Blutentnahme II

Die Entnahme von Blut von Mäusen und Ratten ist für eine Vielzahl von wissenschaftlichen Studien notwendig, und Forscher haben verschiedene Methoden entwickelt, um bestimmte experimentelle Ziele zu erreichen.

In der ersten Folge diskutierten wir die allgemeinen Überlegungen zur Blutentnahme und überprüften die retroorbitale Augenblutung, die Schwanzschnitte und -kerben sowie die intrakardialen Blutentnahmemethoden. Im Folgenden werden die Verfahren zur Blutentnahme aus Gesichts-, Unterkiefer-, Stamm- und Oberschenkelvenen beschrieben. Diese Methoden sind weniger invasiv und erfordern keine Anästhesie, was sie zu Methoden der Wahl macht, wenn die Verwendung von Anästhetika die Blutergebnisse oder andere Daten verfälschen kann.

Beginnen wir mit dem Verfahren zur Entnahme einer Blutprobe aus einer Gesichtsvene der Maus. Auf der Maus befindet sich eine leicht zugängliche Gesichtsvene, die quer über die Wange verläuft. Beginnen Sie mit der Auswahl der richtigen Ausrüstung für den Eingriff. Grundsätzlich benötigst du ein kleines Zentrifugenröhrchen für die Blutentnahme und eine Lanzette, die es in verschiedenen Größen gibt. Die Auswahl der richtigen Lanzette hängt vom Alter, Geschlecht und Körpergewicht des Tieres sowie von der Größe der zu entnehmenden Probe ab. Siehe Textprotokoll für Details zur Lanzettenauswahl.

Beginnen Sie die Prozedur, indem Sie das Tier mit der Scrubfing-Technik festhalten. Die richtige Fixierung minimiert die seitliche Bewegung des Kopfes und trägt dazu bei, eine genaue und sichere Venenpunktion mit der Lanzette zu gewährleisten. Wenn der Griff zu fest ist, kann der Blutfluss eingeschränkt sein, was zu einem reduzierten Sammelvolumen führt. Sobald das Tier fixiert ist, lokalisieren Sie den ungefähren Bereich der Gesichtsvene, indem Sie die Länge des Auges unterhalb des lateralen Canthus und die Breite des Auges kaudal messen. Mit der Spitze der Lanzette sanft an die Stelle tasten, an der der Kieferknochen endet. Um das Gefäß genauer zu punktieren, können Sie die Maus auf der Seite positionieren.

Halten Sie nun die Lanzette an der Einstichstelle senkrecht zur Hautoberfläche, wobei die Spitze leicht zur Nase zeigt. Dies ist von entscheidender Bedeutung, denn wenn die Lanzettenspitze nach kaudal gerichtet ist, wird der Gehörgang durchstochen, was zu Blutungen aus dem Ohr führt. Um die Vene zu punktieren, drücken Sie fest und stechen Sie in die Haut bis zur Lanzettenschulter. Nach der Entnahme beginnt das Blut zu fließen. Um den Fluss zu unterstützen, positionieren Sie das Tier mit dem Kopf tiefer als das Herz. Um Blutungen zu stoppen, tupfen Sie die Einstichstelle ab, um eine Blutstillung zu erreichen und einen übermäßigen Blutverlust zu verhindern. Lassen Sie schließlich den Druck auf das Genick los und bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück. Beachten Sie, dass die Entnahmevolumina variieren können, aber es ist zwingend erforderlich, das maximale Volumen für die Überlebensblutentnahme NICHT zu überschreiten. Weitere Informationen zum empfohlenen maximalen Entnahmevolumen finden Sie im Textprotokoll des Videos "Blood Withdrawal One". Serienproben können durch Wechsel der verwendeten Seite entnommen werden. Keine der beiden Seiten sollte öfter als alle 5-7 Tage verwendet werden.

Schauen wir uns nun die Methode der Blutung der submandibulären Vene an. Obwohl dies der Technik für die Gesichtsvenenblutung sehr ähnlich ist, gibt es Unterschiede in der Ausrüstung und subtile Unterschiede im Blutungsverfahren.

Die Vena submandibularis verläuft entlang des Unterkiefers der Maus und mündet mit der Vena facialis in die Vena jugularis. Anstelle einer Lanzette wird diese Methode mit Nadeln durchgeführt. Ähnlich wie bei Lanzetten hängt die Auswahl der Nadelstärke jedoch vom Alter, Geschlecht, Gewicht und Probengröße des Tieres ab - Einzelheiten finden Sie im Textprotokoll.

