Ionenaustausch-Chromatographie
Quelle: Labor von Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Ionenaustausch Chromatographie ist eine Art der Chromatographie, die Analyten basierend…
1. Vorbereitung der Probe und die Spalte
- In dieser Demo wird eine Mischung aus 2-Proteine auf einer Kationenaustausch Spalte getrennt werden: Hämoglobin und Cytochrom C. Add 0,2 mL Gleichgewichtherstellung Puffer (pH 8.1) die Protein-Probe und Wirbel, gründlich mischen. Zentrifuge für 2 min, Schaum zu entfernen.
- Setzen Sie die Kationenaustausch Säule in einem Reagenzglas für 5 min Harz zu begleichen zu ermöglichen. Klemmen Sie das Reagenzglas mit der Spalte auf einen Ring Stand, um sicherzustellen, dass es aufrecht steht.
- Öffnen Sie die Abdeckkappe der Spalte und die untere Kappe. Lassen Sie den Puffer in der Spalte heraus unter Schwerkraft in das Reagenzglas Tropfen.
- Waschen Sie die Spalte zweimal mit einem Spalte-Volumen (in diesem Fall die Spalte Volumen beträgt 0,3 mL) von Gleichgewichtherstellung Puffer. Lassen Sie die ersten Spalte-Band (0,3 mL) von Gleichgewichtherstellung Puffer tropft heraus in den Abfall Fläschchen vor der Zugabe der zweiten Spalte-Band. Mit diesem Schritt können die Spalte mit dem Gleichgewichtherstellung Puffer equilibrate. Fügen Sie die Gleichgewichtherstellung Puffer langsam in diesem Schritt das Harz nicht zu stören.
(2) läuft eine Protein-Probe durch eine Kationenaustausch Spalte
- Legen Sie die Spalte in eine 2 mL Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung "Unbound 1". Laden Sie sorgfältig 0,1 mL der Protein-Probe auf dem oberen Rand der Spalte.
- Sobald die Probe auf die Oberseite der Spalte geladen wurde, waschen Sie es mit 0,3 mL Gleichgewichtherstellung Puffer durch den Puffer am oberen Rand der Spalte hinzufügen und ermöglicht es, bis hin zu Tropfen. Wiederholen Sie diesen Schritt 4 X (für eine Gesamtmenge von 5 Wäschen) und sammeln Sie jedem Waschen in einem separaten, 2 mL Zentrifugenröhrchen zu. Beschriften Sie die Röhren als "Unbound 1-5".
- Für die letzten 2 Wäschen Zentrifugieren für 10 s bei 1.000 x g um sicherzustellen, dass alle ungebundene Arten kommen aus der Spalte. Jede Probe, die die Spalte bindet, sollte nicht in diese Waschungen, aber Probe, die nicht bindet wird unretained auswaschen. Zentrifugieren sorgt für mehr Kraft, ungebundene Materialien aus der Spalte zu waschen.
- Legen Sie die Spalte, in einer neuen 2-mL Sammlung Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung "1 gebunden". Setzen Sie 0,3 mL Elution Puffer (hohe Salz, pH-Wert 5,5) auf die Oberseite der Spalte. Zentrifugieren Sie die daraus resultierenden Laufmittel für 10 s bei 1.000 x g.
- Wiederholen Sie die Elution Schritt 2 weitere Male indem man die Spalte in einen neuen Zentrifugenröhrchen, Hinzufügen von 0,3 mL und Zentrifugieren für 10 S. Label diese "Bound 2 und 3".
- Nehmen Sie Farbänderungen oder Beobachtungen über die Fraktionen. Hämoglobin ist ein farbiges Protein, das rötlich-braune sieht zwar Cytochrom C rötlich gefärbt.
3. Ergebnisse: Kationenaustausch von Hämoglobin und Cytochrom C
- Cytochrom C hat einen pI von 10,5 und Hämoglobin eine pI von 6,8. Also, wenn ein pH 8.1 Gleichgewichtherstellung Puffer verwendet wird, Hämoglobin in die Spalte bindet nicht weil es negativ geladen ist. Cytochrom C ist bei diesem pH positiv geladen und bindet an die Spalte, weil der pH-Wert < pI.
