Name: Herstellung künstlicher Doppelschichten für Elektrophysiologie Experimente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-31T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Lernen Sie die Herstellung planarer Lipid-Doppelschichten für Elektrophysiologie-Experimente. Diese Methode ermöglicht präzise Einzelkanal-Messungen zur Untersuchung ionenleitender Kanäle in kontrollierten Umgebungen.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

herstellung künstlicher doppelschichten für elektrophysiologie experimente

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar Lipid-Doppelschichten, die auch als künstliche Lipid-Doppelschichten, können Sie studieren ionenleitenden Kanälen in einem genau definierten Umgebung. Diese Doppelschichten können für viele verschiedene Studien, wie zum Beispiel die Charakterisierung von Membran-aktive Peptide, die Wiederherstellung von Ionenkanälen oder Untersuchungen darüber, wie Veränderungen in der Lipid-Doppelschicht Eigenschaften verändern die Funktion der Transmembrandomänen Kanäle verwendet werden. Hier zeigen wir, wie man eine planare Doppelschicht bilden und wie kleine Flecken aus der Doppelschicht zu isolieren, und in einem zweiten Video wird zeigen auch ein Verfahren zur Verwendung Gramicidin-Kanäle, um Änderungen in Lipiddoppelschicht elastischen Eigenschaften zu bestimmen. Wir zeigen auch die einzelnen Schritte nötig, um die Doppelschicht Kammer vorzubereiten, die Elektroden und wie man testen, ob der Doppelschicht für Einkanal-Messungen ist.

Planar Lipid-Doppelschichten, die auch als künstliche Lipid-Doppelschichten, können Sie studieren ionenleitenden Kanälen in einem genau definierten Umgebung. Hier zeigen wir die einzelnen Schritte nötig, um die Doppelschicht Kammer vorzubereiten, die Elektroden und wie man testen, ob der Doppelschicht für Einkanal-Messungen ist.

Herstellung künstlicher Doppelschichten für Elektrophysiologie Experimente

Planare Lipiddoppelschichten, auch als künstliche Lipiddoppelschichten bezeichnet, ermöglichen die Untersuchung von ionenleitenden Kanälen in einer genau definierten Umgebung. Diese Doppelschichten können ...

