Durchflusszytometrie und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS): Isolierung von B-Lymphozyten

Das Immunsystem schützt den Körper vor eindringenden Krankheitserregern, indem es Leukozyten, auch weiße Blutkörperchen genannt, bildet. Wenn ein Erreger erfolgreich einen Organismus infiziert, werden verschiedenste Leukozyten aktiviert und diese koordinierte Reaktion wird als Immunantwort bezeichnet.

Häufig ist es für Forschende nützlich, die spezifische Art und Anzahl der Immunzellen identifizieren zu können, die als Reaktion auf einen Krankheitserreger aktiviert wurden. Die Durchflusszytometrie ist eine Technik, die es Forschern ermöglicht, Zellen anhand spezifischer Epitope zu trennen, die auf ihren Oberflächen exprimiert werden. Dies wird unter Verwendung von Fluorochrom-markierten monoklonalen Antikörpern erreicht, die an bekannte Immunzell-spezifische Epitope binden, und bei Anregung emittieren diese gebundenen Fluorochrome eine Lichtwellenlänge, die von einem Durchflusszytometer detektiert und bewertet werden kann.

Durchflusszytometer bestehen aus drei Systemen. Das fluidische System transportiert Zellen in einem Strom so, dass sie eine nach der anderen vor einem Laser vorbeilaufen. Das optische System besteht aus Lasern und Detektoren, die das Vorhandensein oder Fehlen der Fluorophore erkennen. Schließlich wandelt das elektronische System die gesammelten optischen Daten in elektronische Dateien zur Analyse um.

Eine Erweiterung der Durchflusszytometrie ist der Fluoreszenz-aktivierte Zellsorter (FACS), der die Anreicherung spezifischer Zellpopulationen ermöglicht, so dass sie unabhängig voneinander untersucht werden können. Die Zellsortierung erfolgt über eine vibrierende Düse innerhalb des Fluidikstroms, die Mikrotröpfchen bildet, die jeweils eine einzelne Zelle enthalten. Dann bestimmt ein Detektor, ob von jedem Tröpfchen Fluoreszenzlicht emittiert wird oder nicht, und basierend auf dieser Information gibt ein Elektromagnet jeder Zelle eine negative oder positive Ladung. Anschließend sortiert ein starkes elektrisches Feld die unterschiedlich geladenen Tröpfchen in separate Behälter. Letztendlich wird einer der Behälter eine homogene Population von Zellen enthalten, die auf der Expression eines bestimmten Zelloberflächenmoleküls basiert.

In diesem Video erfahren Sie, wie Sie mit Hilfe der Durchflusszytometrie Leukozyten aus Milzgewebe der Maus isolieren und mit FACS nach B-Lymphozyten selektieren.

Ziehen Sie zu Beginn Laborhandschuhe und die entsprechende Schutzkleidung an. Waschen Sie anschließend eine Präparierschere und -zange zuerst mit Spülmittel und dann mit 70 % Ethanol und trocknen Sie sie dann mit einem sauberen Papiertuch ab.

Geben Sie dann 49 Milliliter Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie einen Milliliter fetales Kälberserum oder FCS hinzu, um eine HBSS 2%ige FCS-Lösung herzustellen, und mischen Sie, indem Sie etwa 10 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren.

Legen Sie als nächstes eine euthanasierte Maus in Rückenlage auf eine Sezierplatte. Führen Sie mit der Schere und der Pinzette eine Längslaparotomie durch, um Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten. Bewege mit der Pinzette den Darm auf der rechten Seite des Bauches zur Seite, um Magen und Milz freizulegen. Die Milz wird am Magen befestigt. Geben Sie dann mit einer Pipette fünf Milliliter des HBSS 2% FCS in eine Petrischale. Löse die Milz vorsichtig mit einer Pinzette vom Magen und lege die Milz in die Petrischale.

Um die Immunzellen zu isolieren, legen Sie die Milz zunächst auf ein 40-Mikron-Zellsieb in einer Petrischale. Zerdrücke die Milz mit einem Kolben, um sie in die Schale zu dissoziieren. Pipettieren Sie dann die dissoziierte Milz und die Flüssigkeit aus der Petrischale in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 370 mal g für sieben Minuten bei 10 Grad Celsius und nehmen Sie dann das Röhrchen vorsichtig heraus, um das Pellet nicht zu stören.

