2.14: Säulenchromatographie

(1) Kieselgel Gülle

1. Gießen Sie das Silica-Gel in einen Erlenmeyerkolben. Das Gewicht des Verpackungsmaterials sollte etwa 50 x die Probe getrennt zu sein. Wenn die Verbindungen getrennt sehr ähnliche R_f -Werte haben, kann dann es erforderlich, mit einer größeren Menge an Kieselsäure pro Probe, die in diesem Beispiel der Fall ist.
   1. Platz 10 g Kieselsäure in den Erlenmeyerkolben, da 50 mg der Probe (45 mg Fluorenone und 5 mg Tetraphenylporphyrin) sind isoliert.
2. Fügen Sie die Lösungsmittelsystem (Hexan/Dichlormethan, 70 %: 30 %) in den Erlenmeyer-Kolben mit Silica-Gel. Fügen Sie genügend Lösungsmittel um sicherzustellen, dass all das Silica-Gel ist gut solvatisierte. Die Kieselsäure löst sich nicht, aber die Mischung wird visuell wahrnehmbar sein, wenn solvatisierte. Nachdem das Lösungsmittel hinzugefügt wurde wirbeln Sie Erlenmeyerkolben um sicherzustellen, dass all die Kieselsäure ist gut solvatisierte.

2. Vorbereitung der Spalte

1. Wählen Sie die entsprechend dimensionierte Spalte. Die Spalte sollte in der Regel etwa auf halbem Weg mit Kieselgel Gülle gefüllt werden. Je größer die Stichprobe, geläutert, je größer die Spalte erforderlich.
2. Stecken Sie den unteren Rand der Spalte mit einem Stück Glaswolle. Mit einem langen Stab, stellen Sie sicher, dass die Wolle fest in den unteren Rand der Spalte oberhalb der Absperrhahn gestellt wird.
3. Sobald die Wolle fest vorhanden ist, wenden Sie eine dünne Schicht von Sand über die Glaswolle.
   Hinweis: Wenn die Spalte mit einer Glasfritte oberhalb der Absperrhahn ausgestattet ist, sollte dieser Schritt ausgelassen werden.
4. Klemmen Sie die Spalte in die vertikale Position zu einem Ring Stand.
5. Mit einem Trichter, vorsichtig gießen Sie die vorbereiteten Brei aus Silica-Gel in die Spalte. Sie müssen möglicherweise zusätzliche Lösungsmittel um die Gülle aus dem Erlenmeyerkolben auf der Spalte zu übertragen hinzufügen. Mit einer Pipette, waschen Sie unten Silica-Gel, das an den Seiten der Spalte klebt.
   1. Da das Silica-Gel in der Spalte absetzen, klopfen Sie leicht die Seiten der Spalte um sicherzustellen, dass das Silica-Gel fest packt und eventuelle Luftblasen schließt.
6. Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie Lösungsmittel in einem sauberen Erlenmeyerkolben bis kurz vor das Silica-Gel und das Lösungsmittel vorderen Treffen ablaufen. Die Silica-Gel sollte nie austrocknen, bis das Verfahren abgeschlossen ist.
7. Legen Sie eine dünne Schicht des Sandes auf das Silica-Gel (Abbildung 1). Mit einer Pipette, waschen Sie unten keinen Sand, die zu den Seiten der Spalte stecken haben kann.
8. Lassen Sie keine zusätzlichen Lösungsmittel, bis der Sand trocken ist, aber nicht bis auf die Silica-Gel-Schicht.

Abbildung 1. Das richtige Setup für eine Säulenchromatographie experimentieren vor der Zugabe der Probe.

(3) Zugabe der Probe auf die Säule

1. Auflösen der Probe in die kleinste Menge des Lösungsmittels möglich (unter Verwendung der gleichen Lösungsmittel, das verwendet wurde, um die Silica-Gel-Gülle machen).
2. Fügen Sie die Probe mit einer Pipette hinzu, sanft an die Spitze der Säule werden.
3. Sobald die Probe an die Spitze der Spalte angewendet wurde, öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie das Lösungsmittel durch die Sandschicht aber nicht die Silica-Gel-Schicht abtropfen. Verwenden Sie eine sehr kleine Menge des Lösungsmittels, waschen Sie jede Probe, die an den Seiten der Spalte klammerte sich haben kann. Diese zusätzliche Lösungsmittel durch die Sandschicht sowie ablassen.

