Single Molecule Methoden zur Überwachung von Veränderungen in Bilayer Elastic Properties

Hallo, ich bin Dr. Ola Anderson aus der Abteilung für Physiologie und Biophysik am Weill Cornell Medical College in New York City. Mein Name ist Olson. Ich bin ein Doktorand im Bereich der computerbasierten Biomedizin im Labor von Olive Anderson.

Und ich bin Shail Collingwood, eine wissenschaftliche Technikerin aus dem Anderson-Labor. Heute zeigen wir Ihnen, wie man eine Ebene, eine Biomembranschicht, herstellt, wie man eine kleine Membran mit der Biolayer-Punch-Elektrode isoliert, wie man die Aktivität einzelner Kanäle aufzeichnet und wie man die Ergebnisse analysiert, um auf diese Weise Gramin-Kanäle als Sonden für die Eigenschaften der Lipid-B-Schicht zu verwenden. In einem vorherigen Video haben wir Ihnen gezeigt, wie Sie sich auf diese Experimente vorbereiten.

Wir haben Ihnen gezeigt, wie man die Kammer vorbereitet, die wir verwenden, und wie man die Bilayer-Stanz-Elektrode vorbereitet, mit der wir die kleine Membranlage isolieren, in der wir die Kanalaktivität aufzeichnen. Also los, stänchen wir einige Bilayer. Um die Vorbereitung für Bilayer-Experimente zu beginnen, geben Sie 2,5 ml der temperaturgeglichenen Elektrolytlösung in jedes Fach der vorgespannten Kammer. Die Lösung, die wir üblicherweise verwenden, besteht aus einem Mol Natriumchlorid pro Liter zuzüglich 10 Millimol.

Das Stück wird auf pH 7 gepuffert; stellen Sie das Mikroskop und die Lichtquelle so ein, dass das Loch im Teflon mittig im Sichtfeld liegt und hell beleuchtet ist. Führen Sie die Glas-Mikropipette in einen Mikroelektrodenhalter ein. Verbinden Sie eine Spritze mit dem Halter über ein Stück Tigon-Schlauch.

Füllen Sie die Pipette im Elektrodenhalter durch Absaugen. Achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden, da diese die elektrische Verbindung zwischen dem Silberpellet im Elektrodenhalter und der Pipettenspitze unterbrechen könnten. Tragen Sie eine geringe Menge Vaseline auf das Gewinde auf und setzen Sie es anschließend in den Mikroelektrodenhalter ein.

Das Vaseline hilft dabei, eine luftdichte Abdichtung zu erzielen. Stecken Sie den Elektrodenhalter in die Patcherfassungs-Kopfstufe innerhalb der Faraday-Käfig. Positionieren Sie die Mikropipettenspitze mittig und direkt hinter der Öffnung in der Teflon-Trennwand.

Platzieren Sie die aufgerollte Silberelektrode in die vordere Kammer. Befestigen Sie sie mit Modelliermasse und verbinden Sie sie mit dem Spannungssteuerkreis. Schließlich gleichen Sie die Elektroden aus.

Dies ist entscheidend, da die beiden Elektroden, die vordere Elektrode und die im Mikroelektrodenhalter, leicht unterschiedliche Halbzellenpotentiale aufweisen können. Das Halbzellenpotential ist die Differenz zwischen dem Silbermetall der Elektrode und der Elektrolytlösung in unmittelbarer Nähe der Silberchlorid-Beschichtung. Kompensieren Sie die Elektroden, indem Sie den manuellen Offset so einstellen, dass der Stromfluss zwischen den beiden Kompartimenten an der Patch-Clamp-Anordnung zwischen minus 200 und plus 200 Pikoa mpere schwankt.

Das Offset-Potential ändert sich mit der Zeit, daher kompensieren Sie die Elektroden in regelmäßigen Abständen während des gesamten Experiments, um die Lipiddoppelschichtmembran zu bilden. Reinigen Sie eine feinpolierte Pasteur-Pipette mit FCH-Lösung, wie im begleitenden Video beschrieben. Tauchen Sie die gereinigte Pipette in die Lipid-Beschichtungslösung und lassen Sie diese etwa einen Millimeter in die Pipette aufsteigen.

Platzieren Sie die Pipettenspitze direkt vor der Öffnung in der Teflon-Trennwand und tragen Sie vorsichtig eine Blase der Lipidlösung auf die Öffnung auf. Bei Erfolg bildet sich eine hell gefärbte Lipidblase über die Öffnung hinweg, die durch eine Taurus- oder donutförmige Lipidschicht mit der Teflon-Trennwand verbunden ist. Lassen Sie die Membran ausdünnen, was durch Anlegen einer Potentialdifferenz von 100 bis 200 Millivolt über die Membran unterstützt werden kann.