Entfernen Sie nun den Überstand, vermeiden Sie das Pellet und entsorgen Sie die Flüssigkeit in einem geeigneten Abfallbehälter. Geben Sie dann zwei Milliliter ACK-Lysingpuffer in das Zentrifugenröhrchen, um die Erythrozyten zu resuspendieren und zu lysieren. Warten Sie zwei Minuten und fügen Sie dann HBSS 2% FCS hinzu, um ein Gesamtvolumen von 15 Millilitern zu erhalten. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Nehmen Sie das Röhrchen vorsichtig heraus und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet erneut in fünf Millilitern HBSS 2% FCS.

Um die resuspendierten Zellen zu zählen, verdünnen Sie fünf Mikroliter der Zellsuspension mit fünf Mikrolitern Trypanblau. Geben Sie dann vorsichtig einen fünf Mikroliter dieser verdünnten Zellsuspension zwischen das Deckglas und den Malassez-Objektträger. Zählen Sie nun unter einem Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung die Anzahl der vorhandenen Zellen. Passen Sie dann die Zellkonzentration auf 10 bis siebte Zellen pro Milliliter an, indem Sie das entsprechende Volumen HBSS 2% FCS hinzufügen.

Um die Immunzellen zu färben, markieren Sie zunächst sechs FACS-Röhrchen von eins bis sechs. Übertragen Sie dann 200 Mikroliter der Zelllösung in jedes der sechs Röhrchen. Diese Röhrchen werden bei 370 mal g sieben Minuten lang bei 10 Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand entfernt.

Markieren Sie dann sechs neue FACS-Röhrchen als eins bis sechs und pipettieren Sie jeweils 200 Mikroliter HBSS 2 % FCS. Bereiten Sie die sechs neuartigen Antikörpermischungen vor, indem Sie die entsprechende Menge Antikörper in jedes Röhrchen geben, wie in Tabelle eins angegeben. Mix One ist für ungefärbte Zellen ohne Zugabe von Antikörpern. Die Mixe zwei bis fünf enthalten jeweils einen anderen Antikörper für die Kompensationseinstellungen. Mix sechs enthält alle vier Antikörper für mehrfach gefärbte Zellen, die für die Sortierung verwendet werden sollen.

Übertragen Sie anschließend diese Antikörpermischungen in die entsprechenden nummerierten FACS-Röhrchen. Inkubieren Sie diese Lösungen 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius oder auf Eis im Dunkeln. Geben Sie anschließend einen Milliliter HBSS 2% FCS in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie erneut. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern HBSS 2 % FCS. Übertragen Sie abschließend die resuspendierten Pellets in neue markierte FACS-Röhrchen.

Um FACS durchzuführen, schalten Sie zuerst den Sortierer ein. Wählen Sie dann das Zytometer-Menü aus und klicken Sie auf Fluidik-Start. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm.

Klicken Sie auf der Registerkarte "Stream" auf das rote Kreuz, um den Stream einzuschalten, und warten Sie dann 15 Minuten, bis sich der Stream stabilisiert hat. Passen Sie die Amplitude des Strahls an, bis auf der Registerkarte "Stream" ein deutlicher, gelöster Tropfen angezeigt wird. Klicken Sie dann auf den Sweet Spot, um die Amplitudenanpassung abzuschließen. Setzen Sie den ND-Filter (Neutral Density) vor dem Laser ein.

Öffnen Sie das Zytometer-Menü am oberen Bildschirmrand und wählen Sie CST, was für Cytometer Setup and Tracking steht. Um die tägliche Qualitätskontrolle durchzuführen, verdünnen Sie die CST-Kügelchen zunächst mit FACS-Medium in einem FACS-Röhrchen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Laden Sie dann das Röhrchen in die Maschine und führen Sie die CST-Steuerung durch, indem Sie auf der Registerkarte CST auf Ausführen klicken.

