Grundlagen der Zucht und Entwöhnung

Jedes Jahr werden Millionen von Mäusen und Ratten für den Einsatz in der biomedizinischen Forschung gezüchtet, und viele Institutionen entscheiden sich dafür im eigenen Haus, um Kosten zu senken und die Forschungsmöglichkeiten zu erweitern. Die Vorteile der eigenen Zucht sind: 1) Die Forscher sind in der Lage, die Genetik der Tiere durch selektive Zucht zu manipulieren, 2) sie können Schwangerschaften so planen, dass sie den Forschungsbedürfnissen entsprechen, und 3) sie können bei Bedarf mit Embryonen und Neugeborenen arbeiten. Um jedoch ein erfolgreiches Zuchtschema einzurichten, sollte man den Brunstzyklus von Nagetieren verstehen. Darüber hinaus sollten sie über Kenntnisse über die verschiedenen Paarungsschemata, die Faktoren, die das Brutverhalten der Nagetiere beeinflussen, und die Überlegungen zum Absetzen verfügen... All dies wird in dieser Videopräsentation besprochen.

Beginnen wir mit einem Überblick über den Brunstzyklus von Nagetieren. Sowohl weibliche Ratten als auch Mäuse sind polyöstros, was bedeutet, dass sie mehr als einen Brunstzyklus in einem Jahr oder einer Brutsaison haben. Jeder Zyklus dauert 4-5 Tage und kann in 4 Stadien unterteilt werden: Metestrus, Diöstrus, Proöstrus und Östrus. Die Brunst ist die ovulatorische Phase, was bedeutet, dass die Frau, wenn sie sich in der Proöstrus- oder Brunstphase befindet, bereit ist, schwanger zu werden.

Eine Möglichkeit, das Stadium des Östruszyklus zu bestimmen, ist die visuelle Untersuchung. Fesseln Sie das Tier manuell am Schwanz und mit den Vorderpfoten auf einem Käfigdeckel und untersuchen Sie sorgfältig die Größe der Vaginalöffnung und das umliegende Gewebe. Während der Proöstrusphase ist die Scheidenöffnung breit und zeichnet sich durch eine Schwellung des umgebenden Gewebes aus, das rosa gefärbt und sehr feucht ist. Oft gibt es Falten oder Streifen entlang der dorsalen und ventralen Ränder der Öffnung. Während der Brunst wird die Schwellung um die Vaginalöffnung herum reduziert und das Gewebe ist nicht mehr so feucht und rosa. Während der Metestrus ist die Vaginalöffnung minimal und es kommt zu einer vernachlässigbaren Schwellung. Während des Diöstrus kommt es zu keiner Schwellung des Gewebes um den Vaginalbereich und die Öffnung ist klein oder geschlossen.

Ein weiterer, genauerer Ansatz zur Bestimmung des Östruszyklusstadiums ist die vaginale Zytologie, bei der Zellproben entweder durch Spülung oder Abstrich entnommen werden. Für die Spülung legen Sie einen Latexkolben auf das Ende einer sterilen 200-Mikroliter-Spitze und ziehen Sie etwa 100 Mikroliter steriles, doppelt destilliertes Wasser in die Pipette auf. Hebe als Nächstes die Maus aus dem Käfig und lege sie mit dem Schwanz in deine Richtung auf den Drahtkäfig. Fassen Sie den Schwanz fest und heben Sie die Hinterhand der Maus so an, dass nur die Vorderpfoten den Deckel greifen. Platzieren Sie das Ende der gefüllten Spitze an der Öffnung des Vaginalkanals, ohne in die Öffnung einzudringen. Drücken Sie vorsichtig auf die Glühbirne, um etwa 25-50 Mikroliter Wasser an der Vaginalöffnung auszustoßen. Die Flüssigkeit wird spontan in den Kanal aspiriert, ohne dass die Spitze eingeführt werden muss. Lassen Sie langsam den Druck ab, der auf den Kolben ausgeübt wird, und die Flüssigkeit zieht sich in die Spitze zurück. Wiederholen Sie dies 4-5 Mal mit derselben Spitze, demselben Kolben und derselben Flüssigkeit, um eine ausreichende Anzahl von Zellen in einer einzigen Probe zu erhalten. Geben Sie die Flüssigkeit auf einen Objektträger und lassen Sie den Abstrich bei Raumtemperatur vollständig trocknen. Nach dem Trocknen können diese Östrusabstriche für die spätere Verwendung aufbewahrt werden, oder sie können sofort mit dem Wright-Giemsa-Fleck gefärbt werden, der ein einstufiger Fleck ist und keine Fixierung erfordert. Der Objektträger wird 45 bis 60 Sekunden lang in den Fleck gelegt.

