הדמיית פלואורסצנטיות כמעט אינפרא אדום של מפרצות באבי העורקים בבטן

כפי שהשם מרמז, הדמיית NIRF משתמשת באור בתוך החלון הכמעט אינפרא אדום הראשון, החל מ 650 ננומטר ל 900 ננומטר, כדי לספק פוטונים לתוך רקמה. האנרגיה, E, של פוטון מאופיינת במשוואה 1, שבה h הוא הקבוע של הפלנק, c היא מהירות האור בריק, ו λ הוא אורך הגל של האור.

= (משוואה 1)

מולקולות פלואורסצנטיות ספציפיות למטרה הנקראות פלואורופורים מוזרמות בדרך כלל לחיה באמצעות הנדסה גנטית או באמצעות הזרקת וריד זנב לפני ההדמיה. פלואורופורים אלה סופגים אנרגיית פוטון, אשר מעלה את האנרגיה של המולקולות ממצב הקרקע, S₀, למצב לא יציב, נרגש S₁'. בשל חוסר היציבות של מצב S 1 ' , המולקולות להירגע לרמת האנרגיה הרטט הנמוכה ביותר בתוך מצב זה ולשחרר_אנרגיהבצורה של חום. הפלואורופורים, עכשיו במצב רגוע ונרגש S₁, ואז לחזור למצב הקרקע S₀, פולט אור אורך גל מסוים. האור הנפלט, בעל אורך גל ארוך יותר עקב פיזור האנרגיה בצורת חום, נלכד ומתועד באמצעות מערכת הדמיה פלואורסצנטית. המעבר הבסיסי בין ספקטרום הספיגה והפליטה נקרא משמרת סטוקס והוא חשוב מכיוון שהוא מאפשר להבחין בין אור העירור לאור הפליטה.

ההליך הבא מספק שלבים מפורטים הדרושים לאיסוף תמונות VIVO ו- ex vivo NIRF מבעלי חיים קטנים:

1. התקנה ניסיונית

1. חבר מקור אור סיב אופטי למערכת הדמיית הפלואורסצנטיות באמצעות מדריך אור סיבים אופטיים.
2. בחר את מסנן העירור המתאים עבור הניסוי. מסנן העירור קובע את אורך הגל של האור שיש להעביר למדגם ויש לבחור אותו כדי להתאים את ספקטרום העירור של הפלורופור שהוכנס לדגימה.
3. בחר את מסנן הפליטה המתאים. מסנן הפליטה חוסם רכיבים ספקטרליים לא רצויים, אשר עשויים להיות מיוחסים autofluorescence, ויש לבחור כדי להתאים את ספקטרום הפליטה של הפלורופור.

2. הכנת מדגם

1. ב-Vivo
   1. מרדים את החיה בתא אינדוקציה באמצעות איזופלוראן בריכוז של 3-4% בחיוג מד הזרימה.
   2. מעבירים את החיה לקונוס אף קבוע בשלב ההדמיה, ושומרים על איזופלוראן בריכוז של 1-2%. מקור חום אינו נחוץ מכיוון שבעלי החיים בדרך כלל מצפים רק לפרק זמן קצר (> 5 דקות), וטמפרטורת הגוף שלהם אינה יורדת באופן משמעותי.
   3. אבטחו את כפותיו של בעל החיים כדי למזער את חפצי התנועה. הסר את השיער מאזור העניין על ידי החלת קרם depilatory.
   4. יש למרוח קרם דפילטורי על האזור הקטן ביותר הדרוש. אחרי 30, לנגב אותו עם כרית גזה. לנגב את האזור בפעם השנייה עם כרית גזה לחה אתיל אלכוהול כדי להסיר לחלוטין את קרם depilatory.
   5. יש למרוח משחה עיניים על העיניים כדי למנוע ייבוש הקרניות.
   6. הזריקו את הגשושית המולקולרית הפלואורסצנטית להחיות. עבור יישום ספציפי זה, בדיקות MMP2 הפעלה הוזרקו תוך ורידי לתוך הווריד הזנב. בשלב זה, ניתן לדמיין את העכבר. המשך ל"זיכוי תמונה " של פרוטוקול זה כדי להמשיך. לעקוב אחר החיה לנשימה סדירה לאורך כל ההליך הקצר.
2. אקס ויוו
   1. לאחר הזרקת הגשושית הפלואורסצנטית, המת חסד את החיה בצורה הומאנית על פי הנחיות AVMA לשנת 2013 לאותניה של בעלי חיים. פחמן דו חמצני (CO₂₎מנת יתר היא נוהג מקובל להרדים בעלי חיים קטנים.
   2. לחלץ בניתוח את הרקמה או איבר עניין בזהירות להסיר רקמת שומן עודף עם מלקחיים.
   3. לשטוף את הרקמה מלוחים חוצץ פוספט כדי להסיר את שאריות הדם ומניחים את המדגם ישירות על שלב ההדמיה.