Zu Beginn scheuen Sie das Tier auf die gleiche Weise wie bei der Gesichtsvenenblutung, so dass der Kopf nur minimal von einer Seite zur anderen bewegt wird. Rückruf - Ein zu fester Griff kann das Blutentnahmevolumen verringern. Während du die Maus festhältst, stelle dir eine Linie vom Mundwinkel über das Gesicht und eine Linie vom seitlichen Canthus des Auges vor. Der Schnittpunkt dieser Linien ist die ungefähre Fläche der Vena submandibularis. Dies fällt mit einem kleinen haarlosen Grübchen zusammen, das sich kaudal zum Mundwinkel und etwas unterhalb der Kieferlinie befindet.

Um die Genauigkeit zu verbessern, das Tier in die Seitenlage legen (3.6.1). Halten Sie dann die Nadel senkrecht zur Hautoberfläche und führen Sie sie mit einem festen Druck ein. Führen Sie die Nadel NICHT über die abgeschrägte Spitze hinaus ein, da eine größere Einstichtiefe zu einem Trauma der Muskeln, Nerven und anderer Gefäße führen kann, die sich im Kopf-, Hals- und Mundraum befinden. Nach dem Entfernen der Nadel beginnt das Blut zu fließen. Positionieren Sie die Maus wie bei einer Gesichtsvenenblutung mit dem Kopf tiefer als das Herz, um den Blutfluss zu unterstützen. Zum Schluss tupfen Sie die Einstichstelle ab, um eine Blutstillung zu erreichen, und lassen Sie den Druck auf das Genick los, um das Tier in seinen Käfig zurückzubringen.

Lassen Sie uns nun lernen, wie man Blut aus der Vena saphena sammelt. Diese Vene ist ein oberflächliches Gefäß, das dorsal und dann lateral über das Fußwurzelgelenk verläuft.

Die Ausrüstung, die Sie für dieses Verfahren benötigen, umfasst eine Rückhaltevorrichtung, die für Ratten eine flexible Kunststoffvorrichtung sein kann, oder für Mäuse kann ein modifiziertes konisches 50-Milliliter-Kunststoffrohr verwendet werden. Beachten Sie, dass das Schlauchende abgeschnitten wird, um ein Atemloch zu ermöglichen, und ein halber Zoll breiter und 2 Zoll langer Schlitz aus dem Kappenende geschnitten wird. Die Ränder sind zur Sicherheit der Tiere mit Gerinnselband abgedeckt. Dieses Verfahren erfordert auch ein Tourniquet - hergestellt aus einer 3-cm³-Spritze und einer Länge von 0-2 nicht resorbierbaren Nähten, eine dreifache antibiotische Salbe mit einem Tupfer -, die als feuchtigkeitsbeständige Barriere zwischen der Haut und dem Bluttröpfchen verwendet wird, einen Haarschneider, eine 22-Gauge-Nadel für die Venenpunktion und ein Hämatokritröhrchen für die Blutentnahme.

Um eine Maus zurückzuhalten, legen Sie sie mit der Nase voran in die Röhre. Führen Sie dann das Hinterbein sanft in den Schlitz und stabilisieren Sie es mit Zeigefinger und Daumen. Rasieren Sie anschließend die Haare von der seitlichen Seite des Beins vom Sprunggelenk bis zum Knie. Als nächstes schmieren Sie eine sehr dünne Schicht der dreifachen antibiotischen Salbe auf die haarlose Stelle. Legen Sie anschließend das Tourniquet so weit wie möglich kranial an und ziehen Sie es fest. Das Stammgefäß, das vom Knie bis zum Knöchel über die äußere Oberfläche verläuft, beginnt sich zu füllen und wird angehoben und leicht sichtbar.

Halten Sie anschließend eine 22-Gauge-Nadel direkt über das Blutgefäß und senkrecht zur Hautoberfläche. Und stechen Sie in das Gefäß, wobei Sie darauf achten müssen, die Nadel nicht zu tief einzuführen und Muskeln oder Knochen zu punktieren. Das Blut perlt an der Oberfläche des Beins ab und wird in einem Hämatokritröhrchen gesammelt. Sobald das Blut entnommen wurde, lösen Sie das Tourniquet und üben Sie Druck auf die Punktion aus, um die Blutstillung zu gewährleisten. Nachdem die Blutung aufgehört hat, nehmen Sie das Tier aus der Rückhalteeinrichtung und bringen Sie es in seinen Käfig zurück. Die mit dieser Methode erfassten Volumina liegen zwischen 10 und 150 ? L, abhängig von der Häufigkeit der Probenahme. Und die Qualität der Probe ist variabel, da sie Gewebeprodukte enthalten kann. Innerhalb von 24 Stunden sollten nicht mehr als 4 Blutproben aus demselben Bein entnommen werden.