(4) beschichtete Probe durch die Spalte

1. Mit einer Pipette, sehr sanft fügen Sie 4 – 5 mL des Lösungsmittels in einer Weise, die die Sandschicht nicht stört hinzu.
2. Setzen Sie einen Trichter am oberen Rand der Spalte und sehr langsam und sanft, füllen Sie den Rest der Spalte mit Lösungsmittel.
3. Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie das Lösungsmittel durch die Säule ablaufen.
4. Begin die mobile Phase zu sammeln, wie er aus der Spalte in Reagenzgläsern entwässert.
   1. Reagenzgläser sollten in einer sequenziellen Weise in einem Reagenzglas Rack platziert werden.
5. Fügen Sie zusätzliche Lösungsmittel an die Spitze der Säule, wie nötig, bis alle gewünschten Verbindungen von der Säule eluiert haben.

(5) erholt sich die Bestandteile

1. Wenn die Verbindungen farbig sind, können dann sie visuell identifiziert werden. Jedoch wenn die Verbindungen farblos sind, müssen sie mit Ulta-sichtbar (UV) Licht (wenn die Verbindungen Konjugation enthalten) identifiziert werden oder mit den entsprechenden Fleck. Die Reinheit der Verbindungen kann mit Dünnschichtchromatographie überprüft werden.
2. Identifizieren Sie die Reagenzgläser, die die gewünschte widerrufen enthalten.
3. Zusammenführen Sie aller Fraktionen, die die gewünschten isolierten widerrufen in ein vorgewogene Rundboden (RB) Fläschchen enthalten. Dies gilt für jede Verbindung isoliert.
4. Verdampfen des Lösungsmittels indem der RB-Kolben auf die Drehverdampfer.
5. Sobald alle Lösungsmittel entfernt worden ist, wiegen Sie die RB mit das getrocknete Produkt und subtrahieren Sie das Ausgangsgewicht der RB, eine Rendite zu erhalten.

Die Säulenchromatographie ist eine vielseitige Aufreinigungsmethode, die zur Trennung von Verbindungen in einer Lösung verwendet wird. Ein Lösungsgemisch wird von einem Lösungsmittel durch eine Säule transportiert, die einen Adsorptionsfeststoff enthält, der als stationäre Phase bezeichnet wird. Das kombinierte Lösungsmittel- und Probengemisch wird als mobile Phase bezeichnet.

Moleküle in der mobilen Phase durchlaufen die Säule je nach ihren chemischen Eigenschaften und ihrer Affinität zur stationären Phase mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Somit verlässt jede Verbindung die Säule zu einem anderen Zeitpunkt. Sobald die Verbindungen getrennt und gereinigt wurden, können sie weiterverarbeitet werden oder sind bereit für den Vertrieb. In diesem Video werden die Grundlagen der Säulenchromatographie vorgestellt und anschließend die Technik mit der Aufreinigung organischer Verbindungen demonstriert.

