Diagnostische Nekropsie und Gewebeentnahme

Die Autopsie, d. h. die postmortale Untersuchung von Organen, und die Gewebeentnahme sind integrale Bestandteile vieler Laborexperimente, die sich auf die endgültigen Zeitpunkte der Datenerfassung stützen, die aus den Analysen der entnommenen Organe gewonnen werden. Daher ist es wichtig, die richtige diagnostische Autopsie und Gewebeentnahmetechnik zu erlernen, da das Verfahren die Qualität der entnommenen Proben erheblich beeinträchtigen kann. In dieser Präsentation wird die Methode der Dissektion und Extraktion von Bauch-, Fortpflanzungs- und Thoraxorganen von Labortieren überprüft.

Bevor mit dem Verfahren begonnen wird, sollte ein Formular erstellt werden, das eine vollständige Anamnese des Tieres enthält: Tieridentifikationsnummer, Geschlecht, Haltungsbedingungen, Geburtsdatum, Sterbedatum, Studien-/Protokollnummer und den Namen des Hauptprüfers.

Bereiten Sie als Nächstes den Sezierbereich vor. Legen Sie eine Tischabdeckung, ein Seziertablett und für die Autopsie vorgesehene Instrumente wie Schere, Pinzette, sterile Skalpellklinge, Knochenschneider, stumpfe Sonde, kleinen Spatel und nicht resorbierbares Nahtmaterial aus. Bei der Organ- und Gewebeentnahme für die histologische Untersuchung muss das Gewebe in einer Fixierlösung konserviert werden. Sofern nicht anders angegeben, ist das am häufigsten verwendete Fixiermittel 10% neutral gepuffertes Formalin. Beachten Sie, dass die Gewebeproben 0,5 bis 1 cm dick sein sollten, um ein ausreichendes Eindringen der Fixierlösung zu ermöglichen. Die Fixierung verhindert Zerfall, Autolyse und Fäulnis; stoppt alle laufenden biochemischen Reaktionen; und kann die mechanische Festigkeit und Stabilität des behandelten Gewebes erhöhen.

Auch die Methode der Euthanasie des Tieres kann sich auf die Qualität der Proben auswirken. Die am häufigsten angewandte Euthanasiemethode bei Mäusen und Ratten ist eine Überdosierung von Kohlendioxidgas. Die Tiere werden in ihrem Heimatkäfig belassen, der in eine Kammer gesetzt wird, und das CO2 wird nach und nach mit einer Verdrängungsrate von 10-30 % des Kammervolumens/min in die Kammer eingebracht. Dies führt dazu, dass die Tiere vor der Schmerzwahrnehmung das Bewusstsein verlieren, was mit der Aktivierung von Nozizeptoren durch Kohlensäure verbunden ist. Der Fluss wird dann in der Kammer aufrechterhalten, bis ein Atemstillstand eingetreten ist und das Tier tot ist.

Nach der Sterbehilfe ist zunächst eine erste äußere Untersuchung durchzuführen, indem der Kadaver visuell auf Läsionen und Massen, übermäßiges Zahnwachstum oder Verfärbungen des Fells an Mund, Nasenlöchern, Ohren, Augen sowie den Anal- und Genitalöffnungen untersucht wird. Falls gerechtfertigt, führen Sie einen Klebebandtest, Hautabschürfungen und Felluntersuchungen durch, um äußere Parasiten zu erkennen. Sobald die äußere Untersuchung abgeschlossen ist, ist es an der Zeit, mit der Autopsie zu beginnen, beginnend mit der Bauchhöhle. Beachten Sie, dass es wichtig ist, das Organ vor der Entnahme von Gewebeproben in situ zu beobachten.

