Isolierung von fäkalen Bakterien aus Wasserproben durch Filtration

1. Wasser Probengewinnung und Verarbeitung

1. Mehrere 1-L-Wasserproben aus der Test-Wasser-Quelle zu sammeln (z. B. Brunnen, Schwimmbecken, Stauseen, Wasserverteilungssystemen, roh oder behandeltes Abwasser), und Verkehr auf dem Eis in das Labor zur mikrobiellen Analyse.
2. Sterilisieren Sie oder desinfizieren Sie die Membran-Filtration Verteileranordnung vor Nutzung durch Autoklavieren, Einwirkung von UV-Bestrahlung (2 min) oder Ethanol-Flamme-Zündung.
3. Verbinden Sie beim Abkühlen von allen Teilen richtig, Krümmer, eine Vakuumpumpe und Vakuum Filtration Abfall Flasche mit Bleichmittel.
4. Ethanol-Flamme ein paar Zangen und mit ihnen zu sterilisieren, steril, gerasterten Membranfilter aus der Verpackung nehmen. 47 mm im Durchmesser mit einer Porengröße von 0,45 µm Membranen sind in der Regel verwendet. Jedoch wechseln sich Durchmesser und Porengrößen eingesetzt werden, vorausgesetzt, dass die Porengröße kann die Ziel-Anmelder ausreichend verleiten, und mindestens 70 % der Filterfläche des Porenraumes besteht.
5. Setzen Sie den Filter auf die Mitte des Bereichs Membran Filtration des Verteilers, und gelten Sie einen Sterilfilter Trichter für das Gerät und sichern Sie ihn einrasten.
6. Gewünschten Wassermenge Test zu messen (z. B. 100 mL) und fügen sie Sie den Trichter (eine 100-mL-Linienmarkierung ist sichtbar auf den Trichter).
7. Wenden Sie ein teilweises Vakuum [Druckdifferenz von 34 bis 51 kPa (Kilopascal)] um die zu untersuchende Probe durch den Filter zu ziehen. Insgesamt ausgesetzt Vollmaterial, darunter Bakterien und verwesenden organischen Stoffen, größer als der Filter bedeuten von 0,45 µm Porengröße des Filters gefangen sind. Kleinere Partikel einschließlich Viren und gelöste Feststoffe wie geringe Mengen an organischer Substanz und Salze, passieren durch die Membran und in die Abfallbehälter Isolierflasche mit Bleichmittel.
8. Spülen Sie nach kompletten Durchgang der Probe durch den Filter das Innere des Trichters mit zwei bis drei 20-30 mL sterilem Wasser.
9. Schalten Sie das Vakuum und entfernen Sie den Trichter aus den Krümmer bei Abschluss des abschließenden Spülen.
10. Entfernen Sie mit Ethanol-Flamme sterilisierte Pinzette Membranfilter sofort aus dem Gerät und sofort auf die entsprechende Agarose Wachstumsmedium für die Ziel-Mikroorganismus (in Tabelle 1 sind die empfohlenen Medien und Inkubation Wachstumsbedingungen für jeden).
11. Gelten Sie die Membranfilter für die Agarose-Oberfläche mit einer Roll-Art-Bewegung zu kompletten Kontakt der Membran mit dem Nährmedium zu gewährleisten und um den Einschluss von Luftblasen zu vermeiden.
12. Ersetzen des verwendeten Filtration Trichters mit einer sterilen Einheit zwischen der Verarbeitung jeder einzelnen Probe und Ethanol-desinfizieren Sie die Edelstahl-Krümmer um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.

