Blutentnahme I

Die Blutentnahme ist eine häufige Voraussetzung für mehrere Forschungsstudien, an denen Mäuse und Ratten beteiligt sind. Die Wahl der Methode für die Blutentnahme bei diesen Tieren hängt von vielen Faktoren ab, wie z. B. dem benötigten Blutvolumen, der Häufigkeit der Probenahme, dem Gesundheitszustand des zu blutenden Tieres und dem Qualifikationsniveau des Technikers.

Im Folgenden werden wir diese Überlegungen überprüfen und Blutentnahmeverfahren skizzieren, einschließlich der retroorbitalen Augenblutung, der Schwanzscheren und -schnitte sowie der intrakardialen Blutentnahme. Weitere Methoden finden Sie im zweiten Video dieser Reihe.

Bevor wir uns mit den Blutentnahmeprotokollen befassen, lassen Sie uns zunächst einige allgemeine Überlegungen durchgehen, einschließlich der Art der Probe, der Nadelauswahl und des maximalen Blutvolumens, das entnommen werden kann. Vor der Blutentnahme von einer Maus oder einer Ratte muss die Art der erforderlichen Blutprobe bestimmt werden. Experimentelle Verfahren könnten Vollblut, Plasma oder Serum erfordern.

Bei der Entnahme von Vollblut muss der Probe ein Antikoagulans zugesetzt werden, um die Gerinnung zu verhindern. Zu den häufig verwendeten Antikoagulanzien gehören Heparin, Natriumcitrat und Ethylendiamintetraessigsäure, abgekürzt EDTA. Antikoagulanzien können direkt in die Spritze geladen werden, um die Oberflächen zu beschichten. Dies ermöglicht den direkten Kontakt des Antikoagulans bei der Blutentnahme und hilft so bei der Verhinderung der Blutgerinnung. Da das Blut von Nagetieren schnell gerinnt, ist es wichtig, dass das richtige Verhältnis von Antikoagulans zu Blut verwendet wird. Bei der Plasmaentnahme muss das Vollblut MIT Antikoagulans zentrifugiert werden. Nach dem Spin ist die durchscheinende Flüssigkeit über der Leukozyten- und Thrombozytenschicht Plasma. Es enthält Fibrinogen und andere Gerinnungsfaktoren. Auf der anderen Seite wird das Serum aus einer Vollblutprobe OHNE Antikoagulanzien entnommen. Und da die Probe geronnen ist, enthält das Serum, das der Top-Player ist, kein Fibrinogen oder andere Gerinnungsfaktoren.

Die Auswahl der Nadel basiert auf der Größe des Tieres und der Stelle der Venenpunktion. Im Allgemeinen schädigen Nadeln mit großem Durchmesser die Blutzellen weniger und ermöglichen eine schnellere Blutentnahme. aber sie verursachen mit größerer Wahrscheinlichkeit Schiffsschäden. Auch die Nadellänge sollte berücksichtigt werden. Wenn eine Nadel zu lang ist, kann es umständlich sein, sie zu verwenden, oder das Blut könnte beginnen, zu gerinnen, während es sich noch in der Nadel befindet. Die Größenauswahl reicht von 18 bis 29 Gauge und 0,5 bis 1,5 Zoll in der Länge. Die geeignete Nadelstärke für jede Methode wird im Abschnitt Verfahren besprochen.

Schließlich gibt es aufgrund der geringen Größe von Nagetieren eine maximale Menge an Blut, die aus einer einzigen Blutabnahme entnommen werden kann, die dem Organismus keinen ernsthaften Schaden zufügt. Die Blutentnahme kann ohne oder mit Flüssigkeitsersatz erfolgen - in der Regel mit 0,9 % physiologischer Kochsalzlösung. Die jeweils obere Grenze ist im untenstehenden Textprotokoll aufgeführt. Darüber hinaus erfordern einige Experimente eine mehrfache Probenentnahme, und in solchen Fällen benötigt das Tier zusammen mit dem Flüssigkeitsersatz auch Zeit dazwischen, um die Blutzellen wieder aufzufüllen. Auch hier gibt es einen Höchstbetrag, der bei der seriellen Sammlung gesammelt werden kann, und die Obergrenzen sind im Protokoll unten aufgeführt.

Nachdem wir einige allgemeine Überlegungen angestellt haben, lassen Sie uns auf die spezifischen Blutentnahmetechniken eingehen, beginnend mit der retroorbitalen Blutung - einer Technik, die von Wissenschaftlern verwendet wird, um kleine Volumina aus den Gefäßen in der Nähe des Auges zu sammeln. Beachten Sie, dass die anatomische Struktur des Orbitalbereichs bei der Maus und der Ratte unterschiedlich ist. Die Ratten haben ein Geflecht von Gefäßen, die hinter dem Auge fließen, während die Maus eine Ansammlung von Gefäßen hat, die einen retroorbitalen Sinus bilden, was es einfacher macht, dieses Verfahren bei Mäusen durchzuführen.