Platzieren Sie die Spitze der Glas-Mikropipette in den Taurus und lassen Sie sie einige Minuten ruhen, um eine bessere Abdichtung zwischen der Pipette und der Doppelschicht zu gewährleisten. An diesem Punkt können Sie nun mit der Glas-Mikropipette einen Membranfleck isolieren. Dopen Sie nun die Membran mit Gramin.

Diese Gramin-Lösung wurde aus einem einmolaren Mikromolar-Stammlösung hergestellt, die auf ein bis zehn Nanomolar verdünnt wurde. In Dimethylsulfoxid werden üblicherweise ein bis zehn Mikroliter der Verdünnung jeder Seite der Membran hinzugefügt, sodass die Endkonzentration im Pikomolar-Bereich liegt. Verwenden Sie die magnetischen Rührstäbchen, um die Lösung etwa zwei Minuten lang zu rühren, und warten Sie weitere zehn Minuten, bevor Sie eine neue kleine Membran zur Aufzeichnung der Einzelkanalaktivität bilden.

Diese Einwirkzeit ermöglicht es, Gramin in die Membran einzubauen. Überprüfen Sie die Kanalaktivität, indem Sie eine Spannung anlegen. In der Regel streben wir etwa ein Kanalereignis pro Sekunde an.

Die Kanäle sind als diskrete Anstiege und Abfälle des Membranstroms sichtbar. Sie können nun mit dem eigentlichen Experiment beginnen. Zunächst werden die Kontrollstromspuren aufgezeichnet.

Den Elektroden wie zuvor gezeigt ausgleichen, einen kleinen Membranfleck oder Patch wie im begleitenden Video beschrieben bilden. +200 Millivolt anlegen und die Einzelkanalaktivität aufzeichnen. Es sollten 100 bis 200 Einzelkanal-Stromübergänge erfasst werden.

Wiederholen Sie diesen Schritt mit minus 200 Millivolt. Lösen Sie den Patch, indem Sie Elektrolyt durch die Pipettenspitze ausstoßen. Stellen Sie mit der Nylon-Schraube das Gleichgewicht der Elektroden wieder her, ziehen Sie die Pipette in die hintere Kammer zurück, blasen Sie überschüssiges Lipid aus und bilden Sie einen neuen Patch.

Sie können diese Schritte auch wiederholen, um Aufnahmen bei anderen Potentialen durchzuführen. Nun sind Sie bereit, die experimentellen Stromspuren am Doppelschicht-Modifikator aufzuzeichnen. In diesem Fall handelt es sich bei dem Antidepressivum um Fluoxetin, das auf beiden Seiten der Membran hinzugefügt wird.

Die Fluoxetin-Stammlösung sollte in DMSO auf 25 Millimolar verdünnt werden. Geben Sie fünf Mikroliter dieser Lösung hinzu, um eine Konzentration von 50 Mikromolar in der Kammer zu erreichen. DMSO kann die Eigenschaften der Doppelschicht beeinflussen. Daher ist es wichtig, die Menge an DMSO in der Lösung auf 25 Mikroliter (1 % oder 150 Millimolar) zu begrenzen.

Rühren Sie fünf Minuten lang und warten Sie anschließend 10 Minuten, um dem Modifikator Zeit für die Verteilungsgleichgewichtung zwischen der wässrigen Lösung und der Membran zu geben. Nehmen Sie nun die Kanalaktivität wie zuvor beschrieben in Gegenwart des Modifikators auf. Wiederholen Sie diese Schritte, um die Kanalaktivität bei steigenden Konzentrationen des Modifikators aufzuzeichnen.

Wir erfahren viel über Veränderungen in der Doppelschicht, indem wir die Lebensdauern und Auftretensraten von Kanälen quantifizieren. Für eine solche Analyse müssen wir die Kanalbildung und das Verschwinden von Kanälen detektieren. Hier verwenden wir einen transitionsbasierten Algorithmus, bei dem der Computer die erste Ableitung berechnet, um schnelle Änderungen des Stroms zu erkennen, und diese als Kanalereignisse markiert.

Die Ereignisse werden als Zeitreihe gespeichert, um uns bei der Bestimmung der Kanal-Lebensdauern vor und nach dem Übergang zu unterstützen. Die Stromstufen werden ebenfalls gespeichert und helfen dabei, die Kanalamplituden während des laufenden Experiments zu bestimmen. Der Computer erstellt ein Histogramm der Stromübergangsamplituden, das es Ihnen ermöglicht, die Erfassung von Stromübergängen zu verfolgen.

