JoVE Science Education

Environmental Sciences

Environmental Microbiology

Isolierung von fäkalen Bakterien aus Wasserproben durch Filtration

Isolation of Fecal Bacteria from Water Samples by Filtration

JoVE Science Education
Environmental Microbiology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Environmental Microbiology

Isolation of Fecal Bacteria from Water Samples by Filtration

2.6: Community DNA Extraction from Bacterial Colonies

2.13: Culturing and Enumerating Bacteria from Soil Samples

39,220 Views

•

10:58 min

•

April 30, 2023

Overview

Quelle: Labors von Dr. Ian Pfeffer und Dr. Charles Gerba – Arizona University
Demonstrierende Autor: Luisa Ikner

Die Qualität des Wassers für den Einsatz in Landwirtschaft, Freizeit- und inländischen Einstellungen bestimmt ist von großer Bedeutung wegen des Potentials für den Ausbruch von Wasser übertragenen Krankheit. Mikrobielle Mittel in solche Ereignisse verwickelt sind Parasiten, Bakterien und Viren, die Schuppen sind in hohen Stückzahlen in den Kot von infizierten Menschen und Tieren. Übertragung auf neue und anfällig für Hosts kann dann über den fäkal-oralen Weg nach Verschlucken von kontaminiertem Wasser auftreten. Daher ist die Fähigkeit, Wasser-Quellen auf das Vorhandensein von pathogenen Mikroorganismen überwachen erhebliche zur Sicherstellung der öffentlichen Gesundheit.

Durch die schiere Anzahl und Vielfalt potentieller fäkal-Oral-Erreger, die in Wasser und deren Variable Konzentrationen vorhanden sein können, ist es unpraktisch und teuer, um direkt für jeden einzelnen von ihnen in regelmäßigen Abständen zu überprüfen. Deshalb beschäftigen die mikrobiologische Assays für die Überwachung der Wasserqualität coliforme Indikatorbakterien. Coliformen umfassen, im Teil, der normale Darmflora von warmblütigen Säugetieren sind apathogen und sind konsequent in den Kot ausgeschieden. Daher bedeutet der Nachweis von coliformen Bakterien im Wasser, dass eine fäkale-Release stattgefunden, und schädliche pathogene Mikroorganismen auch vorhanden sein können.

Principles

Die Membran-Filtration-Technik wird verwendet, um die mikrobiologische Qualität des Wassers durch Prüfung für fäkale Indikatorbakterien zu beurteilen. Eine Menge Wasser (z.B. 100 mL) wird durch eine spezielle Membranfilter mit einer minimalen mittleren Porengröße von 0,45 µm, erleichtert die Erfassung von Bakterien, wie sie etwa 1 µm groß sind übergeben. Nach Filtration die Membrane ist sorgfältig auf einem spezialisierten Agarose-Nährmedium aufgebracht, und inkubiert unter den Bedingungen entsprechende Ziel Mikroorganismen Kultur.

Bei Anwendung für den Einsatz in der Überwachung der Wasserqualität ist die Membranfiltration ideal für geringe Trübung Quellen wie Trinkwasser, Schwimmbäder und natürliche Freizeit Gewässer wie Seen und Stauseen. Verschmutzung des Filters werden Gewässer reich an Feinstaub (z.B. Rohabwasser) führen; Daher, nur kleinere Mengen (z. B. 100 mL) analysiert werden kann. Membranfiltration ist auch nicht praktisch für Wasser-Quellen mit zahlreicher Hintergrund (oder nicht-Coliform) Bakterien, die die Schwierigkeit der aufzählen Ziel coliforme Bakterien auf die Agarose mittlere folgende Inkubation erhöhen können.

Dieses Video zeigt die Sammlung von Trinkwasser und Umweltschutz Wasserproben, die Membranfiltration von Proben und die Enumeration von mehreren Arten von fäkalen Indikator Bakterienkolonien mit spezialisierten Agarose Wachstumsmedien einschließlich insgesamt Coliformen, fäkalen Coliformen und fäkale Enterokokken. Weiter Tests durchgeführt, um sicherzustellen, dass die mutmaßliche Kolonien auch gezeigt werden.