- Hämoglobin wird in den ungebundenen Fraktionen beobachtet, da sie nicht in die Spalte gebunden ist.
- Cytochrom C ist in gebundenen Brüche, beobachtet, weil es an den Kationenaustausch Spalte gebunden war.
Abbildung 1. Bild von ungebundenen Bruchteil (Hämoglobin) und gebundenen Bruchteil (Cytochrom C).
Die Ionenaustauschchromatographie wird häufig bei der Trennung und Isolierung geladener Verbindungen, insbesondere großer Biomoleküle, eingesetzt.
Bei dieser Art der Flüssigkeitschromatographie wird eine Säule aus gepackten Kügelchen in stationärer Phase, dem sogenannten Harz, verwendet. Die Technik trennt Analyten nach ihrer Affinität mit dem geladenen Harz.
Es gibt zwei Haupttypen dieser Technik. In der Kationenaustauschchromatographie wird negativ geladenes Harz verwendet, um positiv geladene Analyten zu binden. In ähnlicher Weise binden negativ geladene Analyten beim Anionenaustausch an positiv geladenes Harz. Die ungebundenen Verbindungen werden durch die Säule gewaschen und der Analyt kann dann in einem separaten Behälter aufgefangen werden.
In diesem Video werden die Grundlagen der Ionenaustauschchromatographie vorgestellt und die Technik anhand der Trennung eines Proteingemisches im Labor demonstriert.
Die stationäre Phase ist eine Schlüsselkomponente für eine erfolgreiche Trennung. Starke Kationenaustauscherharze weisen typischerweise starke funktionelle Gruppen auf, wie z. B. Sulfonsäure. Schwache Kationenaustauscherharze weisen schwache Gruppen auf, wie z. B. Carbonsäuren.
In ähnlicher Weise verwenden starke Anionenaustauscherharze starke Basen, wie quartäre Amine, während schwache Anionenaustauscherharze sekundäre oder tertiäre Amine verwenden. Die Auswahl des Harzes hängt von den Eigenschaften der Probenmischung und des interessierenden Analyten ab.
Die verwendeten Puffer, die zusammen als mobile Phase bezeichnet werden, sind ebenfalls wichtig für die Trennung, insbesondere im Hinblick auf den pH-Wert. Bei Proteinen wird der pH-Wert auf der Grundlage seines isoelektrischen Punktes (pI) ausgewählt. Bei einem pH-Wert, der dem pI des Proteins entspricht, ist das Protein neutral. Oberhalb des pI hat es eine negative Nettoladung, während es unterhalb des pI eine positive Nettoladung hat. Der pH-Wert des Puffers muss so gewählt werden, dass das Protein richtig geladen ist und an die stationäre Phase binden kann.
Die Ionenaustauschchromatographie ist im Allgemeinen ein vierstufiges Verfahren. Zunächst wird eine gepackte Säule, die entweder Anionen- oder Kationenaustauscherharz enthält, mit Hilfe von Puffer äquilibriert. Bei Anionenaustauschsäulen bedeutet dies, dass das Harz protoniert wird, um sicherzustellen, dass es positiv geladen ist.
Als nächstes wird die Probe auf die Säule geladen. Der Puffer muss eine geringe Leitfähigkeit aufweisen, da geladene Spezies mit der Probe um Wechselwirkungen mit dem Harz konkurrieren können. Verbindungen mit entgegengesetzter Ladung binden an das Harz. Moleküle, die nicht geladen sind oder die gleiche Ladung tragen, bleiben ungebunden.
Im dritten Schritt wird die Säule mit zusätzlichem Puffer gewaschen, um die ungebundenen Komponenten aus der Säule zu entfernen, wobei die Bindung zurückbleibt.