Es ermöglicht Ihnen außerdem, die Qualität des Experiments zu beurteilen. Wenn die aktuellen Übergangsamplituden stark streuen, liegen Probleme vor. Wenn das Histogramm eng ist, verläuft das Experiment gut.

Wenn Sie mehr als 200 Übergangsereignisse gesammelt haben, berechnen Sie den durchschnittlichen Strom und die Standardabweichung für die Übergänge im Hauptpeak. Sie können die Kanal-Auftretensrate einfach abschätzen, indem Sie die Anzahl der Übergänge im Strom-Übergangsamplituden-Histogramm durch die Beobachtungszeit teilen. Denken Sie daran, zusätzlich durch zwei zu teilen, da ein Kanal im Histogramm zweimal gezählt wird – einmal beim Auftreten und einmal beim Verschwinden.

Analysieren Sie die Zeitreihe der Übergangsereignisse, um die Verteilungen der Kanallebensdauern zu erhalten. Die Bestimmung der Lebensdauern ist unkompliziert bei Stromspuren, bei denen zu keinem Zeitpunkt mehr als ein leitender Kanal vorhanden ist. In diesem Fall erkennt der Computer, ob jeder Übergang einem Auftreten oder Verschwinden des Kanals entspricht, und ein Verschwindenereignis kann nur dem vorhergehenden Auftretenereignis zugeordnet werden.

Die Zeit zwischen den beiden Übergängen ist die Kanallebensdauer. In Fällen, in denen die Kanalübergänge zu nahe beieinander liegen, um sie unterscheiden zu können, müssen Sie Erscheinungen und Verschwinden manuell zuweisen. Die Zuordnung ist komplizierter, wenn zwei oder mehr gleichzeitig leitende Kanäle vorliegen, da nun nicht bekannt ist, welches Verschwinden eines Kanals zu welchem Erscheinen gehört.

Aus diesem Grund ist eine geringe Kanalaktivität vorzuziehen. Sie können das Zuordnungsproblem lösen, indem Sie einen Zufallszahlengenerator verwenden, um Erscheinungen den Verschwinden zuzuordnen. Auf diese Weise erhalten Sie eine Reihe von Kanallebensdauern.

Dies wird in ein Lebensdauer-Histogramm umgewandelt, das wiederum in eine Überlebenskurve umgewandelt wird, um die durchschnittliche Lebensdauer durch Anpassung einer einzelnen exponentiellen Verteilung an die Überlebenskurve mittels nichtlinearer Kleinste-Quadrate-Kurvenanpassung zu bestimmen, und zwar bei Experimenten, bei denen die große Membran nicht reißt. Wenn man den Doppelschicht-Modifikator hinzufügt, kann man den Einfluss auf die Kanal-Auftretensraten vergleichen. Ein solcher Vergleich ist nicht gerechtfertigt, wenn die große Membran bricht, da die Funktion von Membranproteinen durch die Lipidzusammensetzung der Zellmembran reguliert wird.

Diese Regulation beruht auf einer Kombination spezifischer Lipid-Protein-Wechselwirkungen und allgemeinerer Wechselwirkungen zwischen der Lipiddoppelschicht und den Membranproteinen. Diese Wechselwirkungen sind besonders wichtig in der pharmakologischen Forschung. Da viele der derzeit auf dem Markt befindlichen Arzneimittel amphiliph sind und die Eigenschaften der Lipiddoppelschicht verändern können, was wiederum zu einer veränderten Funktion der Membranproteine führen kann.

Gramin-Kanäle können als molekulare Kraftwandler verwendet werden, um zu erfassen, ob Amphiphile die Eigenschaften der Lipiddoppelschicht verändern können. Die Auftragung der Änderungen der Lebensdauer und der Erscheinungsrate als Funktion der Modifikator-Konzentration liefert Einblicke in Veränderungen der Doppelschichteigenschaften.

Erhöhte Frequenz bedeutet, dass die Doppelschicht leichter verformt werden kann, um die Gram-Seite und Dimerisierung zu ermöglichen. Eine verlängerte Lebensdauer bedeutet, dass die mit der Kanalbildung verbundene Deformation der Doppelschicht energetisch weniger aufwendig ist. Ein Modulator kann die Frequenz und Lebensdauer erhöhen, indem er die Membranelastizität steigert oder die Krümmung beeinflusst.

Wir haben nun gezeigt, wie Chromokanäle genutzt werden können, um zu überprüfen, ob kleine Moleküle die elastischen Eigenschaften von Doppelschichten verändern. Und das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen.

Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.