Procedure

1. Wasser Probengewinnung und Verarbeitung

Mehrere 1-L-Wasserproben aus der Test-Wasser-Quelle zu sammeln (z. B. Brunnen, Schwimmbecken, Stauseen, Wasserverteilungssystemen, roh oder behandeltes Abwasser), und Verkehr auf dem Eis in das Labor zur mikrobiellen Analyse.
Sterilisieren Sie oder desinfizieren Sie die Membran-Filtration Verteileranordnung vor Nutzung durch Autoklavieren, Einwirkung von UV-Bestrahlung (2 min) oder Ethanol-Flamme-Zündung.
Verbinden Sie beim Abkühlen von allen Teilen richtig, Krümmer, eine Vakuumpumpe und Vakuum Filtration Abfall Flasche mit Bleichmittel.
Ethanol-Flamme ein paar Zangen und mit ihnen zu sterilisieren, steril, gerasterten Membranfilter aus der Verpackung nehmen. 47 mm im Durchmesser mit einer Porengröße von 0,45 µm Membranen sind in der Regel verwendet. Jedoch wechseln sich Durchmesser und Porengrößen eingesetzt werden, vorausgesetzt, dass die Porengröße kann die Ziel-Anmelder ausreichend verleiten, und mindestens 70 % der Filterfläche des Porenraumes besteht.
Setzen Sie den Filter auf die Mitte des Bereichs Membran Filtration des Verteilers, und gelten Sie einen Sterilfilter Trichter für das Gerät und sichern Sie ihn einrasten.
Gewünschten Wassermenge Test zu messen (z. B. 100 mL) und fügen sie Sie den Trichter (eine 100-mL-Linienmarkierung ist sichtbar auf den Trichter).
Wenden Sie ein teilweises Vakuum [Druckdifferenz von 34 bis 51 kPa (Kilopascal)] um die zu untersuchende Probe durch den Filter zu ziehen. Insgesamt ausgesetzt Vollmaterial, darunter Bakterien und verwesenden organischen Stoffen, größer als der Filter bedeuten von 0,45 µm Porengröße des Filters gefangen sind. Kleinere Partikel einschließlich Viren und gelöste Feststoffe wie geringe Mengen an organischer Substanz und Salze, passieren durch die Membran und in die Abfallbehälter Isolierflasche mit Bleichmittel.
Spülen Sie nach kompletten Durchgang der Probe durch den Filter das Innere des Trichters mit zwei bis drei 20-30 mL sterilem Wasser.
Schalten Sie das Vakuum und entfernen Sie den Trichter aus den Krümmer bei Abschluss des abschließenden Spülen.
Entfernen Sie mit Ethanol-Flamme sterilisierte Pinzette Membranfilter sofort aus dem Gerät und sofort auf die entsprechende Agarose Wachstumsmedium für die Ziel-Mikroorganismus (in Tabelle 1 sind die empfohlenen Medien und Inkubation Wachstumsbedingungen für jeden).
Gelten Sie die Membranfilter für die Agarose-Oberfläche mit einer Roll-Art-Bewegung zu kompletten Kontakt der Membran mit dem Nährmedium zu gewährleisten und um den Einschluss von Luftblasen zu vermeiden.
Ersetzen des verwendeten Filtration Trichters mit einer sterilen Einheit zwischen der Verarbeitung jeder einzelnen Probe und Ethanol-desinfizieren Sie die Edelstahl-Krümmer um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.