Hallo, ich bin Dr. Olaf Anderson von der Abteilung für Physiologie und Biophysik am Weill Cornell Medical College in New York City. Hallo, ich bin Ruchi Kaur, eine MD-PhD-Studentin im Labor von Dr. Olaf Anderson. Hallo, mein Name ist John Kim.Ich bin ein wissenschaftlicher Techniker. Heute zeigen wir Ihnen, wie man Einzelkanalexperimente an einfachen Lipiddoppelschichten vorbereitet. Wir zeigen Ihnen, wie man die Versuchskammer vorbereitet, und wie man die Bilayer-Punch-Elektroden herstellt.Wir haben die kleinen Membranbereiche, in denen wir die Messungen durchführen, isoliert. Beginnen wir also. Unser elektrophysiologischer Versuchsaufbau besteht aus Folgendem: einem luftgefederten Anti-Vibrations-Tisch zur Minimierung mechanischer Vibrationen, einer Faraday-Käfig zur Abschirmung gegen elektrische Störungen, Schall und Vibrationen sowie einem Stativ.Für die Doppelschichtkammer verwenden wir eine zirkulierende Wasserjacke zur Temperaturkontrolle, in die die Doppelschichtkammer eingebracht wird, sowie einen Mikromanipulator zur Montage der Kopfstufe des Patch-Clamp-Verstärkers. Eine elektronische Filtereinheit dient zur weiteren Filterung des Ausgangssignals des Patch-Clamp-Verstärkers bei 500 Hertz. Zur Visualisierung der Stromübergänge wird ein Oszilloskop verwendet, das sowohl das Ausgangssignal des Patch-Clamp-Verstärkers als auch das der elektronischen Filtereinheit anzeigt.Notwendig ist schließlich ein Computer mit einem Datenerfassungssystem, das das Patch-Clamp-Signal digitalisiert. Wir verwenden eine intern entwickelte Software zur Aufzeichnung und Analyse der Daten bei 20 Kilohertz. Alle Geräte werden 20 Minuten vor Beginn eingeschaltet.Danach bereiten wir die Kammer vor, in der die Experimente durchgeführt werden. Die Kammer ist durch ein Septum in zwei Hälften geteilt, das aus einem dünnen Teflonblatt mit einer Dicke von etwa 100 Mikrometern besteht und mit einer Elektrolytlösung gefüllt ist. Wir bilden die Doppelschicht über die Öffnung im Septum, die eine Verbindung zwischen den Elektrolytlösungen ermöglicht.Das Loch sollte einen Durchmesser von einem bis 1,5 Millimetern haben. Verwenden Sie Vaseline als Dichtmittel, um ein Glasfenster in der vorderen Hälfte der Teflonkammer anzubringen. Führen Sie Edelstahlschrauben durch eine Metallhalterung und die vier Löcher in der hinteren Kammerhälfte. Verwenden Sie Vaseline als Dichtmittel, um eine runde Teflonzwischenwand so anzubringen, dass sie zwischen den beiden Hälften der zusammengesetzten Kammer eingeschlossen wird.Stellen Sie sicher, dass das Loch in der Trennwand mittig sitzt. Tragen Sie Vaseline auf beiden Seiten der Trennwand auf, um sicherzustellen, dass die Elektrolytkammern wasserdicht und elektrisch isoliert sind. Fahren Sie fort, indem Sie die Schrauben durch die vordere Hälfte der Kammer und die vordere Metallhalterung einfädeln.Ziehen Sie die Montage so fest an, dass alle Komponenten sicher gehalten werden, aber nicht zu fest, um die Kammer reinigen und das Vaseline entfernen zu können. Eine Pasteur-Pipette wird angeglüht, poliert und im rechten Winkel gebogen. Das Anschmelzen und Polieren der Pipettenspitze zu einer glatten Oberfläche hilft, Kratzer auf Glas oder Teflon zu vermeiden.Als Nächstes reinigen Sie die Kammer mit einem Gemisch aus zwei Teilen Chloroform und einem Teil Methanol oder mit FCH-Lösung. Entfernen Sie mithilfe der Pipette das überschüssige Vaseline mit der FCH-Lösung, ohne es auf dem Teflon und dem Glas zu verschmieren. Verwenden Sie mindestens das 10-Fache des Volumens an FCH.Wenn dies erledigt ist, werden magnetische Rührstäbchen den Kammern hinzugefügt. Anschließend wird die Kammer mit 95 % Ethanol gereinigt und schließlich mit hochreinem Wasser, entweder destilliertem Wasser, UE-Wasser oder einem gleichwertigen Produkt.Wie zuvor verwenden Sie eine feuerpolierte Pasteurpipette, um die Flüssigkeit aufzusaugen. Abschließend wiederholen Sie die Reinigung mit FCH-Ethanol und Wasser. Danach Wasser, Ethanol und Fol.Nun stellen wir die Glaselektroden-Mikropipette her, die als elektrische Verbindung zum hinteren Kompartiment der Kammer dient. Mit einem P-97 Flaming/Brown-Mikropipettenzug von Sutter Instruments wird die Glaskapillare gezogen, um zwei Mikropipetten herzustellen, von denen jede eine scharfe und kurze Konizität aufweist. Wir verwenden Kapillaren aus Borosilikatglas mit einem Außendurchmesser von 0,8 Millimetern und einem Innendurchmesser von 0,5 Millimetern. Eine Glaskapillare wird in den Polierer eingelegt und zur Vorbereitung des Ziehvorgangs befestigt.Die Elektrode sollte aus Platin bestehen, da wir keine Erfolge erzielt haben. Das