: What happens when light passes through a sample in UV-Vis spectroscopy?
When light passes through a sample, some wavelengths are absorbed by molecules while others are transmitted. Transmission is the ratio of transmitted light intensity to incident light intensity. The absorbance, calculated as A = -log(T), indicates how much light the sample absorbed. This absorbance measurement forms the basis for both identifying compounds and quantifying their concentrations.
Q2: How does Beer's Law relate absorbance to sample concentration?
Beer's Law states that absorbance equals the molar attenuation coefficient multiplied by path length and concentration. The molar attenuation coefficient reflects a compound's ability to absorb light at a specific wavelength. Standard cuvettes have a 1 cm path length. This relationship allows you to calculate sample concentration if the absorptivity is known, or you can use calibration curves principles and applications to determine unknown concentrations.
Q3: Why does each molecule have a unique absorbance spectrum?
Each molecule's unique absorbance spectrum results from its distinct chemical structure, which determines the band gap—the energy difference between ground and excited states. When a photon's energy exactly matches this band gap, the molecule absorbs it and transitions to a higher energy state. Different molecular structures have different band gaps, producing characteristic absorbance patterns at specific wavelengths.
Q4: What equipment components select specific wavelengths in a UV-Vis spectrophotometer?
A monochromator separates wavelengths of light spatially and positions an exit slit where the desired wavelength emerges. Alternatively, filters can select specific wavelengths. Most spectrophotometers use a deuterium lamp for the UV range (170–375 nm) and a tungsten filament lamp for the visible range (350–2,500 nm). The monochromator can scan across wavelength ranges to generate complete absorbance spectra.
Q5: How do you prepare a sample and blank for UV-Vis measurement?
First, prepare a blank by filling a clean cuvette with sample solvent and wiping the outside with lint-free paper. Insert it into the spectrophotometer with grooved sides out of the beam path and secure the lid. Measure and record the blank's absorbance. Then rinse the cuvette twice with sample, fill it about three-quarters full, wipe it clean, and measure the sample's absorbance at the same wavelength. Subtract the blank measurement from the sample.
Q6: How can UV-Vis spectroscopy measure reaction kinetics?
Reaction kinetics are measured by taking repeated UV-Vis absorbance measurements at the absorbance maximum over time. Record an initial absorbance reading before the reaction begins. After adding the reagent and mixing, measure absorbance at regular intervals. As the reaction proceeds, changes in absorbance reflect changes in compound concentration, allowing you to track reaction progress and determine when completion occurs.
Q7: What are common laboratory applications of UV-Vis spectroscopy?
UV-Vis spectroscopy quantifies proteins using Bradford assays with Coomassie blue dye at 595 nm or direct protein absorbance at 280 nm. It measures bacterial cell density via optical density at 600 nm, where OD600 of 1 indicates approximately 8 × 10⁸ cells per mL. It also quantifies environmental pollutants like nitrogen oxides by measuring colored azo dye complexes. These applications demonstrate UV-Vis versatility across biological, environmental, and analytical fields.