(2) Kolonie Enumeration

Entfernen Sie nach der Inkubationszeit die Wachstumsfugen aus dem Inkubator für die Aufzählung.
Idealerweise führen Sie die Kolonie zählt unter low-Power-Vergrößerung mit einer kühlen, weißen Lichtquelle.
Insgesamt coliformen
1. Insgesamt coliforme Kolonien sind in der Regel rosa bis dunkelrot in der Farbe mit einem metallischen Oberflächenglanz. Der Glanz selbst kann die Kolonie ganz oder teilweise abdecken. Atypische insgesamt Coliformen Kolonie Morphologien möglicherweise dunkelrot, schleimigen oder kernhaltigen ohne Glanz.
2. Kolonien, die rosa, blau, weiß oder farblos beim ermangeln Glanz gelten als nicht-Coliformen.
Fäkalen coliformen
1. Fäkale coliforme Kolonien erscheinen verschiedene Schattierungen von blau.
2. Nonfecal coliforme Kolonien sind grau bis Creme in der Farbe.
Fäkale Enterokokken
1. Fäkale Enterokokken Kolonien reichen von rosa bis dunkelrot in der Farbe.

(3) Kolonie Überprüfung

Insgesamt coliformen
1. Wischen Sie für eine Überprüfung der Anwesenheit-Abwesenheit die gesamte Membran mit einer sterilen Impfkeimen Schleife. Für Kolonien empfiehlt es sich, mindestens je fünf typischen und atypischen Morphologien zu überprüfen.
2. Übertragen Sie die ausgewählten Kolonie in ein Glasgefäß mit Natriumlaurylsulfat Tryptose Brühe mit einem Durham Schlauch. Inkubieren Sie die beimpften Röhrchen bei 35±0.5 ° C für 48 h. Das Vorhandensein von Trübung zeigt Wachstum in Verbindung mit Gas-Produktion wird die Kolonie als eine Coliform überprüft.
Fäkalen coliformen
1. Übertragen Sie Kolonien in der Farbe Blau in Glasgefäße mit sterilen EG-Medium mit einem Schlauch Durham aseptisch. Inkubieren Sie die beimpften Röhrchen bei 44,5 ± 0,2 ° C für 24 h. Das Vorhandensein von Trübung zeigt Wachstum in Verbindung mit Gas-Produktion wird die Kolonie als eine fäkale Coliform überprüft.
Fäkale Enterokokken
1. Streik der Kolonien Typisierung fäkale Enterokokken Morphologie für die Isolierung aseptisch auf Gehirn-Herz Infusion Agar (BHIA) und inkubieren Sie bei 35 ± 0,5 ° C für 24 bis 48 h.
2. Übertragen Sie Wachstum aus einer isolierten Kolonie auf BHIA auf zwei vorgereinigten Objektträger.
3. Fügen Sie zwei bis drei Tropfen von 3 % Wasserstoffperoxid hinzu bereit Abstriche auf den Folien. Das schnelle erscheinen der Bläschen zeigt ein Ergebnis “Katalase positiv”, und die Isolierung ist keine fäkale Streptokokken-Bakterien.
4. Führen Sie eine Gram-Färbung Isolate testen als “Katalase negativ” (keine Bläschen beobachtet). Fäkale Enterokokken sind gram-positive, eiförmig und erscheinen meist in Paaren oder kurzen Ketten.

Fäkale bakterielle Indikator	Empfohlene Medien (Inkubationstemperatur, Zeit) ¹
Insgesamt coliformen	LES Endo Agar (35 ± 5 ° C, 24 h) M-Endo-Medium (35 ± 5 ° C, 24 h)
Fäkalen coliformen	m-FC Medium (44,5 ± 0,2 ° C, 24 h)
Fäkale Enterokokken	m Enterococcus Agar (35 ± 0,5 ° C, 48 h)

Tabelle 1. Häufig verwendete Wachstum Nährmedien für die Erkennung von fäkalen Bakterien Indikatoren in Umweltproben
¹ Empfehlung der Standardmethoden für die Prüfung von Wasser und Abwasser (American Public Health Asssociation und American Water Works Association, 22^Nd Edition, 2012)

Membranfiltration und die anschließende Kultivierung von Bakterien gesammelt ist eine nützliche Technik zur Beurteilung der Qualität und Sauberkeit der Wasserquelle.