(2) Kolonie Enumeration

1. Entfernen Sie nach der Inkubationszeit die Wachstumsfugen aus dem Inkubator für die Aufzählung.
2. Idealerweise führen Sie die Kolonie zählt unter low-Power-Vergrößerung mit einer kühlen, weißen Lichtquelle.
3. Insgesamt coliformen
   1. Insgesamt coliforme Kolonien sind in der Regel rosa bis dunkelrot in der Farbe mit einem metallischen Oberflächenglanz. Der Glanz selbst kann die Kolonie ganz oder teilweise abdecken. Atypische insgesamt Coliformen Kolonie Morphologien möglicherweise dunkelrot, schleimigen oder kernhaltigen ohne Glanz.
   2. Kolonien, die rosa, blau, weiß oder farblos beim ermangeln Glanz gelten als nicht-Coliformen.
4. Fäkalen coliformen
   1. Fäkale coliforme Kolonien erscheinen verschiedene Schattierungen von blau.
   2. Nonfecal coliforme Kolonien sind grau bis Creme in der Farbe.
5. Fäkale Enterokokken
   1. Fäkale Enterokokken Kolonien reichen von rosa bis dunkelrot in der Farbe.

(3) Kolonie Überprüfung

1. Insgesamt coliformen
   1. Wischen Sie für eine Überprüfung der Anwesenheit-Abwesenheit die gesamte Membran mit einer sterilen Impfkeimen Schleife. Für Kolonien empfiehlt es sich, mindestens je fünf typischen und atypischen Morphologien zu überprüfen.
   2. Übertragen Sie die ausgewählten Kolonie in ein Glasgefäß mit Natriumlaurylsulfat Tryptose Brühe mit einem Durham Schlauch. Inkubieren Sie die beimpften Röhrchen bei 35±0.5 ° C für 48 h. Das Vorhandensein von Trübung zeigt Wachstum in Verbindung mit Gas-Produktion wird die Kolonie als eine Coliform überprüft.
2. Fäkalen coliformen
   1. Übertragen Sie Kolonien in der Farbe Blau in Glasgefäße mit sterilen EG-Medium mit einem Schlauch Durham aseptisch. Inkubieren Sie die beimpften Röhrchen bei 44,5 ± 0,2 ° C für 24 h. Das Vorhandensein von Trübung zeigt Wachstum in Verbindung mit Gas-Produktion wird die Kolonie als eine fäkale Coliform überprüft.
3. Fäkale Enterokokken
   1. Streik der Kolonien Typisierung fäkale Enterokokken Morphologie für die Isolierung aseptisch auf Gehirn-Herz Infusion Agar (BHIA) und inkubieren Sie bei 35 ± 0,5 ° C für 24 bis 48 h.
   2. Übertragen Sie Wachstum aus einer isolierten Kolonie auf BHIA auf zwei vorgereinigten Objektträger.
   3. Fügen Sie zwei bis drei Tropfen von 3 % Wasserstoffperoxid hinzu bereit Abstriche auf den Folien. Das schnelle erscheinen der Bläschen zeigt ein Ergebnis "Katalase positiv", und die Isolierung ist keine fäkale Streptokokken-Bakterien.
   4. Führen Sie eine Gram-Färbung Isolate testen als "Katalase negativ" (keine Bläschen beobachtet). Fäkale Enterokokken sind gram-positive, eiförmig und erscheinen meist in Paaren oder kurzen Ketten.

Fäkale bakterielle Indikator	Empfohlene Medien (Inkubationstemperatur, Zeit) 1
Insgesamt coliformen	LES Endo Agar (35 ± 5 ° C, 24 h) M-Endo-Medium (35 ± 5 ° C, 24 h)
Fäkalen coliformen	m-FC Medium (44,5 ± 0,2 ° C, 24 h)
Fäkale Enterokokken	m Enterococcus Agar (35 ± 0,5 ° C, 48 h)

Tabelle 1. Häufig verwendete Wachstum Nährmedien für die Erkennung von fäkalen Bakterien Indikatoren in Umweltproben
¹ Empfehlung der Standardmethoden für die Prüfung von Wasser und Abwasser (American Public Health Asssociation und American Water Works Association, 22^Nd Edition, 2012)