Um mit der Entfernung der Haut zu beginnen, platzieren Sie einen kleinen Schnitt direkt vor dem Becken bei Frauen und oberhalb der Vorhaut bei Männern. Lösen Sie dann mit der stumpfen Dissektionstechnik die Haut von den Faszien und Muskeln. Die stumpfe Dissektion ist eine Technik der anatomischen Dissektion, bei der Gewebe getrennt und die darunter liegenden Strukturen ohne Schnitt freigelegt werden. Bei dieser Technik wird die Schere verwendet, um das Gewebe auseinander zu spreizen, anstatt es auseinanderzuschneiden. Die geschlossenen Spitzen werden in das Gewebe geschoben und dann geöffnet, um das Gewebe entlang der natürlichen Ebenen zu spalten. Dieser Prozess erfordert Geduld und Fingerspitzengefühl, da die Dehnung des Gewebes zu Schäden an angrenzenden Organen und Blutgefäßen führen kann. Verlängern Sie dann den Schnitt bis zum Kinn. Als nächstes machen Sie Querschnitte vor den hinteren Gliedmaßen und hinter den Vordergliedmaßen und verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um den Halsbereich und die Brust freizulegen. Besondere Vorsicht ist geboten, um einen Riss der Halsschlagadern und Halsschlagadern zu vermeiden.

Bei Weibchen, bei denen die Haut herausgeschnitten ist, beobachten Sie das Brustgewebe von der Oberseite des Brustbeins am Manubrium bis zur Genitalöffnung auf der Bauchfläche; seitlich auf beiden Seiten auslaufend. Stillende oder trächtige Hündinnen haben ein erhöhtes Volumen des Brustgewebes und es kann Milch vorhanden sein. Um die Brustdrüsen zu entfernen, fassen Sie den Geweberand mit einer Pinzette und lösen Sie mit stumpfer Dissektion die Anhaftungen an der Haut. Sobald die Drüse abgetrennt wurde, kann sie für die anschließende histologische Analyse in eine Fixierlösung gelegt werden.

In diesem Stadium können Sie submandibuläre Speicheldrüsen beobachten, die gepaart und am Unterkiefer angeordnet sind und sich entlang des Halses bis zum Manubrium sternum erstrecken. Die Entfernung dieser Drüsen erfordert eine stumpfe Dissektion und besondere Sorgfalt bei Arbeiten im Gebärmutterhalsbereich, um einen Bruch der Blutgefäße zu verhindern. Sobald Sie sich von den darunter liegenden Muskeln befreit haben, heben Sie die Drüsen an und durchtrennen Sie alle verbleibenden Ansätze. Die Drüsen benötigen mindestens einen Schnitt, um das Eindringen des Fixiermittels zu ermöglichen.

Außerdem sieht man die Luftröhre, die sich von der Epiglottis bis zur Bifurkation der Bronchien erstreckt. Es handelt sich um eine geriffelte, knorpelige Röhre, die flexibel ist. Obwohl die Euthanasie mit CO2 normalerweise klar ist, kann sie zu einer Flüssigkeitsansammlung in der Lunge und der Luftröhre führen, die wie eine schaumige, klare Flüssigkeit aussieht. In diesem Bereich ist auch subkutanes Fett vorhanden. Bewerten Sie es auf Menge und Ablagerung. Ein adipöses Tier kann eine große Menge Fett haben und die Haut fühlt sich verdickt an.

Beobachten Sie vor dem Öffnen der Körperhöhle die Bauch-, Interkostal- und freiliegenden Nackenmuskeln und Gliedmaßen auf Verdickungen, Massen oder Verfärbungen. Um die Körperhöhle zu öffnen, machen Sie zunächst einen kleinen Querschnitt an der kaudalsten Stelle des freiliegenden Bauchmuskels. Heben Sie dann den Muskel von den Organen weg und schneiden Sie entlang der Linea alba bis zum Xiphoid. Als nächstes präparieren Sie die Muskeln seitlich von der Mittellinie bis knapp über die hinteren Gliedmaßen auf beiden Seiten. Zum Schluss entlang der Wölbung der Rippen auf beiden Seiten einschneiden. Sobald die Körperhöhle geöffnet wurde, beurteilen Sie die Menge und Ansammlung von Bauchfett. Ein gesundes Tier hat Bauchfettpolster und etwas Fett entlang der Rückenfläche in der Höhle. Beobachten Sie die Farbe dieses Gewebes und notieren Sie eventuelle Anomalien.