Die Qualität des Wassers für den Einsatz in Landwirtschaft, Freizeit oder inländischen Einstellungen bestimmt ist von großer Bedeutung, aufgrund des Potenzials für den Ausbruch von Wasser übertragenen Krankheit. Wenn Wasser mit Fäkalien von Tieren oder Menschen verschmutzt ist, können pathogene Parasiten, Bakterien oder Viren zu neuen Hosts auf ihre Einnahme verteilt werden. Wasser-Quellen für solche krankheitsverursachende Organismen die Überwachung ist daher entscheidend für die öffentliche Gesundheit zu gewährleisten.

Die schiere Anzahl und Vielfalt der fäkal-orale Krankheitserreger, die möglicherweise in einer Wasser-Quelle vorhanden ist es unpraktisch, für jede selbstständig und in regelmäßigen Abständen zu überprüfen. Stattdessen nutzen gemeinsame mikrobiologische Tests für Wasserqualität coliforme Indikatorbakterien. Weitere Informationen zu diesem Prozess finden Sie unter dieser Sammlung Video auf Indikatororganismen.

Dieses Video wird veranschaulichen den Prozess der Membranfiltration auf eine ökologische Wasserprobe, zeigen, wie verschiedene Arten von fäkalen Indikatorbakterien einschließlich insgesamt Coliformen, fäkalen Coliformen und fäkale Entercocci Kultur, und beschreiben, wie das Vorhandensein der fäkale Verunreinigungen überprüfen.

Membran-Filtration-Technik nutzt Unterdruck an Wasserproben über einen Filter und Trap Bakterien zu zeichnen. Der Filter ist eine spezielle Membran mit einer minimalen mittlere Porengröße von 0,45 µm, die die Erfassung von Bakterien, kann die in der Regel ca. 1 µm groß sind. Nach der Filtration ist die Membran auf Agarose Wachstumsmedien angewendet und Konditionen entsprechende Ziel Mikroorganismen Kultur inkubiert.

Diese Technik eignet sich am besten für geringe Trübung Quellen wie Trinkwasser, Schwimmbäder, oder Seen und Stauseen. Wasser reich an Feinstaub Inhalt kann dazu führen, Verschmutzung oder Verstopfung des Filters, Begrenzung des Volumens, die verarbeitet werden können. Darüber hinaus ist Membranfiltration nicht praktisch für Wasser-Quellen, die große Anzahl von Hintergrund oder nicht-Coliform Bakterien, wie rohes Abwasser enthalten, wie dies die Schwierigkeit der Aufzählung Ziel Coliformen auf Kultur und Inkubation erhöhen kann.

Sobald bakterielle Proben im Filter eingeschlossen wurden, können sie an Wachstumsfugen, die Arten von Kennzeichen Bakterien in Wasserproben bestimmen übertragen. Beschichtung auf verschiedenen Medien-Typen für verschiedene bakterielle wählt und für schnelle Identifizierung erlauben.

Nach einem Wachstum auf Kultur spezifische Platten kann weitere Bestätigung der Indikator Bakterien Identitäten durchgeführt werden mit Techniken wie Kommissionierung Kolonien in flüssigen Medien und Durham-Röhrchen für Gase, die nur in Anwesenheit von fäkalen Coliformen oder insgesamt Coliformen erzeugt werden soll, zu erfassen. Darüber hinaus können verdächtige fäkale Enterokokken durch eine Kombination von einem positiven Gramfärbung, zusammen mit einem negativen Wasserstoff-Peroxid-Katalase-Test bestätigt werden.

Jetzt sind wir vertraut mit den Prinzipien, die hinter der Membranfiltration von Wasserproben, werfen Sie einen Blick auf wie dieses Verfahren durchgeführt wird.

