Sterile Gewebeentnahme

Viele Experimente erfordern die Entnahme von Zellen aus dem exzidierten Gewebe. In solchen Fällen ist es zwingend erforderlich, dass die Gewebeentnahme steril durchgeführt wird. Durch die Verwendung von Zelllinien und Gewebekulturen, die von Versuchstieren stammen, können viele Versuche in vitro durchgeführt werden, was wiederum den Tiereinsatz in der Forschung reduziert.

In diesem Video werden wir die aseptische Methode zur Entnahme von häufig entnommenen Organen von Labortieren diskutieren. Darauf folgt ein kurzer Überblick über einige Beispielexperimente, bei denen diese sterile Technik eingesetzt wird, um unterschiedliche Forschungsziele zu erreichen.

Beginnen wir mit den Vorbereitungsschritten, die erforderlich sind, um die Sterilität des Raums, der Instrumente und des Personals während der Entnahme von tierischem Gewebe zu gewährleisten.

Dieses Verfahren wird in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt. Vor dem Vorgang sollte das Haubengebläse mindestens 15 Minuten laufen und der Bereich mit 70% Alkohol desinfiziert werden. Legen Sie dann einige Papiertücher in die Haube und befeuchten Sie sie mit 70% Ethanol. Laden Sie danach die sterilen Geräte und organisieren Sie sie in der Reihenfolge, in der jedes Instrument verwendet wird, normalerweise von links nach rechts. Dadurch kann der Arbeitsablauf unidirektional ablaufen, wodurch eine versehentliche Kontamination durch den Tierkörper verhindert wird.

Es wird empfohlen, dass ein nicht steriler Techniker anwesend ist, um den Steriltechniker zu unterstützen. Beide Betreiber müssen eine Maske und einen Bouffant tragen. Der Sterilisationstechniker muss einen sterilen Kittel und zwei Paar sterile OP-Handschuhe anziehen. Beachten Sie, dass der Kittel und die Handschuhe die Handgelenke bedecken müssen, um zu verhindern, dass Hautzellen in die geöffnete Körperhöhle, Petrischalen oder sterile Medien gelangen.

Die unsterile Person öffnet die sterile Instrumentenverpackung, ohne die Innenfläche zu berühren, so dass die sterile Person das Werkzeug aseptisch entnehmen kann. Zuletzt euthanasiert der unsterile Techniker das Tier, legt den Kadaver auf die Papiertücher und tränkt ihn vollständig mit 70%igem Alkohol, damit die sterile Person mit der Ernte beginnen kann.

Zunächst werden wir die Extraktion von Bauchorganen wie Milz, Leber, Nieren, Eierstöcke und Hoden untersuchen.

Führen Sie mit einer sterilen Schere und Pinzette einen horizontalen Schnitt in die Haut direkt vor der Vorhaut bei Männern und in den Beckenknochen bei Frauen durch. Vermeiden Sie es, die Bauchmuskulatur zu durchtrennen. Legen Sie als Nächstes Ihren Daumen unter den Schnitt und fassen Sie den Schädelrand des Schnitts. Halten Sie mit der anderen Hand die hinteren Gliedmaßen und den Schwanz fest, während Sie die Haut in Richtung Kopf ziehen. Die Haut reißt sich direkt über den Hintergliedmaßen vom Körper ab und kann über dem Kopf und den Vorderbeinen auf links gedreht werden. Dadurch werden Haarverunreinigungen, die den sterilen Organraub beeinträchtigen könnten, effektiv entfernt. Tränken Sie den Körper dann erneut mit 70% Alkohol und ziehen Sie das oberflächliche Paar Handschuhe aus, die nicht mehr steril sind. Entsorgen Sie auch alle Instrumente, die auf der Haut verwendet wurden.

Um die Milz zu entnehmen, positionieren Sie den Körper in der rechten Seitenlage. Die Milz sollte durch den Bauchmuskel sichtbar sein. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt direkt über der Milz und ziehen Sie das Organ vorsichtig aus der Körperhöhle zurück. Schneiden Sie alle Ansätze zwischen der Milz und dem Magen- und Bauchspeicheldrüsengewebe ab, aber vermeiden Sie es, das Organ zu durchstechen oder zu reißen.