Beginnen Sie damit, ein Röhrchen für die Blutentnahme zu nehmen. Mikro-Hämatokritröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 50-75 Mikrolitern werden bevorzugt. Legen Sie mehrere Papiertücher oder andere Isoliermaterialien auf die Arbeitsfläche. Dies dient dazu, die Körperwärme des Tieres während des Eingriffs aufrechtzuerhalten. Betäuben Sie nun das Tier mit einem Inhalationsanästhetikum wie Isofluran. Sobald das Tier vollständig betäubt ist, nehmen Sie es aus der Kammer und legen Sie es auf die Seite, die sich in der seitlichen Liegeposition befindet. Legen Sie dann einen Finger auf die Oberseite des Kopfes und entlang der Kieferlinie und ziehen Sie die Haut zurück und unten, um einen Augenvorsprung zu induzieren. Vermeiden Sie es, Druck auf die Luftröhre auszuüben, da dies zum Tod durch Ersticken führen kann. Platzieren Sie anschließend den Mikrohämatokritschlauch in den medialen Canthus des Auges und richten Sie ihn kaudal in einem Winkel von 30 bis 45 Grad von der Nasenebene aus. Üben Sie Druck aus, während Sie das Rohr vorsichtig drehen. Dadurch werden die Bindehautmembranen durchtrennt und der Plexus ocularis oder die Nasennebenhöhle gerissen. Das Blut fließt durch Kapillarwirkung in das Hämatokritröhrchen. Vermeiden Sie es, den Schlauch so tief zu drücken, dass Sie den Knochen im hinteren Teil der Augenhöhle treffen. Sobald das Blut zu fließen beginnt, halten Sie den Druck aufrecht, um das Auge hervorstehend zu halten. Um Blutungen zu stoppen, lösen Sie die Haut und lassen Sie das Auge in die normale Position zurückkehren. Üben Sie Druck aus, um die Blutstillung zu fördern. Bei wiederholter Probenentnahme sollten zwischen den Blutungen mindestens 10 Tage liegen. Dies gibt dem Gewebe etwas Zeit zum Heilen.

Obwohl retroorbitale Blutungen ein gängiges Verfahren sind, gibt es viele Bedenken hinsichtlich ihrer Humanität. Dazu gehören Schwellungen durch übermäßige Bewegung des Hämatokrittubus. Dies wiederum kann dazu führen, dass der Augapfel hervorsteht und das Schließen des Augenlids behindert wird, was zu Hornhautaustrocknung, Schädigung und Schmerzen führt, die Kratzen und Selbstverstümmelung auslösen können. Eine unsachgemäße Platzierung des Hämatokrittubus kann den Sehnerv durchtrennen und zur Erblindung führen. Eine weitere mögliche Komplikation besteht darin, dass das Auge aus der Augenhöhle gedrückt werden kann, wodurch die Augenlider hinter den Augapfel fallen. Darüber hinaus können Probleme durch die Fraktur der fragilen Orbitaknochen, das Eindringen in den Augenballen, das zum Verlust des Glaskörpers führt, oder die Bildung eines Hämatoms hinter dem Auge, das zu extremen Schmerzen führen kann, entstehen. Trotz all dieser Bedenken ist die retroorbitale Blutung eine wirksame Methode zur Blutentnahme bei Nagetieren, wenn ein erfahrener Techniker den Eingriff durchführt und das Tier vollständig betäubt ist.

Schauen wir uns nun die Überlegungen und Verfahren für die Schwanzblutung an, die die Entnahme einer Serienprobe kleiner Volumina ermöglicht. Zu den für dieses Verfahren erforderlichen Geräten gehört ein steriles Skalpell mit der Nummer 11. Eine Schere sollte nicht verwendet werden, da der Schnitt mit der Schere zerquetscht wird, was die Gerinnung fördern und die Durchblutung verringern kann. Weitere Instrumente sind ein Rückhalterohr, das den Zugang zum Schwanz des Tieres ermöglicht; saugfähige Papierhandtücher; Entnahme- oder Hämatokritröhrchen und blutstillendes Pulver - zur Unterstützung der Blutstillung.

Beginnen Sie damit, das Tier im Rückhalterohr zu sichern. Wischen Sie dann den Schwanz mit warmem Wasser ab, um Schmutz zu entfernen und eine leichte Vasodilatation zu verursachen. Verwenden Sie KEIN heißes Wasser. Strecken Sie den Schwanz aus und schneiden Sie mit der Skalpellklinge das äußerste Ende des Schwanzes ab, um das Blut mit Hilfe des Hämatokrits oder der Entnahmeröhrchen zu sammeln. Der Schwanz kann vom Rumpf bis zur Spitze gestreichelt oder "gemolken" werden, um die Durchblutung zu fördern. Dies verschlechtert jedoch die Qualität der Probe.