Um den Vorgang zu starten, zuerst sammeln Sie Wasserproben aus Test Wasserquellen von Interesse. Sicherstellen Sie, dass die Proben in sterilen 1-L-Flaschen gesammelt werden. Sobald die Sammlung abgeschlossen ist, die Proben auf Eis gelegt, und transportieren sie an das Labor zur mikrobiellen Analyse.

Um die Analyse zu starten, zunächst sterilisieren Sie einen Membran-Filtration-Verteiler. Schließen Sie als nächstes, Krümmer, eine Vakuumpumpe und Filtration Abfall Flasche mit Bleichmittel.

Ethanol Flamme-sterilisieren Zange und eine sterile gerasterten Membran aus der Verpackung nehmen. Setzen Sie den Filter auf die Mitte des Bereichs Membran Filtration des Verteilers, und wenden Sie einen Sterilfilter Trichter auf das Gerät an, dann befestigen.

Messen Sie eine gewünschte Lautstärke Test Wasser in den Trichter. Wenden Sie ein teilweises Vakuum ziehen die zu untersuchende Probe durch den Filter an. Abgehängte Vollmaterial, darunter Bakterien und andere organische Stoffe, die größer als 0,45 μm auf oder innerhalb des Filters, während kleinere Partikel, Viren, eingeklemmt wird und gelöste Feststoffe passieren obwohl in die Abfälle Flasche mit Bleichmittel.

Nachdem die Probe durch den Filter durchlaufen hat, spülen Sie das Innere des Trichters mit 25 mL sterilem Wasser 3mal, ermöglicht dies durch den Filter passieren. Wenn die Schlussspülung abgeschlossen ist, trennen Sie das Vakuum und entfernen Sie den Trichter aus dem Verteiler.

Als nächstes Ethanol Flamme-sterilisieren Zange und Membranfilter sofort aus dem Gerät entfernen. Legen Sie es auf der entsprechenden Wachstumsfuge für das Ziel Mikroorganismus mit einer Rollbewegung zu vollständigen Kontakt mit der Oberfläche zu gewährleisten und einfangen von Luftblasen zu vermeiden.

Desinfizieren Sie für die Verarbeitung von jeder weiteren Probe die Edelstahl-Krümmer und verwenden Sie einen sterilen Trichter, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Schließlich legen Sie die Platten in einem Inkubator für die geeignete Inkubationszeit.

Entfernen Sie nach der Inkubationszeit die Platten aus dem Inkubator für die Aufzählung. Führen Sie nach Möglichkeit die Kolonie zählt unter low-Power-Vergrößerung mit einer kühlen weißen Lichtquelle. Insgesamt Coliformen bestimmen, identifizieren und Kolonien, die erscheinen rosa bis dunkelrot in der Farbe und haben einen metallischen Oberflächenglanz ganz oder teilweise für die Kolonie zu zählen. Atypische insgesamt coliforme Kolonien erscheinen dunkel rot, Mucoid oder kernhaltige ohne Glanz.

Kolonien, die blau, weiß, farblos oder rosa ohne Glanz erscheinen gelten als nicht-Coliformen und sollte nicht in der Anzahl der insgesamt Coliformen aufgenommen werden.

Fäkale coliforme Kolonien erscheinen als verschiedene Schattierungen von blau, und diese als eigene Kategorie gezählt werden soll. Non-fäkale coliforme Kolonien sind in der Regel grau bis Creme in der Farbe und sollte auch in eine einzelne Kategorie aufgenommen werden. Zu guter Letzt fäkale Enterokokken Kolonien werden reicht von rosa bis dunkelrot in der Farbe und separat gezählt werden soll.

Überprüfen Sie insgesamt coliforme Kolonien, gelten Sie eine sterilisierte und gekühlten Impfkeimen Schleife für eine einzige Kolonie von Interesse. Übertragen Sie die ausgewählten Kolonie in ein Glasgefäß mit Natriumlaurylsulfat Tryptose Brühe und einem Durham Rohr. Als Nächstes platzieren Sie die Kulturen in einem Inkubator. Das Vorhandensein von Trübung zusammen mit Gas-Produktion von Durham Röhre gefangen überprüft die Kolonie als eine totale Coliform.

