Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus-Milz mit dem gentleMACS Dissociator

In diesem Video-Protokoll sehen Sie, wie man Mauszellen mit Gentle Max aufspaltet, einem automatisierten Tischgerät, das Gewebe mechanisch mithilfe spezieller Röhrchen zerkleinern kann, um lebensfähige Zellsuspensionen zu erzeugen. Nach der Aufspaltung werden die Milzen mit Max Pres-Trennfiltern filtriert, zentrifugiert und für weitere Anwendungen suspendiert. Hallo, mein Name ist Melanie mlu.

Ich bin Wissenschaftler bei Milton Biotech hier im BE Lab Park in Deutschland. Heute zeige ich Ihnen die Herstellung einer Einzelzell-Suspension aus der Mausmilz mithilfe der GenX-Dissociation. Die GenX-Dissociation ermöglicht die sehr einfache und schnelle Herstellung einer Einzelzell-Suspension.

Beginnen wir also. Um langwierige und oft schmerzhafte manuelle Dissoziationen zu vermeiden, ermöglicht der gentle max di associator eine sehr effiziente Dissoziation von Gewebe unter kontrollierten und reproduzierbaren Bedingungen. Das Gewebe wird schonend mit violetten C Tubes in lebensfähige Einzelzell-Suspensionen dissoziiert.

Das C-Röhrchen verfügt über eine mit einem Septum verschlossene Öffnung in der Mitte des Verschlusses, wodurch man Pipettieren kann, während die Sterilität stets gewahrt bleibt. Um die dissoziierten Zellen zu suspendieren, müssen Sie den geeigneten P-B-S-B-S-A-E-D-T-A-Puffer verwenden. Der Puffer wird hergestellt, indem man ein Teil Rinder-Serumalbumin-Stammlösung (BSA) zu 20 Teilen AutoMax-Sperrlösung mit EDTA hinzugibt.

Mithilfe der Max-Pres-Trennfilter werden dissoziierte Gewebeproben von allen Zellklumpen befreit, was eine erfolgreiche maximale Trennung und anschließende Analyse ermöglicht. Um das Verfahren zu beginnen, füllen wir die C-Schlauch mit einem Puffer-Volumen. Entsprechend der Masse der Milzen wiegt eine gesunde Milz einer sechs bis sieben Wochen alten weiblichen Biopsie-Maus etwa 80 bis 120 Milligramm.

Jede ein bis zwei Milzen dieser Masse benötigen drei Milliliter Puffer. Überschreiten Sie kein Gesamtvolumen von 10 Millilitern. Wir können nun unsere dissezierte Milz in die C-Röhre geben, die drei Milliliter Puffer enthält. Milzen von älteren Tieren oder Tieren mit Infektionen sind oft größer und müssen im Puffer gewogen werden.

Die Puffervolumina müssen dann entsprechend skaliert werden, dürfen jedoch erneut ein Gesamtvolumen von 10 Millilitern nicht überschreiten. Stellen Sie nun sicher, dass die Kappe des C-Röhrchens fest verschlossen ist, und befestigen Sie das C-Röhrchen am Dissoziator. Bei geschlossener Kappe schalten Sie den Dissoziator für ein bis zwei Milzen ein und wählen Programm M spleen oh one. Das Programm dauert 56 Sekunden bis zur Fertigstellung; bei einer größeren Anzahl von Milzen verwenden Sie Programm M spleen oh four.

Dieses Programm kann für bis zu 720 Milligramm Milzgewebe verwendet werden. Nach Abschluss des Programms wird das native Milzgewebe in eine PLE-Zytosuspension dissoziiert, die wie folgt aussieht: Zentrifugieren Sie kurz, um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln. Dadurch wird sichergestellt, dass Rotor und Stator von allen Zellen befreit werden, die sich am Boden des C-Röhrchens angesammelt haben.

Wir entnehmen die Probe über die mit einem Septum verschlossene Öffnung in der C-Rohrkappe mithilfe einer 1000-Mikroliter-Pipette. Um den Filtrationsschritt zu beginnen, geben wir das dissoziierte Gewebe auf einen Vortrennfilter oder ein Sieb mit einer Porengröße von 30 Mikron. Das Sieb sollte in ein 15-Milliliter-Röhrchen für ein bis zwei Milzen oder in ein 50-Milliliter-Röhrchen für mehr als zwei Milzen passen.

Lassen Sie die Zellsuspension durchlaufen und waschen Sie anschließend den Filter, indem Sie fünf Milliliter Puffer hinzufügen. Zentrifugieren Sie nun das Gefäß mit der Zellsuspension bei 300 G bei Raumtemperatur für 10 Minuten, um alle Zellen in einem Milzzell-Pellet zu sammeln. Nachdem wir nun ein Pellet dissoziiierter Zellen erhalten haben, müssen wir den Überstand abpipettieren und das Zellpellet in einer geeigneten Menge Puffer für die Milzdissoziation resuspendieren.

Die Verwendung des gentle max führt zu einem hohen Prozentsatz an lebensfähigen PLE-Zellen, was mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung des max quant nachgewiesen wird. Tote Zellen werden mit Propidiumiodid gefärbt und im beigefügten Beispiel dargestellt. Das vorwärts-seitwärts gestreute Punktediagramm zeigt vorbereitete SP-Zellen. Okay.

Ich habe Ihnen gezeigt, wie man das Milzgewebe mithilfe dieser sanften X-Dissociation dissociiert. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Menge des Puffers an die Probengröße anzupassen und das geeignete Gentle-X-Programm auszuwählen. Gut, das war's.

Viel Erfolg bei Ihrem Experiment.