Befeuchten Sie zum Abtupfen einen 2 mm starken Applikator mit Wattespitze mit Kochsalzlösung. Führen Sie die Spitze des Applikators in die Vagina der gefesselten Maus ein und drehen und rollen Sie die Spitze vorsichtig gegen die Scheidenwand. Entfernen Sie dann vorsichtig den Tupfer und geben Sie die Zellen auf einen trockenen Objektträger, indem Sie den Tupfer über den Objektträger rollen. Dieses Verfahren gilt als stressig und kann Schäden verursachen, wenn es nicht sanft, mit der richtigen Zurückhaltung und mit den Wattestäbchen in der richtigen Größe durchgeführt wird. Wie bei der Spülung kann der Objektträger, sobald er trocken ist, mit dem Wright-Giemsa-Fleck gebeizt werden. Nach der Färbung können die Objektträger unter dem Mikroskop untersucht werden.

Befindet sich das Weibchen in der Proöstrus, werden die Zellen als Ansammlungen von runden, wohlgeformten, kernhaltigen Epithelzellen mit einem Zellkern gesehen, der dunkler färbt als das Zytoplasma. Befindet sie sich in der Brunstphase, handelt es sich bei der Mehrzahl der Zellen um verhornte Plattenepithelzellen, denen ein Zellkern fehlt. Sie haben ein kantiges Aussehen und sind in dicht gepackten Clustern. Wenn sich das Weibchen in der Metestrus befindet, handelt es sich in der Regel um weiße Blutkörperchen, insbesondere Neutrophile, mit einigen verhornten Plattenepithelzellen. Während der Distrus sind die vorhandenen Zellen normalerweise weiße Blutkörperchen mit dem Vorkommen einiger kernhaltiger Epithelzellen.

Nachdem Sie nun ein Verständnis für den Brunstzyklus von Nagetieren haben, lassen Sie uns besprechen, wie Sie die Paarung einrichten. Der erste Schritt ist die Bestimmung des Geschlechts, die durch den Vergleich der anogenitalen Abstände erfolgt. Bei Frauen ist der Abstand zwischen dem Anus und den äußeren Genitalien kürzer als bei den Männern. Basierend auf dem Forschungsbedarf und der Zuchteffizienz des Stammes kann das Paarungsschema monogam sein - bei dem ein Weibchen mit einem Männchen verpaart wird ODER polygam - bei dem zwei oder mehr Weibchen mit einem Männchen verpaart werden.

Da der Brunstzyklus der Nagetiere kurz ist - nur 4-5 Tage lang - kann man die Paarung nach dem Zufallsprinzip einrichten. Oder sie können eine "zeitgesteuerte Paarung" einrichten, bei der das Weibchen in den Paarungskäfig eingeführt wird, wenn es sich am Punkt der maximalen Empfänglichkeit und Fruchtbarkeit befindet - also während der Prostrus oder der Brunstphase. In jedem Fall sollte die Paarung am Ende eines Tages stattfinden, da Nagetiere nachtaktiv sind und dazu neigen, sich nachts zu paaren. Am nächsten Morgen wird das Weibchen auf einen Kopulationspfropfen untersucht - eine weißliche Masse aus Vaginalflüssigkeit und Sperma, die 12-24 Stunden nach der Kopulation bestehen bleibt. Wenn der Kopulationsplug optisch nicht sichtbar ist, führe die Spitze einer stumpfen Sonde vorsichtig in die Vaginalöffnung ein. Das Vorhandensein eines kopulatorischen Plugs behindert das Vorschieben der Sonde innerhalb von 0,5 cm um die Vaginalöffnung. Im Falle einer zufälligen Paarung dauert das Auftreten des kopulatorischen Plugs in der Regel drei Tage. Das Vorhandensein eines Plugs bestätigt, dass die Paarung keine Garantie dafür ist, dass das Weibchen trächtig ist.