Für fäkale coliforme Überprüfung, aseptisch Kolonien in der Farbe Blau in Glasgefäße mit sterilen EG Medium und einem Durham Rohr übertragen. Legen Sie die beimpften Röhrchen in einen Inkubator. Nach der Inkubation, trübe inoculates in Verbindung mit Gas Produktion bestätigen die Kolonie eine fäkale Coliform sein.

Fäkale Enterokokken bestätigen, aseptisch übertragen Sie verdächtige Kolonien mit den korrekte Morphologie auf Gehirn-Herz Infusion Agarplatten und inkubieren. Als nächstes übertragen Sie Wachstum aus einer isolierten Kolonie auf BHIA auf zwei sterilen Objektträger.

Hinzufügen eines Glas-Objektträger 2-3 Tropfen von 3 % Wasserstoffperoxid. Rapid Gas-Produktion zeigt ein Katalase-positiv Bakterium wie Citrobacter. Fäkale Enterokokken Bakterien sind Katalase negativ; Daher wird keine Blasenbildung beobachtet. Katalase-Negative Kolonien, die Anzeigen nicht sprudeln, führen Sie eine Gram-Färbung. Als fäkale Enterokokken sollte diese Gram positiv, eiförmig in der Form erscheinen und werden gruppiert, meist in Paaren oder kurzen Ketten.

Alle diese Indikatorbakterien in eine Wasserquelle zu finden, zeigt das Vorhandensein des Befalls. Wenn mehr als 5 % der Proben gefunden werden über einen 1-Monats-Zeitraum belastet, kann die Quelle für den menschlichen Verzehr ungeeignet angesehen werden.

Membranfiltration wird häufig in einer Reihe von Anwendungen in der Biologie verwendet, und fäkale Indikator-Organismen können auch durch andere experimentelle Verfahren nachgewiesen werden. Einige dieser Anwendungen werden hier untersucht.

Membranfiltration kann auch in Virus-Capture von Wasserproben verwendet werden. Wie Viren in der Regel auf sehr niedrigem Niveau vorhanden werden, müssen Wasserproben konzentriert werden, um sie für die Analyse zu erfassen. Aufgenommene Viren können dann vom Filter freigegeben werden und identifiziert mit Hilfe von Techniken wie Zelle Kultur Infektiosität Assays oder PCR.

Membranfiltration wird auch in der Produktion von hochreinem Wasser für Industrie und Labor genutzt. Viele Branchen erfordern hoch gereinigtes Wasser für ihre betrieblichen Abläufe und Membranfiltration kann dazu dienen, Schadstoffe, einschließlich unerwünschter gelösten Metalle und Salze aus dem Wasser zu entfernen. Es kann auch in die Entsalzung von Meerwasser verwendet werden, um Trinkwasser zu produzieren.

Sie habe nur Jupiters Einführung zur Identifizierung von Indikator-Organismen im Wasser durch Membranfiltration beobachtet. Sie sollten jetzt wissen, wie man Membran Filter Wasserproben, wie man verschiedene Arten von fäkalen Indikatorbakterien aus der Membran Kultur und wie Sie diese als Indikator-Organismen bestätigen. Danke fürs Zuschauen!