3. רכישת תמונות

1. פתח את תוכנת ההדמיה המולקולרית והדליק הן את מקור האור הסיבים האופטיים והן את מערכת הדמיית הפלואורסצנטיות.
2. פתח את חלון הרכישה וציין את סוג החשיפה המתאימה למחקר. החשיפות הזמינות כוללות: חשיפה סטנדרטית ללכידת תמונה בודדת, חשיפה לשקיעת זמן ללכידת סדרה של תמונות לאורך מרווח זמן קבוע וחשיפה מתקדמת ללכידת רצף רציף של חשיפות בזמני חשיפה שונים.
3. בחר UV-Transillumination כמקור התאורה.
4. באמצעות התמונה בתצוגה מקדימה כהפניה, התאם את מוקד העדשה, את שדה הראייה ואת f-stop/צמצם בתא מערכת הלכידה כדי למטב את איכות התמונה שנדגמה. התאם את זמן החשיפה ואת המיקום של המדגם.
5. סגור את חלון התצוגה המקדימה וודא שכל הפרמטרים בחלון הרכישה תואמים להגדרות המצלמה והסינון.
6. לחץ על 'חשוף' כדי לרכוש ולשמור את התמונה.
7. תוכנת הדמיה מולקולרית סטנדרטית מספקת בדרך כלל מגוון כלים אנליטיים, מדידה ותיקון תמונה כדי לכמת אותות פלואורסצנטיים לניתוח תמונה.
8. בסוף מפגש ההדמיה, הסר את הדגימה/החיה, כבה את המערכת ונקה את שלב ההדמיה כדי למזער את הנזק למערכת.

נציג ב- vivo ותמונות EX VIVO NIRF שנלקחו מכרסמים עם מפרצת באבי העורקים בבטן (AAAs) מוצגות באיורים 1-2. בדיקה פלואורסצנטית להפעלה הוזרקה באופן שיטתי דרך וריד הזנב כדי לדמיין את פעילות המטריצה metalloproteinase-2 (MMP2). MMP2 הוא אנזים אלסטליטי המעורב בהשפלת המטריצה החוץ תאית הממלאת תפקיד מרכזי בייזום והתקדמות של AAA. כל התמונות נרכשו באמצעות מסנן עירור של 625 ננומטר, מסנן פליטה של 700 ננומטר וזמן חשיפה של 60 שניות.

איור 1: נציג בתמונת VIVO NIRF של עכבר E-לקוי אפוליפופרוטאין שפיתח AAA בעקבות עירוי של אנגיוטנסין-II. רוב הכתמים הקטנים המציגים אות גבוה הם מ autofluorescence העור (חצים צהובים). כלי ההשמנה יכול להיות חזותי כמבנים צינוריים עם אותות פלואורסצנטיות גבוהה (חץ אדום). סרגל קנה מידה: 1 ס"מ.