Um alle anderen Bauchorgane zu entnehmen, legen Sie den Körper in Rückenlage. Heben Sie dann den Bauchmuskel an und schneiden Sie ihn weg, so dass eine ovale Öffnung direkt über der Bauchhöhle verbleibt. Um die Leber zu entnehmen, reflektieren Sie das Organ kaudal vom Zwerchfell weg. Lösen Sie nun mit einer Schere vorsichtig die Membranen zwischen den beiden Strukturen durch. Machen Sie als nächstes einen Schnitt senkrecht zur Wirbelsäule durch die Blutgefäße. Hebe dann die Leber an und reflektiere sie in Richtung des Zwerchfells, um die darunter liegenden Ansätze zu visualisieren. Es gibt dünne Membranen, die die kleineren Leberlappen mit dem Magen und dem Dünndarm verbinden. Fassen Sie den fibrösen Knoten in der Mitte der Leber an der Unterseite und heben Sie das Organ an, um alle Ansätze zu finden. Trennen Sie nun das Organ von den darunter liegenden Geweben. Beachten Sie, dass die Leber zerbrechlich ist und leicht durchstochen werden kann, was zu einer übermäßigen Freisetzung von Blut führt. Daher muss vorsichtig damit umgegangen werden.

Um die Nieren zu entnehmen, schieben Sie den Darm nach links, um die rechte Niere freizulegen, oder nach rechts, um die linke Niere freizulegen. Fassen Sie nun mit den Zangenklingen unter die Niere und schneiden Sie mit einer Schere unter die Pinzette, um das Organ aus dem Körper zu entfernen.

Um die Eierstöcke zu entnehmen, bewegen Sie den Darm kranial, um die Gebärmutter sichtbar zu machen. Folgen Sie dem linken und rechten Gebärmutterhorn bis zu den Eierstöcken. Dabei handelt es sich um kleine Organe, die bei älteren Tieren in Fett eingebettet sein können. Schieben Sie die Pinzette unter den Eierstock, um sie vom Körper zu isolieren und vom Fett und dem Eileiter zu befreien.

Bei Männern greifen Sie zur Entfernung der Hoden vorsichtig nach dem Leistenfettpolster und ziehen Sie nach vorne. Dadurch wird der Hoden aus dem Hodensack gezogen. Sobald sie sichtbar werden, schneiden Sie die Ansätze am Hodensack und am Samenleiter ab, um diese Strukturen vom Körper zu befreien.

Als Nächstes lernen wir, wie man Thoraxorgane wie Herz und Lunge entnimmt. Herz und Lunge lassen sich am einfachsten zusammen entfernen. Um die Brusthöhle zu öffnen, beginnen Sie damit, das Tier in die Rückenlage zu legen. Erfassen und heben Sie zunächst den Xiphoid-Prozess an. Machen Sie dann einen Schnitt durch den Bauchmuskel nur kaudal bis zu den Rippen. Verlängern Sie den Schnitt entlang der unteren Wölbung des Brustkorbs auf beiden Seiten, so dass die Membran freigelegt wird.

Als nächstes stechen Sie das Zwerchfell durch, indem Sie an der äußersten Stelle auf jeder Seite einen kleinen Schnitt in den Brustkorb machen. Schneide dann das Zwerchfell von den Rippen ab. Hebe nun die Rippen am Xiphoid an, um die Thoraxorgane sichtbar zu machen. Verlängern Sie den seitlichen Schnitt auf beiden Seiten bis zum oberen Rand des Brustbeins, um die Brust zu öffnen. Platzieren Sie dann die Pinzette senkrecht zur Luftröhre und fassen Sie die Luftröhre fest. Machen Sie nun mit einer Schere einen senkrechten Schnitt direkt vor der Pinzette. Dadurch sollen die Luftröhre und die Speiseröhre durchtrennt werden. Ohne den Griff an der Luftröhre zu lockern, heben Sie sie kaudal an und schneiden Sie alle Befestigungen der Lunge an der Wirbelsäulenoberfläche im Brustkorb ab. Fahren Sie fort, bis Sie in der Lage sind, das Herz und die Lunge aus der Brusthöhle zu heben.