Applications and Summary

Membranfiltration wird in Virus-Abscheidung und Konzentration von Wasser verwendet. Menschliche pathogene Viren tragen eine negative Nettoladung in aquatischen Lösungen und sind häufig auf einem niedrigen Niveau in Wasserquellen. Daher müssen sie vor der Analyse konzentriert werden. Membranfiltration ist aber ein Capture-Methode für diesen Zweck und beschäftigt einen negativ geladenen Filter. Wasserproben (z. B. 1-L) von Interesse mit einer Salzlösung geändert werden (zB. Magnesiumchlorid) vermitteln eine positive Ladung, die Viren, die Adsorption an den negativ geladenen HA Membranfilter dadurch zu erleichtern, da das Wasser gefiltert wird. Eine niedrige Konzentration saure Lösung dient zum Spülen der Membran und loszuwerden überschüssige Salze. Eine niedrige Konzentration und Volumen der Natronlauge wird dann verwendet, um die Viren aus dem Filter vor weitere Konzentrationen und Analysen (z.B. Zelle Kultur Infektiosität Assays oder quantitative PCR) freizugeben.

Membranfiltration wird auch bei der Herstellung von hochreinem Wasser für den industriellen Einsatz genutzt. Viele Branchen erfordern hoch gereinigtes Wasser für ihre betrieblichen Abläufe. Membranfiltration (z.B. Nano-Filtration) dient dazu, die Verunreinigungen einschließlich der gelösten Metalle zu entfernen und Salze aus dem Wasser. Membranfiltration dient auch in der Entsalzung von Meerwasser um zu Trinkwasser zu produzieren.

Transcript

Membrane filtration and the subsequent culturing of bacteria collected is a useful technique to assess the quality and cleanliness of a water source.

The quality of water destined for use in agricultural, recreational, or domestic settings is of great importance, due to the potential for outbreaks of waterborne disease. If water is contaminated with fecal matter from animals or humans, then pathogenic parasites, bacteria, or viruses may be spread to new hosts upon their ingestion. Monitoring water sources for such disease-causing organisms is therefore critical to ensure public health.

The sheer number and variety of fecal-oral pathogens that may be present in a water source makes it impractical to assay for each independently and on a regular basis. Instead, common microbiological assays for water quality utilize coliform indicator bacteria. For more information on this process, see this collection’s video on indicator organisms.

This video will illustrate the process of membrane filtration on an environmental water sample, demonstrate how to culture several types of fecal indicator bacteria including total coliforms, fecal coliforms, and fecal entercocci, and describe how to verify the presence of fecal contamination.

Membrane filtration technique utilizes negative pressure to draw water samples across a filter and trap bacteria. The filter is a specialized membrane with a minimal mean pore size of 0.45 μm that allows the capture of bacteria, which are typically around 1 μm in size. After filtration, the membrane is applied to agarose growth media, and incubated at conditions appropriate to culture the target microorganisms.

This technique is most ideal for low turbidity sources such as drinking water, swimming pools, or lakes and reservoirs. Water high in particulate matter content can result in fouling or clogging of the filter, limiting the volume that can be processed. Additionally, membrane filtration is not practical for water sources containing large numbers of background, or non-coliform bacteria, like raw sewage, as this can increase the difficulty of enumerating target coliforms upon culture and incubation.

Once bacterial samples have been trapped in the filter, they can be transferred to growth plates to determine the types of indicator bacteria present in the water samples. Plating on different media types selects for different bacterial types, and can allow for rapid identification.

After growth on culture specific plates, further confirmation of indicator bacteria identities can be carried out using techniques such as picking colonies into liquid media and using Durham tubes to capture gases, which should only be produced in the presence of fecal coliforms or total coliforms. Additionally, suspected fecal enterococci can be confirmed by a combination of a positive Gram staining, along with a negative hydrogen peroxide-catalase test.

Now that we are familiar with the principles behind the membrane filtration of water samples, let’s take a look at how this procedure is carried out.

To begin the procedure, first collect water samples from test water sources of interest. Ensure the samples are collected in sterile 1-L bottles. Once collection is complete, put the samples on ice, and transport them to the laboratory for microbial analysis.

To begin the analysis, first sterilize a membrane filtration manifold. Next, connect the manifold to a vacuum pump and filtration waste flask containing bleach.

Ethanol flame-sterilize forceps and remove a sterile gridded membrane from the packaging. Place the filter onto the center of the membrane filtration area of the manifold, and apply a sterile filter funnel to the unit, then secure in place.