Bei der Säulenchromatographie adsorbieren Moleküle reversibel an die stationäre Phase, während sie durch die Säule fließen, wodurch ihr Fortschritt verlangsamt wird. Verbindungen, die schwach mit der stationären Phase wechselwirken, verlassen die Säule schneller oder eluieren. Verbindungen, die stark mit der stationären Phase wechselwirken, eluieren langsamer. Die stationäre Phase ist ein Adsorptionspulver, ein Adsorptionsmittel oder ein Adsorptionsgel, wie z. B. Kieselgel oder Aluminiumoxid. Kieselgel und Aluminiumoxid sind hochpolar, also sie interagieren stark mit polaren Verbindungen und Lösungsmitteln und schwach mit unpolaren Molekülen. Die stationäre Phase wird als Aufschlämmung mit dem Lösungsmittel in die Säule geladen und dann durch Fließen des Lösungsmittels durch die stationäre Phase verpackt. Bei richtiger Verpackung ist die stationäre Phase von oben nach unten homogen und enthält keine Luftblasen oder trockenen Stellen, da die durch diese Unregelmäßigkeiten verursachte ungleichmäßige Strömung die Trennung der Verbindungen beeinträchtigt. Das Lösungsmittel oder der Eluent ist typischerweise ein organisches Lösungsmittel, das aus einem Reservoir zugeführt wird. Im Allgemeinen eluieren unpolare Lösungsmittel nur unpolare Verbindungen, während polare Lösungsmittel sowohl polare als auch unpolare Verbindungen eluieren. Wenn ein Gemisch Verbindungen mit signifikant unterschiedlichen Polaritäten enthält, kann eine Reihe zunehmend polarer Lösungsmittel verwendet werden, um alle interessierenden Verbindungen zu eluieren. Der Durchfluss in der mobilen Phase wird in der Regel durch einen Absperrhahn am Boden der Säule gesteuert. Strömungspausen werden auf ein Minimum reduziert, um eine Diffusion der Verbindungen zu vermeiden. Die mobile Phase, die die Säule verlässt, das sogenannte Eluat, wird in Fraktionen gesammelt, um die Trennung der Verbindungen zu erhalten. Nachdem Sie nun die Prinzipien der Säulenchromatographie verstanden haben, gehen wir ein Verfahren zur Reinigung einer Mischung organischer Verbindungen durch.

Um den Vorgang zu starten, besorgen Sie sich das Gerät, wie im Text angegeben. Für jede zu isolierende Verbindung wird ein Kolben mit rundem Boden gewogen und die Masse notiert. Wiegen Sie anschließend die Probe und lösen Sie sie in der erforderlichen Mindestmenge an Lösungsmittel auf. Das geeignete Lösungsmittel sollte mittels Dünnschichtchromatographie vorbestimmt werden. Der Rf-Wert sollte zwischen 0,2 und 0,3 liegen. Bestimmen Sie dann die Menge an Kieselgel, die für die stationäre Phase erforderlich ist, basierend auf dem Trockengewicht der Probe und der Differenz in der Migrationsentfernung der interessierenden Verbindungen auf der Grundlage des DC-Vorscreenings. Gießen Sie die entsprechende Menge Kieselgel in einen Erlenmeyerkolben. Das Lösungsmittel wird zum Kieselgel gegeben, bis die Aufschlämmung durchscheinend ist und sich beim Schwenken des Kolbens frei bewegt. Wählen Sie als Nächstes eine Säule aus, die groß genug ist, dass das Kieselgel sie zur Hälfte ausfüllt. Wenn die Säule keine Glasfritte hat, lege Glaswolle in die Säule und drücke sie mit einem langen Stab fest an den Boden. Bedecken Sie die Glaswolle mit ca. 2 cm Sand, um zu verhindern, dass Kieselsäure durch die Glaswolle gelangt. Klemmen Sie die Säule in einem Abzug an einen Ringständer, so dass unten ausreichend Platz für die Aufnahme der Reagenzgläser bleibt.

Setzen Sie einen Trichter in die Säule ein und stellen Sie sicher, dass der Absperrhahn geschlossen ist. Gießen Sie die Gülle in die Säule und klopfen Sie vorsichtig auf die Seiten, während sich die Aufschlämmung absetzt, um Luftblasen auszuschließen. Spülen Sie den Trichter, den Kolben und die Wände der Säule mit Lösungsmittel, um das gesamte Gel in die Säule zu übertragen.

Stellen Sie einen Erlenmeyerkolben unter die Säule. Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie das Lösungsmittel in den Kolben ablaufen, bis der Lösungsmittelstand knapp über dem Kieselgel liegt, und schließen Sie dann den Absperrhahn. Gießen Sie ca. 2 cm Sand auf das Gel. Spülen Sie den an den Seiten der Säule anhaftenden Sand vorsichtig mit Lösungsmittel ab. Lassen Sie das Lösungsmittel nach Bedarf ab, damit der Sand größtenteils trocken ist, die Kieselsäure jedoch vollständig bedeckt bleibt.