Ziehen der Pipetten in Elektrodenpolaren mit Wolfram-Filamenten wird in den nächsten Schritten an einer Mikroschmiede mit Platinfaden durchgeführt. Vor der Verwendung der Mikroschmiede sollte sichergestellt werden, dass der Faden gleichmäßig mit Glas beschichtet ist.Sie können entweder ein weiches Natronkalkglas oder ein hartes Borosilikatglas verwenden. Sie müssen die Temperatur an Ihrer Mikroschmelze so einstellen, dass das Glas gleichmäßig fließt und das Filament dünn und homogen bedeckt. Befestigen Sie nun die Mikropipette in der Mikroschmelze und brechen Sie die Spitze ab.Wir tun dies, indem wir die Glasumhüllung des Filaments bei relativ geringer Hitze vorsichtig erweichen. Dann bewegen Sie die Mikropipettenspitze sanft auf die Glasumhüllung des Filaments zu, sodass beide miteinander verschmelzen. Schalten Sie die Heizung am Filament aus, wodurch dieser sich zurückzieht und die Pipette bricht. Nun verbleibt eine scharfe und gleichmäßige Öffnung mit einem Durchmesser von etwa 30 Mikrometern.Erstellen Sie erneut mit Hilfe des Mikroforges eine rechteckige Biegung in der Mikropipette drei bis vier Millimeter von der Spitze entfernt, positionieren Sie die Pipette einige hundert Mikrometer über dem Filament und schalten Sie dann die Heizung ein, sodass das Filament rotglühend wird. Das Filament bewegt sich aufgrund der thermischen Ausdehnung. Senken Sie dann vorsichtig die Pipette auf das Filament ab, wodurch sich das Filament verbiegt.Sie steuern das Ausmaß der Biegung über die Temperatur des Heizelements. Wenn die Biegung etwa 80 Grad beträgt, bewegen Sie die Pipette schnell nach oben und vorwärts. Dies erfordert eine gewisse Koordination.Sie möchten eine 90-Grad-Biegung mit denselben Einstellungen erreichen. Polieren Sie die Mikropipettenspitze im Flammbrenner, sodass der Filament mit Glas überzogen bleibt. Nun silanisieren wir die Pipettenspitze mit einer 10%igen Lösung von Trioktalsilen in Benzol.Dadurch wird die Pipettenoberfläche hydrophob, sodass sie gut mit der Membran interagiert. Lassen Sie die Lösung durch Kapillarwirkung einige Millimeter in die Pipette aufsteigen. Verdampfen Sie die Lösung mit dem Mikroschweißgerät bei niedriger Temperatur, und Sie sind fertig.Nun zeigen wir Ihnen, wie man die Silberelektrode herstellt. Nehmen Sie ein fünf Zentimeter langes Stück Silberdraht mit einem Durchmesser von etwa einem Millimeter. Wickeln Sie es drei- bis viermal zu einer Spule mit einem Innendurchmesser von zwei bis drei Millimetern auf.Den Rest als Schwanz belassen, der so gebogen wird, dass er im rechten Winkel zur Helix steht. Den Schwanz und die angrenzenden fünf bis zehn Millimeter des Silberdrahts mit geschmolzenem Silberchlorid beschichten. Bereiten Sie nun die Lösung zur Bilayer-Bildung vor.Im vorliegenden Fall handelt es sich um das Lipid Dialphosphatidylcholin in Enddekan. Das Lipid wird in Glasröhrchen bei minus 40 Grad Celsius als 150-Mikroliter-Aliquots aus Lipid und Chloroform gelagert. Entnehmen Sie ein Glasröhrchen aus dem Gefrierschrank, lassen Sie es auf Raumtemperatur erwärmen und verdampfen Sie das Chloroform unter einem Strom von trockenem Stickstoff.Unter chemischer Haube 50 Mikroliter Enddekan hinzufügen und vortexen. Um einen guten Kontakt zwischen der Doppelschicht bildenden Lösung und dem Teflon, das das Loch umgibt, über dem wir die Doppelschicht bilden, zu gewährleisten, streichen wir die Teflon-Partitionswand um das Loch erneut an. Zunächst eine feuerpolierte Pasteur-Pipette mit FCH reinigen.Tauchen Sie die gereinigte Pipette dann in 2,5 % Phospholipid in n-Decan ein, sodass das Lipid etwa einen Millimeter in die Pipette aufsteigt. Geben Sie einen Tropfen Lipid als Film über die Öffnung in der Teflon-Trennwand ab. Lassen Sie das Lipid etwa 10 bis 15 Minuten trocknen und wiederholen Sie den Vorgang. Hallo.Heute haben wir Ihnen gezeigt, wie man Lipiddoppelschichten für Einzelkanalexperimente vorbereitet. Im begleitenden Video zeigen wir Ihnen, wie man kleine Membranabschnitte isoliert, die Aktivität einzelner Kanäle aufzeichnet, die Aktivität mit kleinen Molekülen modifiziert und die Ergebnisse analysiert. Gut, das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen. Viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Unterstützte planaren Doppelschichten sind leistungsfähige Werkzeuge, die verwendet werden, um die molekularen Wechselwirkungen in einer immunologischen Synapse Modell werden können. Hier zeigen wir Methoden zur Verankerung Zelladhäsionsproteine ​​bekannt zu modulieren Synapsenbildung an der oberen Flugblatt der Lipid bilyer und visualisieren Synapsenbildung mit TIRF-Mikroskopie.