Um nur das Herz zu entfernen, heben Sie das Organ an und schneiden Sie vorsichtig durch den Perikardsack. Halten Sie dann die Aorta mit der Pinzette fest und machen Sie einen Schnitt distal zur Pinzette. Durchtrennen Sie dann die vordere Hohlvene, die Lungenarterien und die Venen. Danach sollten Sie in der Lage sein, das Herz aus der Brusthöhle zu heben.

Schauen wir uns nun das Verfahren der Entnahme des Gehirns mit der aseptischen Technik an. In Fällen, in denen das Gehirn das einzige Organ ist, das entnommen wird, sind die Vorbereitungsschritte die gleichen.

Um die Ernte zu beginnen, sättigen Sie den Körper mit Alkohol und entfernen Sie die Haut vom Körper wie zuvor - bis über den Schädel. So kann ab diesem Zeitpunkt alles steril sein. Tränken Sie das Tier dann wieder mit Alkohol, ziehen Sie die äußeren Handschuhe aus und entsorgen Sie die auf der Haut verwendeten Instrumente. Machen Sie nun einen Schnitt im Nacken und verlängern Sie diesen entlang der Mittellinie vom dorsalen Halsbereich bis zur Nasenspitze.

Machen Sie nun mit einer sterilen Gehirnentnahmeschere einen Schnitt durch die Wirbelsäule an der Schädelbasis. Um den Schädel zu öffnen, legen Sie die Spitze der Schere in das Foramen magnum und schneiden Sie entlang der Mittellinie. Beachten Sie, dass bei dieser Gehirnentnahme eine Hand als unsteril gilt, da sie die Haut des Schädels greift, die sich unter dem Kinn spiegelt, um den Kopf zu stabilisieren, während die sterile Hand zum Schneiden des Schädels verwendet wird. Danach hebeln Sie mit der flachen Kante der Scherenklinge die Scheitelknochen vom Gehirn weg. Und mit dem Spatel vorsichtig die Nervenansätze am Hirnstamm und das Chiasma opticum unter dem Gehirn aufbrechen. Schieben Sie zum Schluss die geschlossene Pinzette nach vorne und brechen Sie die Aufsätze an den Riechkolben. Und das Gehirn kann dann aus dem Schädel direkt in das sterile Medium fallen gelassen werden.

Nachdem wir nun die Grundlagen der sterilen Gewebeentnahme besprochen haben, wollen wir einige der vielen Anwendungen dieses Verfahrens in der biomedizinischen Forschung besprechen.

Forscher von neuralen Stammzellen verwenden eine sterile Entnahmetechnik, um Gewebe aus dem Gehirn von Neugeborenen von Mäusen zu extrahieren und diese Zellen in vitro zu züchten. Auf diese Weise können sie die Rolle neuronaler Stammzellen bei der Entwicklung und dem Fortschreiten von Krebs untersuchen.

Ein weiterer aktiver Forschungsbereich, der sich mit der Gewebeentnahme befasst, ist das metabolische Profiling, bei dem die Gewebephysiologie untersucht wird, indem die verschiedenen Metaboliten in einer Probe analysiert werden. In diesem Beispiel sammelten Wissenschaftler mit aseptischer Technik Leberbiopsien von Wildtyp- und keimfreien Mäusen und verwendeten die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR), um den Unterschied im Leberstoffwechselprofil der beiden Tierpopulationen aufzuklären.

Schließlich führen Immunologen häufig eine sterile Gewebeentnahme durch, um die Ausbreitung der Infektion zu untersuchen. In diesem speziellen Experiment führten die Forscher eine intratracheale Injektion des Bakteriums Pseudomonas aeruginosa durch, um eine chronische Lungeninfektion auszulösen. Danach wurden die Tiere eingeschläfert und die Lungen mit aseptischer Technik extrahiert, um die Bakterienlast 3, 7, 14 und 28 Tage nach der Infektion zu bestimmen.

Sie haben gerade das Video von JoVE über die Entnahme von Gewebe von Labortieren mit aseptischer Technik gesehen. Du solltest jetzt ein besseres Gefühl dafür haben, welche Schritte Du unternehmen musst, um sicherzustellen, dass die Sterilität während der gesamten Ernte erhalten bleibt. Und Sie sollten in der Lage sein, die Bauch- und Brustorgane sowie das Gehirn dieser Tiere zu extrahieren, ohne das Gewebe zu schädigen. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!