Um die Blutung zu stoppen, üben Sie mit einem Mullkissen Druck auf die Schwanzspitze aus. Das blutstillende Pulver kann verwendet werden, um eine Blutstillung zu erreichen. Kontrollieren Sie die Tiere alle 5 bis 10 Minuten, um sicherzustellen, dass die Blutstillung erreicht wurde, die sich nach wiederholter Probenahme verzögern kann. Die aus einer Schwanzschere entnommene Probe kann sowohl arterielles als auch venöses Blut sowie eine Kontamination des Gewebeprodukts enthalten. Dieses Verfahren zur Blutentnahme ermöglicht jedoch serielle Entnahmen, indem der Schorf oder das Gerinnsel des ursprünglichen Schnitts am Ende des Schwanzes aufgebrochen wird.

Eine alternative Methode zur Blutentnahme ist die Schwanzgefäßschnitte, die relativ weniger invasiv ist. Machen Sie dazu mit der gleichen Skalpellklinge einen kleinen Schnitt direkt über der seitlichen Schwanzvene, etwa zwei Drittel des Abstands vom Rumpf. Wie bei der Schwanzschere kann Blut in Sammel- oder Hämatokritröhrchen gesammelt werden. Und es ist unerlässlich, die Blutstillung zu gewährleisten, indem man Druck auf die Stelle ausübt und das Tier alle 5-10 Minuten erneut untersucht. Wie bei der Schwanzschere können die Proben jedoch mit Gewebeprodukten kontaminiert sein.

Häufig werden Studien durchgeführt, bei denen eine große Blutprobe ohne Überleben erforderlich ist, die durch Exsanguination über eine intrakardiale Blutung oder die kaudale Hohlvene erreicht wird.

Für die intrakardiale Methode bei Mäusen benötigen Sie eine 3-cm³-Spritze mit einer 22-25-Gauge-1-Zoll-Nadel. Und für Ratten wird eine 10-12 cc Spritze mit einer 18 Gauge 1,5 Zoll Nadel bevorzugt. Sehen Sie sich das Protokoll unten an, um zu verstehen, warum diese Bedürfnisse und Spritzen ideal sind.

Beginnen Sie damit, das Tier mit Kohlendioxid einzuschläfern. Halten Sie das Nagetier nach der Euthanasie am Genick fest, während der Körper senkrecht hängt. Diese Fixierung ist von entscheidender Bedeutung, da der Körper gerade sein sollte, um eine Ablenkung des Herzens oder eine Verdrehung des Brustkorbs zu verhindern. Beachten Sie, dass sich das Herz ungefähr auf Höhe des Ellenbogens befindet. Die Einstichseite befindet sich in der Kerbe links vom Xiphoid, parallel zur Wirbelsäule und unter den Rippen.

Führen Sie die Nadel mit der Abschrägung nach oben in die Brust ein und stechen Sie in das Herz. Üben Sie mit der Spritze einen leichten Gegendruck aus. Wenn sich die Nadel im Herzen befindet, fließt Blut in die Spritze. Warten Sie, bis das Blut den Zylinder gefüllt hat, bevor Sie zusätzlichen Gegendruck hinzufügen. Etwa die Hälfte des gesamten Blutvolumens kann einer Maus oder Ratte durch Herzpunktion entnommen werden. Dies entspricht ungefähr 1 ml Blut von einer durchschnittlichen Maus und etwa 10 ml Blut von einer durchschnittlichen Ratte

Eine alternative Position ist das dorsale Liegen bei Verwendung des lateralen Zugangs. Platzieren Sie in diesem Fall die Nadel zwischen den Rippen auf der linken Seite des Tieres. Der Eintrittspunkt wird gegen den Punkt des Ellenbogens an der Brustwand gemessen. Führen Sie die Nadel mit der Abschrägung nach oben senkrecht zur Tischebene an einem Punkt in der Mitte der Brustwand ein. Üben Sie mit der Spritze einen leichten Gegendruck aus. Befindet sich die Nadel im Herzen, fließt Blut in die Spritze. Warten Sie erneut, bis das Blut das Fass gefüllt hat, bevor Sie zusätzlichen Gegendruck hinzufügen. Beachten Sie, dass in beiden Positionen ein übermäßiger Gegendruck das Herz kollabieren lassen kann, wodurch die Nadelschräge verschlossen wird und der Blutfluss in die Spritze gestoppt wird.