Wenn die CST-Steuerung abgeschlossen ist, ersetzen Sie den ND 1.0-Filter durch den ND 2.0-Filter am Zytometer. Verdünnen Sie anschließend die Tropfenverzögerungsperlen gemäß den Anweisungen des Herstellers in FACS-Medium und laden Sie dann das Röhrchen in das FACS. Um eine korrekte Sortierung zu gewährleisten, führen Sie eine Abfallverzögerung durch, indem Sie zuerst auf die Spannung und dann auf den optischen Filter klicken. Der rechte Quadrant des optischen Filters sollte gleich 100 % sein, was bedeutet, dass 100 % der Tropfen von der Maschine registriert werden. Stellen Sie bei Bedarf die rote Laserschraube am Zytometer links oder rechts ein, um 100 % im rechten Quadranten zu erhalten. Es ist darauf zu achten, dass der Strahl in das Auffangrohr fällt. Führen Sie dazu eine Testsortierung durch, indem Sie auf Abfallschublade und dann auf Testsortierung klicken. Prüfen Sie, ob die Nebenströme in die Auffangrohre fallen. Wenn dies nicht der Fall ist, passen Sie die Spannung auf der Registerkarte "Sortierung" an, bis dies der Fall ist.

Navigieren Sie zur experimentellen Vorlage, indem Sie die Registerkarte "Browser" auswählen und auf "Freigegebene Ansicht" klicken. Öffnen Sie dann das Experiment Accudrop_DROP DELAY, und klicken Sie auf die Schaltfläche für das Sortierlayout. Ändern Sie nun die Schwellenwertrate auf dem Erfassungs-Dashboard, indem Sie die Flussrate manipulieren, bis sie 3.000 Ereignisse pro Sekunde erreicht. Klicken Sie auf Spannung und dann auf Optischer Filter. Der linke Quadrant sollte gleich Null und der rechte Quadrant gleich 100 sein.

Klicken Sie abschließend im Fenster für das Sortierlayout auf Sortieren und dann auf Abbrechen. Der linke Quadrant sollte gleich 100 und der rechte Quadrant gleich Null sein. Wenn der linke Quadrant kleiner als 95 ist, klicken Sie auf automatische Verzögerung, um die Software anzuweisen, die Spannung automatisch zu erhöhen, um 100 % der Abfallfälle im linken Quadranten zu erhalten.

Um mit der Durchflusszytometrie zu beginnen, werden wir zunächst ungefärbte Zellen verwenden, um die Zellmorphologie und die negativen Peaks der Fluorochrome zu definieren. Legen Sie dazu das erste Rohr mit den ungefärbten Zellen in das Gerät und klicken Sie auf der Registerkarte des Erfassungs-Dashboards auf Laden. Passen Sie auf der Registerkarte "Zytometer" die Vorwärts- und Seitenstreuspannungen an, bis Sie Ihre Zellpopulation als dichte Konzentration von Punkten auf dem Bildschirm sehen. Lymphozyten sind kleine Zellen, daher haben sie eine geringe Vorwärtsstreuung und eine geringe Seitenstreuung.

Entfernen Sie als Nächstes die Hintergrundfluoreszenz, indem Sie die Spannung für die Fluorochrome auf der Registerkarte "Zytometer" anpassen, bis sich die Zellpopulationen auf einem negativen Niveau in der ersten Dekade auf der Registerkarte "Globales Arbeitsblatt" befinden. Klicken Sie im Zytometer-Menü auf Konfiguration anzeigen und vergewissern Sie sich, dass alle Fluorochrome vorhanden sind. Legen Sie als Nächstes das zweite Röhrchen in das Zytometer und klicken Sie auf Laden. Passen Sie die spektrale Überlappung auf der Registerkarte "Zytometer" an, bis der Median der negativen und positiven Population auf der Registerkarte "Globales Arbeitsblatt" ausgerichtet sind. Legen Sie auf der Registerkarte "Erfassung" den Parameter "Ereignisse auf Aufzeichnung" auf 10.000 fest, und klicken Sie auf "Aufzeichnen". Wiederholen Sie diese Schritte mit den Schläuchen drei, vier und fünf.

Laden Sie als Nächstes das sechste Rohr, das die mehrfach gefärbten Zellen enthält. Um B-Lymphozyten zu isolieren, stellen Sie zunächst die Parameter ein, um die Zellen nach ihrer Morphologie zu sortieren. Plotten Sie im ersten Fenster den Vorwärts-Streubereich FSC-A auf der y-Achse und den SSC-A-Seitenstreubereich auf der x-Achse. Im Streudiagramm stellt jeder Punkt eine Zelle dar. Klicken Sie auf dem globalen Arbeitsblatt auf das Polygon-Gate und wählen Sie dann die Grundgesamtheit mit einer niedrigen Vorwärts-Streuung und einer Zwischen-Seiten-Streuung aus. Klicken Sie in einem neuen Punktdiagrammfenster mit der rechten Maustaste auf das Fenster, wählen Sie im Menü die Option Populationen anzeigen aus, und klicken Sie auf P1.