Jetzt sind wir bereit, mit der Entnahme von Bauchorganen zu beginnen. Beginnen Sie damit, die Milz zu lokalisieren, die dunkelrot ist und sich entlang der unteren Krümmung des Magens befindet. Er sollte eine regelmäßige Form haben und eine leicht matte Oberfläche haben. Um die Milz zu entfernen, heben Sie das Organ an und schneiden Sie die Ansätze am Magen ab.

Der Magen befindet sich am distalen Ende der Speiseröhre. Er scheint zweifarbig zu sein, wobei er den Muskel- und den Drüsenanteil unterscheidet. Fühlen Sie es für das Vorhandensein von Lebensmitteln. Ein leerer Magen sollte beachtet werden, da er auf eine Krankheit hinweisen kann. Schneiden Sie nicht in den Magen, da der Inhalt die Organe in der Bauchhöhle kontaminiert.

Der Dünndarm ist distal und unterhalb des Magens verbunden. Es gibt drei verschiedene Abschnitte des Dünndarms. Der erste ist der Zwölffingerdarm - ein kürzerer Abschnitt vom hinteren Magenschließmuskel bis zum Anfang des Jejunums. Hier tritt der Gallengang ein und das Bauchspeicheldrüsengewebe wird fester mit diesem Teil des Dünndarms verbunden. Das Jejunum ist der mittlere Teil. Peyer-Flecken, kleine ovale Bereiche, die aus lymphatischem Gewebe bestehen, können auf der Oberfläche des Jejunums und des Ileums beobachtet werden. Das Ileum ist der längste Teil des Dünndarms, der am Blinddarm endet - der sich an der Verbindung von Dünn- und Dickdarm befindet. Der Blinddarm erscheint grünlich und ist sehr weich.

Der Dickdarm setzt sich vom Blinddarm bis zum After fort. Es ist leicht zu identifizieren, da Fäkalienpellets innerhalb des Lumens dieser Struktur sichtbar gemacht werden können. Der Dünn- und Dickdarm sind durch das Mesenterium, eine Membran, die Blutgefäße, Fett und Lymphknoten enthält, mit dem Körper verankert. Dieser sollte vor der Entnahme des Darmtraktes auf vergrößerte Lymphknoten und eventuelle Raumforderungen untersucht werden. Die Bauchspeicheldrüse ist ein diffuses Organ, das sich hinter dem Magen befindet. Es hat eine hellbraune bis graue Farbe und besteht aus mehreren kleinen Lappen mit unregelmäßigen Rändern. Um eine Bauchspeicheldrüse zu entnehmen, fassen Sie das Organ und ziehen Sie es vorsichtig aus dem umgebenden Mesenterialgewebe heraus. Dies muss vor der Entnahme des Darmtraktes erfolgen.

Um den gesamten Trakt in einem Stück zu entfernen, beginnend mit dem Magen und bis zum Anus, platzieren Sie zuerst eine Ligatur am Rektum und machen Sie dann einen Schnitt durch den Dickdarm direkt vor dem Anus. Als nächstes platzieren Sie eine Ligatur an der Verbindung von Speiseröhre und Magen, woraufhin der gesamte Darmtrakt angehoben und alle membranösen Ansätze durchtrennt werden können. Das Ganze kann dann vom Mesenterium getrennt, in Stücke geschnitten und fixiert werden.

Die Nieren sind paarige Organe, die sich an den Muskeln des Rückens befinden. Sie sollten die Größe und Farbe einer dunklen Kidneybohne haben und eine glatte Oberfläche haben. Unmittelbar vor der Niere befindet sich die Nebenniere, die als kleiner hellrosa Knoten erscheint.