Measure out a desired volume of test water into the funnel. Apply a partial vacuum to draw the test sample through the filter. Suspended solid material, including bacteria and other organic matter, greater than 0.45 μm will be trapped on or within the filter, while smaller particles, viruses, and dissolved solids will pass though into the waste flask containing bleach.

After the sample has passed through the filter, rinse the interior of the funnel with 25 mL of sterile water 3 times, allowing this to pass through the filter. When the final rinse is complete, disconnect the vacuum and remove the funnel from the manifold.

Next, ethanol flame-sterilize forceps and immediately remove the membrane filter from the unit. Place it onto the appropriate growth plate for the target microorganism using a rolling motion to ensure complete contact with the surface and avoid trapping air bubbles.

For the processing of each further sample, sanitize the stainless steel manifold and use a sterile funnel to prevent cross contamination. Finally, place the plates into an incubator for the appropriate incubation period.

Following the incubation period, remove the plates from the incubator for enumeration. If possible, perform the colony counts under low power magnification using a cool white light source. To determine total coliforms, identify and count colonies that appear pink to dark red in color, and have a metallic surface sheen fully or partially covering the colony. Atypical total coliform colonies may appear dark red, mucoid, or nucleated without sheen.

Colonies that appear blue, white, colorless, or pink without sheen are considered non-coliforms, and should not be included in the total coliforms count.

Fecal coliform colonies will appear as various shades of blue, and these should be counted as a separate category. Non-fecal coliform colonies are typically grey to cream in color, and should also be recorded in an individual category. Finally, fecal enterococci colonies will range from pink to dark red in color and should be counted separately.

To verify total coliform colonies, apply a sterilized and cooled inoculating loop to a single colony of interest. Transfer the selected colony into a glass vessel containing lauryl tryptose broth and a Durham tube. Next, place the cultures into an incubator. The presence of turbidity along with gas production captured by the Durham tube verifies the colony as a total coliform.

For fecal coliform verification, aseptically transfer colonies blue in color into glass vessels containing sterile EC medium and a Durham tube. Place the inoculated tubes into an incubator. After incubation, turbid inoculates in conjunction with gas production confirm the colony to be a fecal coliform.

To confirm fecal enterococci, aseptically transfer suspected colonies with the correct morphology onto Brain-Heart Infusion Agar plates, and incubate. Next, transfer growth from an isolated colony on BHIA onto two sterile glass slides.

Add 2-3 drops of 3% hydrogen peroxide to one of the glass slides. Rapid gas production indicates a catalase-positive bacterium such as Citrobacter. Fecal enterococci bacteria are catalase negative; therefore, no bubbling is observed. For catalase-negative colonies that don’t display bubbling, perform a Gram stain. As fecal enterococci, these should appear Gram positive, ovoid in shape, and be grouped mostly in pairs or short chains.

Finding any of these indicator bacteria in a water source indicates the presence of a contamination. If more than 5% of samples are found to be contaminated over a one-month period, the source may be considered unfit for human consumption.

Membrane filtration is commonly used in a number of biological applications, and fecal indicator organisms can also be detected by other experimental procedures. Some of these applications are explored here.

Membrane filtration can also be used in virus capture from water samples. As viruses will typically be present at very low levels, water samples must be concentrated in order to capture them for analysis. Captured viruses can then be released from the filters, and identified using techniques such as cell culture infectivity assays or PCR.

Membrane filtration is also utilized in the production of high purity water for industrial or laboratory use. Many industries require highly purified water for their operational processes, and membrane filtration can serve to remove contaminants, including unwanted dissolved metals and salts from water. It can also be used in the desalination of salt water to produce potable water.

You’ve just watched JoVE’s introduction to identifying indicator organisms in water by membrane filtration. You should now understand how to membrane filter water samples, how to culture several types of fecal indicator bacteria from the membrane, and how to confirm these as indicator organisms. Thanks for watching!