Sobald ein kopulativer Pfropfen beobachtet wird, sollte das Weibchen auf Anzeichen einer Schwangerschaft wie Gewichtszunahme überwacht werden. Wenn die gestopfte Hündin schwanger ist, dann ist der Tag, an dem der Plug gefunden wurde, der embryonale Tag Null oder E0 und der nächste Tag gilt als erster Tag der Schwangerschaft oder E1 und so weiter bis zur Geburt, d.h. der Geburt, die zwischen dem 19. und 21. Tag liegt. Etwa 20-24 Stunden nach der Geburt durchlaufen sowohl weibliche Ratten als auch Mäuse eine Brunst und können wieder schwanger werden.

In einer intensiven Zucht, die häufig bei Tieren mit einer kurzen Brutlebensdauer aufgrund einer genetischen Mutation angewendet wird, werden die männlichen Tiere mit dem Weibchen und den Jungtieren im Käfig belassen, damit das Weibchen sofort einen weiteren Wurf zeugen kann. Dieses Schema kann für das Weibchen stressig sein, da es ständig laktiert und trächtig wird. Im Gegensatz dazu besteht die nicht-intensive Zucht darin, das Weibchen zu trennen, sobald es sichtbar trächtig ist, und es erst nach der Entwöhnung seines Wurfes in den Käfig des Männchens zurückzubringen, was es zu einem weniger anspruchsvollen Zuchtschema macht.

Es gibt viele Faktoren, die die Zuchtleistung von Mäusen und Ratten beeinflussen können. Schauen wir uns einige von ihnen an, die häufiger vorkommen. Die Vitalität weiblicher Züchter hängt weitgehend vom Grad der Inzucht ab. Tiere, die ausgezüchtet werden, sind viel widerstandsfähiger und kräftiger, so dass sie größere und stärkere Würfe produzieren. Ein weiterer Faktor, der die Zuchtleistung beeinträchtigen kann, ist aggressives Verhalten. Einige häufig verwendete Stämme, wie z. B. C57BL/6-Mäuse, neigen dazu, Aggressionen zu zeigen, die die Zucht beeinträchtigen können. Bei der Zucht eines aggressiven Stammes sollten alle Würfe genau beobachtet werden. Tiere aus einem Wurf mit aggressiven Jungtieren sollten nicht für die Zucht verwendet werden. Temperatur-, Feuchtigkeits- und Lichtschwankungen können zu einer Verringerung der Zuchteffizienz führen. Es hat sich auch gezeigt, dass Lärm und Vibrationen in den Zuchträumen schädliche Auswirkungen haben. Tiere mit genetischen Veränderungen sind tendenziell weniger widerstandsfähig und fruchtbar, und einige der Mutationen können zur Letalität der Jungtiere vor oder kurz nach der Geburt führen.

Schauen wir uns nun kurz an, wie man Welpen von diesen Labortieren entwöhnt. Der Zeitpunkt bis zum Beginn der Entwöhnung ist je nach Zuchtschema unterschiedlich. Bei nicht intensiver Zucht können die Jungen im Alter von 21-28 Tagen entwöhnt werden. Bei intensiver Zucht werden die Welpen jedes Wurfes jedoch am 20. Tag entwöhnt, um zu verhindern, dass die älteren Welpen anwesend sind, wenn der nächste Wurf geboren wird. Da Nagetiere bereits im Alter von 8 Wochen mit der Paarung beginnen können, werden männliche und weibliche Jungtiere bei der Entwöhnung getrennt. Wann immer möglich, sollten frisch entwöhnte Welpen nicht einzeln untergebracht werden.