Um eine Niere zu entfernen, isolieren Sie sie mit einer Pinzette und schneiden Sie zwischen dem Organ und dem Harnleiter. Anschließend kann die zähe äußere Schicht abgezogen werden, um die Oberfläche zu untersuchen. Schneiden Sie eine Niere entlang der Längsachse in zwei Hälften und die andere quer. Jeglicher Sand im Inneren kann auf das Vorhandensein von Kristallen oder mineralischen Ablagerungen hinweisen. Entfernen Sie zum Schluss die Leber, die eine dunkelrote Farbe hat und deren Ränder glatt mit einem scharfen Rand sein sollten. Beim Umgang mit der Leber ist Vorsicht geboten, da es sich um ein brüchiges Gewebe handelt. Jede Störung der Integrität des Organs führt dazu, dass Blut in die Körperhöhle eindringt und andere Organe verdeckt.

Um die Leber zu entfernen, reflektieren Sie zunächst die Lappen vorsichtig vom Zwerchfell weg und machen Sie einen Schnitt durch die Blutgefäße vor der Struktur. Reflektieren Sie dann die Leber zurück zum Zwerchfell und fassen Sie den fibrösen Knoten, der alle Lappen zentral verbindet. Heben Sie zum Schluss das Organ an, während Sie alle Ansätze zum Darmtrakt und zum Magen durchtrennen.

Das weibliche Fortpflanzungssystem besteht aus der Gebärmutter und den Eierstöcken. Die Gebärmutter ist eine kurze Y-förmige Struktur mit Hörnern, die sich in beide Richtungen erstrecken. Die Hörner enden an den Eileitern und den Eierstöcken - direkt unter den Nieren. Die Eierstöcke haben aufgrund der unterschiedlichen Reifungsstadien der Follikel eine raue Oberfläche.

Um die Eierstöcke zu entfernen, werden die arteriellen Ansätze anterior und der Eileiter posterior durchtrennt. Um die Gebärmutter zu entfernen, greifen und schneiden Sie vorsichtig unter den Gebärmutterhals. Heben Sie nach dem Schnitt den Körper und die Hörner der Gebärmutter an und brechen Sie alle Ansätze in der Körperhöhle.

Bei Männern können Sie auch die Präputialdrüsen beobachten, die sich direkt vor der Vorhaut befinden. Sie erscheinen groß und haben eine graue bis gelbliche Farbe mit einem schaumigen Aussehen. Die Entfernung und Fixierung dieser Drüsen ist ähnlich wie bei den Unterkieferdrüsen. Darüber hinaus besteht das männliche Fortpflanzungssystem aus Samenbläschen, der Prostata und den Hoden. Die Samenbläschen sind weiße, "Widderhorn-förmige" Strukturen, die sich vor der Harnblase befinden und an der Mittellinie an der Prostata befestigt sind.

Die Prostata - in der Regel hellbraun in der Farbe - befindet sich um die Harnblase an der Basis. Um die Hoden sichtbar zu machen, fassen Sie die Bauchfettpolster im Unterbauch und ziehen Sie sie nach vorne. Dadurch werden die Hoden aus dem Hodensack gezogen, um eine Untersuchung zu ermöglichen. Die Oberfläche sollte glatt sein und eine feine Vaskularisation aufweisen.

Der Nebenhoden verläuft am unteren Rand des Hodens und verjüngt sich nach oben. Der Samenleiter wird am Ende des Nebenhodens befestigt und führt zurück in die Prostata. Um die Hoden zu entfernen, schneiden Sie den Ansatz am Hodensack ab und durchtrennen Sie die Samenleiter. Um die Prostata und die Samenbläschen zu entfernen, fassen Sie die Basis der Harnblase und heben Sie sie an, während Sie die Ansätze unter der Prostata durchtrennen.

Weiter geht es zu den Organen in der Brusthöhle. Um die lebenswichtigen Strukturen freizulegen, entfernen Sie das Zwerchfell aus dem Ansatz an den Rippen. Schneiden Sie dann den Brustkorb seitlich auf beiden Seiten bis zur Spitze des Manubrium sternum durch und reflektieren Sie dann die Knochen kranial, um die Thoraxorgane sichtbar zu machen.

Die Lunge hat normalerweise eine leuchtend rosa Farbe, eine schwammige Textur mit einer glatten Oberfläche. Die Euthanasie mit CO2 kann jedoch Lungenblutungen verursachen, die zu dunkelroten Flecken führen, die die gesamte Lungenoberfläche bedecken können.