Dann, im neuen Fenster, gaten Sie die lebensfähigen CD45-positiven Zellen, indem Sie die Lebensfähigkeit auf der y-Achse und CD45 auf der x-Achse darstellen. Verwenden Sie das Polygon-Gate, um die Zellen mit einem niedrigen Viabilitäts- und einem hohen CD45-Signal zu umkreisen, und wählen Sie P2, um die ausgewählten Zellen in einem neuen Fenster anzuzeigen. Im nächsten Fenster wird das Gate für CD45-positive Leukozyten verwendet, ohne T-Lymphozyten. Mit CD45 auf der x-Achse und CD3 auf der y-Achse umkreisen Sie die Grundgesamtheit mit einem hohen CD45-Signal und einem niedrigen negativen CD3-Signal, und wählen Sie P3 aus. Schließlich Gate für CD19-positive Zellen, die die B-Lymphozyten identifizieren. Mit CD19 auf der y-Achse und CD3 auf der x-Achse umkreisen Sie die Grundgesamtheit mit einem hohen CD19-Signal und einem niedrigen negativen CD3-Signal, und wählen Sie P4 aus.

Alle Sortierparameter sind nun eingestellt. Wählen Sie als Nächstes im Fenster für das Sortierlayout die gewünschte Zellpopulation P4 aus, die vierte Population, die gesperrt wurde, und weist die Maschine an, nur B-Lymphozyten zu sortieren. Legen Sie Zielereignisse auf 10.000 Zellen und die Genauigkeit auf Reinheit fest. Wir sortieren nur eine Population. Es können jedoch bis zu vier verschiedene Populationen gleichzeitig sortiert werden. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Sortieren und dann auf OK. Warten Sie dann auf die Zellsortierung.

Sobald die Zellsortierung abgeschlossen ist, führen Sie eine Reinheitskontrolle durch, indem Sie 10 Mikroliter der sortierten Zellen in ein neues FACS-Röhrchen mit 90 Mikrolitern HBSS 2 % FCS pipettieren. Legen Sie das Röhrchen in das Zytometer, klicken Sie auf Laden und dann auf Aufzeichnen, um die Phänotypen der Zellen zu analysieren und zu überprüfen, ob die Gating-Strategie wie beabsichtigt funktioniert hat.

Nun werden wir die sortierten Zellen analysieren, um den prozentualen Anteil der B-Lymphozyten unter den Leukozyten zu bestimmen, die aus der Milz der Maus isoliert wurden. Um zu beginnen, doppelklicken Sie auf das FlowJo-Symbol und ziehen Sie die Dateien für jede Röhre in das Fenster für alle Proben.

Klicken Sie auf das Polygon und erstellen Sie die Gating-Strategien neu, die im vorherigen Abschnitt verwendet wurden. Klicken Sie anschließend auf Layout-Editor, und ziehen Sie die interessierenden B-Lymphozytenpopulationen aus Röhrchen sechs und dem Reinheitssteuerelement auf die Registerkarte des Layout-Editors. Es werden Punktdiagramme angezeigt, die B-Lymphozyten darstellen. In diesem Beispiel stellt das Diagramm oben rechts die sortierten B-Lymphozyten aus der gesamten Milzzellsuspension dar, und das Diagramm unten rechts stellt die Reinheitskontrolle dar. Zellen sollten nur in der Population vorkommen, die für die Reinheitskontrolle von Interesse ist.

Um die Reinheit der B-Lymphozyten in den sortierten Zellen zu überprüfen, klicken Sie auf den Tabelleneditor. Ziehen Sie die B-Lymphozytenpopulation aus Röhrchen sechs und der Reinheitskontrolle in die Tabelle. Wählen Sie im Statistikmenü die Häufigkeit von CD45-positiven Zellen aus, um die Reinheit dieser Zellpopulation zu testen. Klicken Sie dann auf Tabelle erstellen. Parameterwerte werden in einer neuen Tabelle angezeigt. Überprüfen Sie im Fenster zur Reinheitskontrolle die Häufigkeit von B-Lymphozyten in den CD45-positiven Zellen, die höher als 98 % sein sollte.