איור 2 מראה עלייה בפעילות MMP2 באזור המפרצת של אב העורקים בבטן, כפי שניתן לראות מהעלייה הנצפית בעוצמת האות ביחס לאזורים בריאים של אב העורקים בבטן. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם תוצאות בספרות המציגות רמות MMP2 גבוהות בתוך AAAs. בדיקות פלואורסצנטיות עודפות היו מסוננות והצטברו בכליות, מה שהוביל אותות פלואורסצנטיים בהירים.

איור 2: תמונות NIRF של AAAs משני מודלים שונים של בעלי חיים: (A) AAA על-קדםי בעכבר אפוליפופרוטאין-E חסר ו-(B) AAA אינפרא-renal בחולדה עם אלסטז לבלב חזירי. חצים צהובים מצביעים על ה- AAAs. מוטות קשקשים: 3 מ"מ.

הדמיית NIRF מסתמכת על בדיקות פלואורסצנטיות כדי לכמת ולדמיין מכלולים ביומולקולריים ברקמות. אנרגיית פוטון נספגת מאור כמעט אינפרא אדום מרגשת מולקולות פלואורסצנטיות למצב אנרגיה גבוה יותר, והאור הנפלט עם אורך גל אופייני ארוך יותר נלכד על ידי מערכת הדמיה פלואורסצנטית. כאן, היישום של הדמיית NIRF כדי ללמוד פעילות MMP2 מפרצת באבי העורקים בבטן הודגם ויוו ו ex vivo. שלא כמו SPECT או PET, אשר נחשבים תקני הזהב בחקר תהליכים מטבוליים בגוף באופן לא פולשני, הדמיית NIRF היא טכניקת הדמיה מהירה וגבוהה תפוקה שאינה כרוכה קרינה מייננת. אחת המגבלות של מודאליות זו היא עומק החדירה הקטן יחסית שלה. למרות מגבלה זו הופכת הדמיה קלינית של רקמות עמוקות למאתגרת, הדמיית NIRF ממלאת תפקיד חשוב בחקר גידולים ומחלות לב וכלי דם בבעלי חיים קטנים.

בהתחשב בבדיקה הפלואורסצנטית המתאימה, ניתן לדמיין מבנים מולקולריים רבים באמצעות הליכי ההדמיה של NIRF שהוצגו כדי לחקור הן את חניכת המחלה והן את ההתקדמות במודלים קטנים של בעלי חיים. יישומי ex vivo ו- in vivo ספציפיים כוללים 1) הערכה של פעילות MMP vasculature מכרסמים, 2) גילוי מוקדם של גידול בסוגים שונים של סרטן, ו 3) הערכה של פרמקוקינטיקה ננו-חלקיקים וייחוס ביולוגי עבור יישומים טיפוליים. בנוסף לפעילות MMP2 מוגברת בתוך AAAs, בדיקות פלואורסצנטיות MMP אחרות נוצלו כדי ללמוד התקדמות טרשת עורקים ולאפיין הרכב מטריצה חוץ תאית לב לאחר אוטם שריר הלב. יתר על כן, ירוק אינודוקינין פלואורופור שימש לחקר זלוף רקמות במודלים מורינים של איסכמיה אחורית. כדי להרחיב יותר על היישום של דימות NIRF על גילוי מוקדם של סרטן, גידול ממוקד צבעי NIRF ניתן להשתמש כדי להעריך את שולי הגידול ולסייע בהליכי כריתה. שילוב של פלואורופורים כמעט אינפרא אדום לתוך חלקיקים שפותחו עבור אספקת תרופות מאפשר למדענים לפתח טיפולים יעילים יותר מבוססי חלקיקים עבור מגוון רחב של מחלות. לבסוף, היכולת למקם באופן מרחבי את האות הפלואורסצנטי בבעלי חיים שלמים או ברקמה שלמה היא יתרון ברור על פני מקרים אנזימטיים קונבנציונליים אחרים (זימוגרפיה של ג'ל) וניתוח חלבונים (כתם מערבי) הדורשים הקרבה של בעלי חיים ורקמות להיות הומוגניות.