Eine weitere Methode zur Entnahme von Herzblut ist die Hohlvene caudalis. Die für dieses Verfahren erforderliche Ausrüstung ist eine geeignete Spritze mit einer Nadel der richtigen Größe; Schere zum Öffnen der Bauchhöhle, kleine atraumatische Daumenzange und Mullschwamm. Diese Technik erfordert, dass das Tier während des gesamten Eingriffs tief betäubt und unter Narkose gehalten wird. Eine CO2-Narkose kommt nicht in Frage, da für dieses Verfahren das Herz des Tieres schlagen muss. Bringen Sie das Tier in die Rückenliegeposition und befestigen Sie die Gliedmaßen auf der Plattform. Die Gliedmaßen sollten vom Körper weg gestreckt werden.

Heben Sie nun die Haut mit einer Pinzette an und machen Sie mit einer Schere einen kleinen Querschnitt durch die Haut direkt über dem Becken bei Frauen oder Vorhaut bei Männern. Als nächstes setzen Sie die Spitze der Schere in den Schnitt ein und machen einen Mittellinienschnitt durch die Haut vom Becken oder der Vorhaut bis zum Xiphoid. Hebe den Muskel mit seitlich reflektierter Haut an und mache einen kleinen Querschnitt durch den Muskel, direkt über dem Hautschnitt.

Platzieren Sie die Spitze der Schere in den Bauch und machen Sie einen Mittellinienschnitt durch den Muskel zum Xiphoid. Achten Sie darauf, die Scherenspitze nach oben zu richten, um zu verhindern, dass Organe geschnitten werden. Auf jeder Seite quer entlang der Wölbung der Rippen schneiden. Achten Sie darauf, die Leber nicht zu punktieren. Bewegen Sie den Darm vorsichtig nach links des Tieres, um die hintere Hohlvene freizulegen. Lege ein Mullkissen auf die Leber und lege deinen Zeige- und Mittelfinger darauf. Führen Sie mit der anderen Hand die Nadel in die Hohlvene ab, auf halbem Weg zwischen dem Übergang der Nierengefäße und der Beckengabelung. Entnehmen Sie langsam das Blut, während Sie Druck auf die Leber ausüben.

Vermeiden Sie Handbewegungen, da dies zum Gefäßbruch führen kann. Eine zu schnelle Blutentnahme kann auch dazu führen, dass das Gefäß auf die Abschrägung kollabiert, die Öffnung verschließt und die Blutentnahme verhindert. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, eine sterile Probe zu entnehmen, da die Nadel nicht durch die Haut dringt.

Schauen wir uns zum Schluss einige Anwendungen dieser Blutentnahmetechniken an. Die Immunonkologie ist ein aufstrebendes Gebiet, und Forscher in diesem Bereich führen häufig Blutentnahmen durch, um die Immunzellen in verschiedenen Stadien der Krebsentwicklung zu untersuchen. Hier sammelten Forscher beispielsweise Herzblut von krebstragenden Mäusen, um Neutrophile zu isolieren und zu quantifizieren, zehn, zwanzig und dreißig Tage nach der Tumortransplantation.

Andererseits wird die Blutzusammensetzung auch häufig von Physiologen untersucht. Wie in dieser Studie waren die Forscher daran interessiert, die Nierenfunktion bei diabetischen Tieren zu bewerten. Um dies zu erreichen, injizierten die Wissenschaftler zunächst einen Farbstoff in ein Diabetes-Tiermodell. Als nächstes verwendeten sie dann die Schwanzschnittmethode, um Blut zu mehreren Zeitpunkten zu sammeln, um die Farbstoffkonzentration im Blut zu bewerten, die schließlich zur Berechnung der glomerulären Filtrationsrate verwendet wurde, die den Unterschied in der Nierenfunktion nach Diabetes-Induktion hervorhob.

Schließlich verwenden Stammzellforscher Blutproben, um den Erfolg des Einbaus von Spenderzellen in das System des Empfängers zu bewerten. Dabei transplantierten die Forscher zunächst Knochenmarkzellen von einer männlichen Maus über die Schwanzveneninjektion in einen Wildtyp und ein genetisch verändertes weibliches Tier. Als nächstes sammelten sie Blut aus dem retroorbitalen Sinus der Empfängermaus, um die genomische DNA von Blutzellen mittels Polymerase-Kettenreaktion zu untersuchen. Daraus ergab sich der Prozentsatz der Transplantation von Spenderzellen bei den beiden Tierarten.

Sie haben gerade den ersten Teil von JoVE über Blutentnahmetechniken gesehen. Im nächsten Video der Serie erfahren Sie, wie Sie andere häufig verwendete Techniken der Blutentnahme bei Labortieren durchführen können. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!