Zuletzt lernen wir, wie man Blut aus der Oberschenkelvene entnimmt, was eine weitere Option für die Blutentnahme bei einer Ratte ist. Die Vena femoralis verläuft auf der medialen Seite des Hinterbeins von der Leiste bis zum Kniegelenk, bevor sie das Knie kreuzt und zur Vena saphena lateralis wird, wodurch sie leicht zugänglich ist.

Der Vorteil der Oberschenkelvenenblutung besteht darin, dass ein größeres Volumen leichter entnommen werden kann als aus der Vena saphena. Der Nachteil ist, dass für dieses Verfahren bei einem bewussten Tier zwei Personen erforderlich sind. Die Ausrüstung, die für dieses Verfahren benötigt wird, ähnelt der Methode der Stammvene, außer dass sie kein Tourniquet erfordert und die bevorzugte Rückhaltevorrichtung ein flexibler Kegel ist. Um den richtigen Kegel auszuwählen, messen Sie ihn gegen die Körperlänge des Tieres und machen Sie dann ein ovales Loch, das auf Höhe des Oberschenkels geschnitten ist.

Um das Tier zurückzuhalten, legen Sie es mit der Nase voran in die Röhre. Falten Sie dann das Ende des Kegels und verschließen Sie ihn mit einer kleinen Klammer, um zu verhindern, dass das Tier herauskommt. Ziehen Sie nun das Hinterbein durch die ovale Öffnung, um Zugang zur Oberschenkelvene zu erhalten. Greifen Sie nicht zu fest, da dies die Hämatombildung verschlimmern kann. Rasieren Sie anschließend die Innenfläche des Beins von der Leiste bis zum Knie ab und tragen Sie eine dünne Schicht dreifacher antibiotischer Salbe auf den haarlosen Bereich auf. Anschließend sollte die fixierende Person die Oberschenkelvene verschließen und die Ratte mit der Innenfläche des Beins greifen, die der Person zugewandt ist, die Blut abnehmen wird. Halten Sie die 22-Gauge-Nadel senkrecht zum Blutgefäß, punktieren Sie direkt die Vene und sammeln Sie das Blut in Hämatokritröhrchen, während es auf der Hautoberfläche abperlt. Die Punktion sollte so nah wie möglich am Knie erfolgen, um eine zukünftige Probenahme anteri dieser Stelle zu ermöglichen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Tiefe der Einstichstelle nicht tiefer ist als die Länge der Abschrägung der Nadel. Um den Blutfluss zu unterstützen, positionieren Sie die Ratte mit dem Bein tiefer als das Herz. Lassen Sie schließlich den Druck auf das Bein los und üben Sie Druck auf die Einstichstelle aus, um eine Blutstillung zu erreichen und einen übermäßigen Blutverlust zu verhindern. Beachten Sie, dass mit diesem Verfahren deutlich mehr Blut entnommen werden kann.

Nachdem wir die Grundlagen der Blutentnahmetechniken besprochen haben, sehen wir uns einige Beispiele an, warum diese Verfahren für die wissenschaftliche Forschung nützlich sein können

Blut wird oft analysiert, um die Immunantwort während der Impfstoffentwicklung zu bestätigen. Hier verabreichten Forscher einen Peptidimpfstoff an Tiere, die an Blasenkrebs litten. Anschließend sammelten sie Blut über die Vena submandibulär und trennten das Serum, um die Spiegel verschiedener Zytokine nachzuweisen, die als Indikatoren für die Wirksamkeit des Impfstoffs dienen.

Die Blutentnahme wird auch häufig durchgeführt, um die Wirksamkeit einer Behandlung zu testen, indem Biomarker der menschlichen Krankheit, wie z. B. der Glukosespiegel bei Diabetes, untersucht werden. Diese Forscher waren daran interessiert, die Wirksamkeit einer neuartigen Gentherapie zu testen, die über die Schwanzvene bei diabetischen Tieren verabreicht wird. Nach der Injektion entnahmen diese Untersucher zu mehreren Zeitpunkten Blut aus der Stammvene, um die Wirkung verschiedener Behandlungsprotokolle auf den Blutzuckerspiegel zu analysieren.

Schließlich ist es für einige Experimente wichtig, den grundlegenden Status des Tieres zu kennen, wie z. B. das Ausmaß der Entzündung oder des Stresses. In diesem Beispiel wurde einer Ratte vor und nach einem Stressereignis Blutplasma entnommen. Und wie Sie sehen können, ist der Corticosteron-Spiegel oder das Stresshormon bei Tieren zehn Minuten nach dem Stressereignis höher.

Sie haben gerade den zweiten Teil von JoVE über Blutentnahmetechniken für Mäuse und Ratten gesehen. Nachdem Sie sich diese beiden Videos angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis für die Überlegungen und Verfahren für die Blutentnahme von diesen Tieren haben und wissen, wie sie heute in der biomedizinischen Forschung eingesetzt werden. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!