Um die Trennung zu starten, geben Sie die Probe in die Säule, ohne den Sand zu stören. Verwenden Sie kleine Portionen Lösungsmittel, um die an den Säulenwänden anhaftende Probe abzuspülen und den Probenbehälter auszuspülen. Lassen Sie das Lösungsmittel vorsichtig ab, bis der Füllstand knapp über der Kieselsäure liegt. Fügen Sie dann mit einer Pipette vorsichtig 4-5 ml Lösungsmittel hinzu, ohne die Sandschicht zu stören. Setzen Sie einen Trichter in die Säule ein und füllen Sie ihn langsam mit Lösungsmittel. Nehmen Sie den Kolben heraus und ersetzen Sie ihn durch ein beschriftetes Reagenzglas. Wenn das erste Reagenzglas eingesetzt ist, öffnen Sie den Absperrhahn und sammeln Sie das Eluat, bis das Reagenzglas fast voll ist.

Fahren Sie mit dem Sammeln von Fraktionen fort, bis alle gewünschten Verbindungen eluiert wurden, und fahren Sie nacheinander durch die markierten Reagenzgläser fort. Wenn Sie fertig sind, schließen Sie den Absperrhahn.

Für jede isolierte Verbindung werden die reinen Fraktionen in einem vorgewogenen Rundkolben kombiniert. Das Lösungsmittel wird auf einem Rotationsverdampfer aus dem Kolben entnommen und dann der Kolben mit rundem Boden, der die trockene Verbindung enthält, gewogen. Weitere Informationen finden Sie im Video dieser Sammlung zur Rotationsverdampfung.

Diese Probe enthielt eine Mischung aus Tetraphenylporphyrin (TPP) und Fluorenon. Zuerst wurde das dunkelrötlich-violette TPP eluiert, gefolgt von dem gelben Fluorenon. Die Reinheit jeder isolierten Verbindung wurde durch NMR-Spektroskopie bestätigt.

Die Säulenchromatographie wird in einer Vielzahl von wissenschaftlichen Bereichen zur Reinigung und Analyse eingesetzt.

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine Form der Säulenchromatographie, die eine hervorragende Trennung zwischen Verbindungen bietet und spezielle Detektoren wie einen Strahlungsdetektor für radioaktiv markierte Moleküle enthalten kann. Mit Hilfe der HPLC kann ein radioaktiv markiertes Phospholipid leicht aus einem Gemisch vieler anderer isoliert werden, selbst wenn es nur einen kleinen Prozentsatz des Gemisches ausmacht. Diese Informationen können helfen, die Produktion, Regulation und Funktionen vieler wichtiger Biomoleküle aufzuklären.

Die Flash-Chromatographie ist eine Variante der Säulenchromatographie, bei der sich die mobile Phase unter Luft- oder Gasdruck und nicht nur durch die Schwerkraft durch die Säule bewegt.

Dies führt zu einer schnelleren Durchflussrate und minimiert die Diffusion für eine bessere Trennung. Die gewünschte Verbindung wird in wenigen, reinen, konzentrierten Fraktionen gesammelt, wie mit der Dünnschichtchromatographie gezeigt, was zu einer hervorragenden Nachreinigungsausbeute und Reinheit führt.

Die übliche Säulenapparatur ist nicht für die Trennung kleiner Volumina geeignet, aber einige Mischungen sind nicht mit speziellen Techniken wie der HPLC kompatibel. Die Aufreinigung im kleinen Maßstab wird mit Pipettensäulen aus Glas durchgeführt, wobei ein Pipettenkolben für die Flash-Chromatographie im kleinen Maßstab verwendet wird. Dies ist besonders nützlich bei der Vorbereitung einer Probe für spezielle Aufreinigungstechniken oder als letzter Schritt nach einer großflächigen Aufreinigung.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Säulenchromatographie gesehen. Sie sollten nun mit den Prinzipien der Säulenchromatographie, einem Verfahren für die Kieselgel-Säulenchromatographie und einigen Anwendungen der Technik vertraut sein.

Danke fürs Zuschauen!