Ionenaustausch-Chromatographie

1. Vorbereitung der Probe und die Spalte

1. In dieser Demo wird eine Mischung aus 2-Proteine auf einer Kationenaustausch Spalte getrennt werden: Hämoglobin und Cytochrom C. Add 0,2 mL Gleichgewichtherstellung Puffer (pH 8.1) die Protein-Probe und Wirbel, gründlich mischen. Zentrifuge für 2 min, Schaum zu entfernen.
2. Setzen Sie die Kationenaustausch Säule in einem Reagenzglas für 5 min Harz zu begleichen zu ermöglichen. Klemmen Sie das Reagenzglas mit der Spalte auf einen Ring Stand, um sicherzustellen, dass es aufrecht steht.
3. Öffnen Sie die Abdeckkappe der Spalte und die untere Kappe. Lassen Sie den Puffer in der Spalte heraus unter Schwerkraft in das Reagenzglas Tropfen.
4. Waschen Sie die Spalte zweimal mit einem Spalte-Volumen (in diesem Fall die Spalte Volumen beträgt 0,3 mL) von Gleichgewichtherstellung Puffer. Lassen Sie die ersten Spalte-Band (0,3 mL) von Gleichgewichtherstellung Puffer tropft heraus in den Abfall Fläschchen vor der Zugabe der zweiten Spalte-Band. Mit diesem Schritt können die Spalte mit dem Gleichgewichtherstellung Puffer equilibrate. Fügen Sie die Gleichgewichtherstellung Puffer langsam in diesem Schritt das Harz nicht zu stören.

(2) läuft eine Protein-Probe durch eine Kationenaustausch Spalte

1. Legen Sie die Spalte in eine 2 mL Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung "Unbound 1". Laden Sie sorgfältig 0,1 mL der Protein-Probe auf dem oberen Rand der Spalte.
2. Sobald die Probe auf die Oberseite der Spalte geladen wurde, waschen Sie es mit 0,3 mL Gleichgewichtherstellung Puffer durch den Puffer am oberen Rand der Spalte hinzufügen und ermöglicht es, bis hin zu Tropfen. Wiederholen Sie diesen Schritt 4 X (für eine Gesamtmenge von 5 Wäschen) und sammeln Sie jedem Waschen in einem separaten, 2 mL Zentrifugenröhrchen zu. Beschriften Sie die Röhren als "Unbound 1-5".
3. Für die letzten 2 Wäschen Zentrifugieren für 10 s bei 1.000 x g um sicherzustellen, dass alle ungebundene Arten kommen aus der Spalte. Jede Probe, die die Spalte bindet, sollte nicht in diese Waschungen, aber Probe, die nicht bindet wird unretained auswaschen. Zentrifugieren sorgt für mehr Kraft, ungebundene Materialien aus der Spalte zu waschen.
4. Legen Sie die Spalte, in einer neuen 2-mL Sammlung Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung "1 gebunden". Setzen Sie 0,3 mL Elution Puffer (hohe Salz, pH-Wert 5,5) auf die Oberseite der Spalte. Zentrifugieren Sie die daraus resultierenden Laufmittel für 10 s bei 1.000 x g.
5. Wiederholen Sie die Elution Schritt 2 weitere Male indem man die Spalte in einen neuen Zentrifugenröhrchen, Hinzufügen von 0,3 mL und Zentrifugieren für 10 S. Label diese "Bound 2 und 3".
6. Nehmen Sie Farbänderungen oder Beobachtungen über die Fraktionen. Hämoglobin ist ein farbiges Protein, das rötlich-braune sieht zwar Cytochrom C rötlich gefärbt.

3. Ergebnisse: Kationenaustausch von Hämoglobin und Cytochrom C

1. Cytochrom C hat einen pI von 10,5 und Hämoglobin eine pI von 6,8. Also, wenn ein pH 8.1 Gleichgewichtherstellung Puffer verwendet wird, Hämoglobin in die Spalte bindet nicht weil es negativ geladen ist. Cytochrom C ist bei diesem pH positiv geladen und bindet an die Spalte, weil der pH-Wert < pI.
2. Hämoglobin wird in den ungebundenen Fraktionen beobachtet, da sie nicht in die Spalte gebunden ist.
3. Cytochrom C ist in gebundenen Brüche, beobachtet, weil es an den Kationenaustausch Spalte gebunden war.

Abbildung 1. Bild von ungebundenen Bruchteil (Hämoglobin) und gebundenen Bruchteil (Cytochrom C).