Unterstützte Planar-Membranen für die Bildung von Study of immunologischen Synapsen und Kinapse

Membranprotein-Funktion wird durch die Zellmembran Lipidzusammensetzung geregelt. Dieses Video-Artikel beschreibt, wie ein Pflaster mit Doppelschicht-Patch-Elektroden, sowie zur Verwendung von Gramicidin Kanäle als Reporter der veränderten Eigenschaften der Membran bilden.

Single Molecule Methoden zur Überwachung von Veränderungen in Bilayer Elastic Properties

Verfahren zur vollständigen Auflösung des Prototyps spannungsabhängigen Kaliumkanal in Lipid-Membranen beschrieben. Die rekonstituierten Kanäle sind für biochemische Assays, elektrische Aufnahmen, Liganden-Screening und Elektronen kristallographische Untersuchungen geeignet. Diese Methoden können allgemeine Anwendungen auf die strukturelle und funktionelle Studien anderer Membranproteine.

Rekonstitution eines Kv-Kanal in Lipidmembranen für Strukturelle und Funktionelle Studien

Bakterielle mechanosensitive Kanäle können als mechanoelektrische Wandler in biomolekularen Geräten verwendet werden. Tropfenschnittstelle Doppelschichten (DIBs), Zell-inspirierten Bausteine ​​für solche Geräte, stellen neue Plattformen zu integrieren und zu stimulieren mechanosensitive Kanäle. Hier zeigen wir, einen neuen Mikropipette Verfahren zur Bildung DIB, die die Untersuchung mechanosensitiver Kanäle unter mechanischer Stimulation.

Multifunktionale, Mikropipette-basierte Methode für den Einbau und Stimulation der bakteriellen mechanosensitiven Ionenkanäle in Droplet Schnittstelle Bilayers

Wir zeigen eine speicherbare, transportierbar Lipid-Doppelschicht Bildungssystem. Eine Lipid-Doppelschicht-Membran kann mit mehr als 80% Erfolgsquote innerhalb von 1 h gebildet werden, wenn eine gefrorene Membran Vorläufer auf Umgebungstemperatur gebracht wird. Dieses System wird mühsamen Prozesse reduzieren und Know-how mit Ionenkanälen verbunden.

Automatisierte Lipid Bilayer Membrane Formation eines Polydimethylsiloxans Dünnschicht unter Verwendung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Bildung von Lipid Bilayer mit einer Kontakt-Blase Bilayer Methode. Eine Wasser-Blase wird in einem organischen Lösungsmittel, geblasen, wobei eine Monolage an der Wasser-Öl-Grenzfläche gebildet wird. Zwei Pipetten werden manipuliert, um die Luftblasen zu einem Bilayer anzudocken.

Lipid Bilayer Experimente mit Kontakt Blase Bilayer für Patch-reckenden

Weich, nutzen Niederleistungs-biomolekularen Memristoren ähnlicher Zusammensetzung, Struktur und Mechanismen der Bio-Synapsen umschalten. Hier vorgestellten wird ein Protokoll zu montieren und zu charakterisieren, biomolekulare Memristoren aus isolierenden Lipid Bilayer gebildet zwischen Wassertröpfchen in Öl gewonnen. Die Einbeziehung der Spannung aktiviert Alamethicin Peptide Ergebnisse in Memristive ionische Leitfähigkeit durch die Membran.

Montage und Charakterisierung der biomolekularen Memristors bestehend aus Ionenkanal-dotierte Lipidmembranen

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines temperaturgesteuerten Wärmesystems zur Förderung der Lipid-Monolayer-Montage und der Tröpfchen-Schnittstellen-Bilayerbildung für Lipide mit erhöhten Schmelztemperaturen und Kapazitätsmessungen zur Charakterisierung temperaturgetriebener Veränderungen in der Membran.

Temperaturgesteuerte Montage und Charakterisierung eines Droplet Interface Bilayers

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von Zell-imitierenden Uni-Lipid- und Multi-Lipid-Vesikeln, unterstützten Lipiddoppelschichten und suspendierten Lipiddoppelschichten. Diese In-vitro-Modelle können angepasst werden, um eine Vielzahl von Lipidtypen zu integrieren und können verwendet werden, um verschiedene Molekül- und Makromolekül-Interaktionen zu untersuchen.

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung und Analyse der Bindung, Mobilität und Assemblierung einzelner Moleküle auf künstlichen überfüllten Lipidmembranen unter Verwendung der Einzelmolekül-Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (smTIRF) vorgestellt.

Einzelmoleküldiffusion und Assemblierung auf polymerüberfüllten Lipidmembranen

Ein experimentelles Protokoll wird vorgestellt, um Gramicidin-A-dotierte Tröpfchen-Interface-Doppelschichten zusammenzusetzen, elektrisch zu stimulieren und zu analysieren. Lipid-Protein-Struktur-Funktion-Beziehungen werden quantifiziert, indem Veränderungen der Membranfläche, des Ionenflusses und der Einkanal-Leitfähigkeit gemessen und diese Reaktionen auf plastizitätsähnliche Veränderungen der ionischen Leitung in einem von elektrischen Synapsen inspirierten Membranmodell in Beziehung gesetzt...

Lipid-Protein-Membranstruktur-Funktions-Charakterisierung mittels Tropfen-Interface-Doppelschichten

Lernen Sie die Herstellung planarer Lipid-Doppelschichten für Elektrophysiologie-Experimente. Diese Methode ermöglicht präzise Einzelkanal-Messungen zur Untersuchung ionenleitender Kanäle in kontrollierten Umgebungen.

Herstellung künstlicher Doppelschichten für Elektrophysiologie Experimente

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