Das Herz ist dunkelrot und die Ventrikel sind muskulös, die sich fest anfühlen. Die Vorhöfe sind dunkler rot gefärbt und sitzen am oberen Rand der Herzkammern. Sie sind viel weniger muskulös und wirken schlaff. Eine dünne durchscheinende Membran, die als Perikardsack bezeichnet wird, umgibt das Herz.

Der Thymus befindet sich vor dem Herzen und sitzt über der Luftröhre. Es sollte eine glatte Textur haben. Man kann die Luftröhre so sehen, wie sie zuvor beschrieben wurde, und die Speiseröhre ist eine sehr dünne Röhre, die direkt hinter der Luftröhre und hinter dem Herzen liegt und durch das Zwerchfell in den Magen gelangt.

Um die Organe in der Brusthöhle zu entfernen, beginnen Sie damit, die Luftröhre direkt über dem Thymus zu fassen und einen senkrechten Schnitt direkt vor der Pinzette zu machen. Heben Sie die Luftröhre bei Beibehaltung des Griffs kaudal an und schneiden Sie alle Ansätze der Lunge an der Wirbelsäulenoberfläche im Brustkorb ab. Die Speiseröhre muss möglicherweise durchtrennt werden, um das Herz und die Lunge aus der Brusthöhle befreien zu können

Nachdem das Herz für den Körper entfernt wurde, spülen Sie es mit Kochsalzlösung, um Blutreste und Gerinnsel zu entfernen, oder füllen Sie es mit dem Fixiermittel durch die Aorta. Sobald die Lunge herausgeschnitten ist, legen Sie eine lose Ligatur um die Luftröhre. Fädeln Sie dann eine Nadel, die an einer Spritze mit dem Fixiermittel befestigt ist, in das Lumen der Luftröhre ein und ziehen Sie die Ligatur fest. Injizieren Sie dann das Fixiermittel, bis die Lunge aufgebläht ist. Entfernen Sie abschließend die Nadel und ziehen Sie die Ligatur weiter fest, um ein Auslaufen zu verhindern.

Mit diesem Hauch von Wissen über die Nagetier-Autopsie und die Gewebeentnahme schauen wir uns einige der aktuellen Laborexperimente an, bei denen diese Verfahren zum Einsatz kommen.

Die diagnostische Autopsie ist ein häufiger Endpunkt in Experimenten zur Krebsmetastasierung. In diesem Beispiel injizierten die Forscher Krebszellen in die Milz des Nagetiers Dreißig bis sechzig Tage später führten sie eine Autopsie durch, bei der erhebliche Lebermetastasen festgestellt wurden.

Auf die Gewebeentnahme folgt oft eine histologische Analyse, die bei der Untersuchung der mikroskopischen Anatomie der Probe hilft. Durch die Befolgung des Protokolls der Fixierung, Einbettung, Teilung und Färbung von Geweben sind die Forscher in der Lage, die mikroskopischen Strukturen in diesen Organen zu untersuchen und die Auswirkungen genetischer oder pharmakologischer Eingriffe auf atomarer Ebene aufzudecken.

Manchmal entnehmen Forscher Gewebe, um physiologische Prozesse wie die Angiogenese zu untersuchen. Hier exteriorisierten die Experimentatoren das Mesenterialgewebe einer Ratte, um das Gefäßwachstum zu stimulieren. Dann entnahmen sie einige Schnitte und behandelten sie mit den Markern, die die Zellen eines Blutgefäßes färben, um die zelluläre Dynamik zu untersuchen, die am Wachstum des Gefäßnetzwerks beteiligt ist.

Sie haben sich gerade das Video von JoVE angesehen, in dem die Schritte der diagnostischen Autopsie und der Gewebeentnahme bei Labortieren beschrieben werden. Es ist wichtig, geeignete Techniken für die Organentnahme und -konservierung zu verwenden, damit das Extraktionsverfahren keinen Einfluss auf die Interpretation der gesammelten Daten hat. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!