Enthält ein Wurf nur ein Junges eines bestimmten Geschlechts, sollte versucht werden, dieses Jungtier mit Welpen des gleichen Geschlechts aus einem anderen Wurf unterzubringen. Die möglichen Haltungsmöglichkeiten für die Entwöhnung von Welpen sind im untenstehenden Manuskript aufgeführt. Entwöhnte Mäuse und Ratten sollten täglich untersucht werden, um sicherzustellen, dass sie gedeihen. Für die Futterversorgung sollte in den ersten 7-10 Tagen eine kleine Menge Futter, ein Pellet pro Maus, auf den Käfigboden gelegt werden, mit zusätzlichem Futter in der Käfigoberseite. Dies wird die Tiere dazu ermutigen, Nagetierfutter als einzige Nahrungsquelle zu haben. Für die Wasserversorgung sollte eine Flasche hinzugefügt werden, auch wenn die Tiere auf Gestellen mit automatischem Tränkesystem untergebracht sind. Dies dient dazu, eine Dehydrierung zu verhindern.

Schauen wir uns zum Schluss an, wie Wissenschaftler den hauseigenen Züchtungsansatz zu ihrem Vorteil nutzen. Eine der häufigsten Anwendungen der Paarung ist die Entwicklung von Mäusen mit verändertem Genotyp. Um die Funktion eines Gens zu untersuchen, stören Forscher oft seinen genetischen Code. Diese Tiere sind jedoch wie der Mensch diploid und haben somit zwei Kopien desselben Gens. Um das Gen vollständig zu stören, müssen die veränderten Mäuse so gezüchtet werden, dass sie ein Tier erzeugen, bei dem beide Kopien dysfunktional sind, mit anderen Worten ein homozygoter Knockout. Mäuse mit einer dysfunktionalen Kopie werden als heterozygot oder hets bezeichnet.

Der andere Vorteil der Einrichtung einer internen Verpaarung besteht darin, die Wirkung der pränatalen Exposition gegenüber Testverbindungen zu testen. Hier gaben die Forscher beispielsweise einer schwangeren Frau eine flüssige Diät, die Alkohol von E7 bis E13 enthielt. Auf E13 sezierten sie dann das schwangere Weibchen, erhielten fötale Gehirne und schnitten sie in dünne Schnitte. Schließlich zeigte die Färbung der Objektträger, dass die pränatale Alkoholexposition den Zelltod im Nervengewebe erhöhte.

Schließlich ermöglicht die hauseigene Zucht auch die Erforschung von Störungen nach der Schwangerschaft wie der postpartalen Depression. In dieser Studie brachten die Wissenschaftler den Müll zunächst während der Stillzeit vom Muttertier weg. Dann, 60 Minuten später, wurden die Jungtiere wieder an das Muttertier herangeführt. Und um Stress beim Weibchen zu erzeugen, fügte es dem Käfig einen neuartigen männlichen Eindringling hinzu. Dann beobachteten die Forscher den Damm für mütterliche Aggression, zu der auch das Angreifen und Beißen des Eindringlings gehört, sowie für verschiedene mütterliche Betreuungsverhaltensweisen wie Welpenpflege und Stillen. Die erhaltenen Daten zeigten, dass Stress einen signifikanten Einfluss sowohl auf die postpartale Aggression als auch auf die Fürsorge der Mutter hat.

Sie haben gerade das Video von JoVE über die Grundlagen der Zucht und Entwöhnung von Mäusen und Ratten im Labor gesehen. Sie sollten jetzt ein besseres Verständnis des Brunstzyklus von Nagetieren haben und auch wissen, wie Sie das Zyklusstadium bestimmen und wie Sie es nutzen können, um erfolgreiche Paarungsschemata einzurichten. Wir haben auch die Faktoren überprüft, die das Zuchtverhalten beeinflussen können, und erklärt, wie und wann Mäuse und Rattenbabys entwöhnt werden sollten. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!