Der vierte Schritt schließlich ist die Elution des gebundenen Analyten. Dies wird entweder durch die Verwendung eines Salzgradienten, bei dem die Salzkonzentration allmählich erhöht wird, oder durch die Verwendung eines Puffers mit hoher Salzelution erreicht.
Moleküle, die schwach gebunden sind, werden zuerst eluiert, da das niedrige Salz ihre ionische Bindung an das Harz am leichtesten stört. Verbindungen, die stärker gebunden sind, eluieren mit höheren Salzkonzentrationen.
Nachdem nun die Grundlagen der Ionenaustauschchromatographie skizziert wurden, werfen wir einen Blick auf ihre Verwendung bei der Trennung von zwei Proteinen.
Um die Proteinmischung für die Trennung vorzubereiten, fügen Sie zunächst 0,2 ml Bindungspuffer hinzu und vermischen Sie sie gründlich mit einem Vortex. Zentrifugieren Sie dann die Mischung, um jeglichen Schaum zu entfernen. Um die Kationenaustauschersäule vorzubereiten, klemmen Sie sie senkrecht auf einen Ringständer und lassen Sie das Harz absetzen.
Öffnen Sie die obere Kappe der Spalte und dann die untere. Lassen Sie den Puffer unter der Schwerkraft in ein darunter liegendes Rohr tropfen.
Um die Säule vorzubereiten, äquilibrieren Sie sie, indem Sie ein Säulenvolumen Puffer laden, in diesem Fall 0,3 ml. Lassen Sie den Puffer aus der Säule in ein Abfallfläschchen tropfen. Nachdem eine Spalte mit Volumen des Puffers beendet wurde, wiederholen Sie den Äquilibrierungsschritt.
Um das Experiment durchzuführen, platzieren Sie ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung "Unbound 1" unter der Säule. Laden Sie vorsichtig 0,1 ml der Proteinprobe auf die Oberseite der Säule.
Sobald die Probe geladen ist, waschen Sie sie mit einem Säulenvolumen Puffer und lassen Sie ihn vollständig durchfließen. Wiederholen Sie dies für insgesamt 5 Wäschen. Sammeln Sie jede Wäsche in einer eigenen Tube, die mit "Unbound 1" bis "5" beschriftet ist. Während der letzten 2 Wäschen zentrifugieren Sie die Säule 10 s lang, um sicherzustellen, dass alle ungebundenen Spezies von der Säule abgewaschen werden. Setzen Sie die Säule in ein neues 2-ml-Zentrifugen-Entnahmeröhrchen ein und beschriften Sie es mit "Gebunden 1". Laden Sie 1 Spaltenvolumen Elutionspuffer auf die Säule. Zentrifugieren Sie 10 s lang bei 1.000 x g.
Wiederholen Sie den Elutionsschritt noch 2 Mal, um sicherzustellen, dass der gebundene Analyt entnommen wird. Beschriften Sie die Röhren mit "Bound 2" und "3".? Notieren Sie alle Farbänderungen oder Beobachtungen zu den Brüchen.
In diesem Beispiel wurden Hämoglobin und Cytochrom C getrennt. Hämoglobin hat einen pI von 6,8, während Cytochrom C einen pI von 10,5 hat. Im Puffer mit einem pH-Wert von 8,1 ist das Hämoglobin negativ geladen und bindet nicht an die Säule. Umgekehrt ist Cytochrom C bei pH 8,1 positiv geladen und bindet an die Säule.
Hämoglobin, ein bräunlich gefärbtes Protein, wurde in den ungebundenen Fraktionen gefunden, während Cytochrom C, ein rötlich gefärbtes Protein, in der gebundenen Fraktion beobachtet wurde.
Es gibt viele Formen der Flüssigkeitschromatographie, die jeweils unterschiedliche Fähigkeiten zur Trennung von Bestandteilen eines Gemisches haben.
In diesem Beispiel wurde die Säulenchromatographie verwendet, um ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngiger DNA zu trennen. Hydroxylapatit oder HA ist eine kristalline Form von Calciumphosphat, die aufgrund ihrer positiv geladenen Calciumionen häufig als stationäre Phase verwendet wird. In diesem Fall war die HA-Säule ideal für die Trennung von DNA, da sie an das negativ geladene Rückgrat der DNA binden kann.
Eine weitere Form der Säulenchromatographie, die häufig zur Trennung von Proteinen verwendet wird, ist die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC). In der IMAC besitzt die stationäre Phase einen Liganden mit einem Metallion, der an ein Histidin-Tag auf dem interessierenden Protein bindet.
Alle anderen Bestandteile des Gemisches verlassen die Säule. Das Protein wird dann mit einer Lösung von Imidazol, das eine ähnliche Struktur wie Histidin hat, eluiert und bindet stärker an das Metallion.
Eine häufige Anwendung der Säulenchromatographie ist die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Die HPLC wird in der analytischen Chemie sowohl zur Identifizierung als auch zur Trennung von biologischen und nicht-biologischen Verbindungen in einem Gemisch eingesetzt.
Die HPLC ähnelt der Säulenchromatographie, die in diesem Video gezeigt wird, mit dem Unterschied, dass sie automatisiert ist und bei sehr hohen Drücken betrieben wird. Dies ermöglicht die Verwendung kleinerer stationärer Phasenkügelchen mit einem höheren Verhältnis von Oberfläche zu Volumen. Dadurch sind verbesserte Wechselwirkungen zwischen der stationären Phase und Komponenten in der mobilen Phase möglich.
Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Ionenaustauschchromatographie gesehen. Sie sollten nun die Konzepte dahinter, die 4 beteiligten Schritte und einige verwandte Techniken verstehen.
Danke fürs Zuschauen!
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Q1: What is the difference between cation-exchange and anion-exchange chromatography?
Cation-exchange chromatography uses negatively-charged resin to bind positively-charged analytes, while anion-exchange chromatography uses positively-charged resin to bind negatively-charged analytes. The choice depends on the charge properties of your sample mixture and the analyte of interest. Selection of the appropriate resin type is critical for successful separation.
Q2: How does pH affect protein binding in ion-exchange chromatography?
Protein charge depends on pH relative to its isoelectric point (pI). At pH equal to the pI, the protein is neutral and won't bind. Above the pI, proteins are negatively charged; below it, they are positively charged. Buffer pH must be selected so the protein has the correct charge to bind to the resin effectively.
Q3: What are the four main steps in an ion-exchange chromatography procedure?
First, equilibrate the column with buffer to charge the resin. Second, load the sample in low-conductivity buffer so analytes bind based on charge. Third, wash with buffer to remove unbound components. Fourth, elute bound analytes using a salt gradient or high-salt buffer to recover the purified sample.
Q4: Why does salt concentration matter during elution in ion-exchange chromatography?
Salt ions compete with analytes for binding sites on the resin. Weakly bound molecules elute first at low salt concentrations, while strongly bound compounds require higher salt concentrations to disrupt ionic interactions and elute from the column. This allows selective recovery of analytes based on binding strength.
Q5: What types of resin are used in strong versus weak ion-exchange chromatography?
Strong cation-exchange resins feature sulfonic acid groups, while weak cation-exchange resins use carboxylic acids. Strong anion-exchange resins utilize quaternary amines, and weak anion-exchange resins use secondary or tertiary amines. Selection depends on sample properties and the desired separation outcome for your analyte.
Q6: How does ion-exchange chromatography compare to other separation techniques?
Ion-exchange chromatography separates based on charge and is more general than affinity chromatography, which requires specific antibodies for each analyte. Unlike high-performance liquid chromatography, which operates at high pressures with automated systems, ion-exchange uses gravity-driven flow and can be adapted for many proteins with different eluting conditions.
Q7: What is the role of buffer conductivity when loading samples onto an ion-exchange column?
Low-conductivity buffer is essential during sample loading because high salt concentrations cause charged species to compete with the sample for interactions with the resin. This competition reduces binding efficiency and separation quality, so the loading buffer must have minimal salt content to maximize analyte capture on the column.