Durchflusszytometrie und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS): Isolierung von B-Lymphozyten

1. Vorbereitung

1. Vor Beginn Laborhandschuhe und die entsprechende Schutzkleidung anziehen.
2. Sterilisieren Sie alle Sezierwerkzeuge, zuerst mit einem Waschmittel und dann mit 70% Ethanol und dann gründlich trocknen.
3. Bereiten Sie 50 ml von Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) vor, die 2% fetales Kalbsserum (FCS) enthält.

2. Dissektion

1. Mit einem Kohlendioxid-Zufuhrsystem, euthanisieren Sie die Maus durch Hypoxie. Sichern Sie die eingeschläferte Maus auf einer Sezierplatte in der Supine-Position und führen Sie eine Längs-Laparotomie mit Schere und Zange durch.
2. Mit Zange, bewegen Sie den Darm und Magen auf der rechten Seite des Bauches, um den Magen und Milz auszusetzen. Die Milz ist am Magen befestigt.
3. Mit Zangen, lösen Sie die Milz vorsichtig aus dem Magen und legen Sie sie in die Petrischale mit 5ml HBSS 2% FCS.

3. Immunzellisolierung

1. Legen Sie die Milz in ein 40-m-Zellsieb über die gleiche Petrischale. Crush die Milz mit einem Kolben, um es in der gleichen Schale zu dissoziieren.
2. Übertragen Sie die dissoziierte Milz und die Flüssigkeit in ein 15mL Zentrifugenrohr.
3. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 x g für 7 min bei 10°C und entsorgen Sie den Überstand, um das Pellet zu vermeiden.
4. Das Pellet in 2 ml Kaliumacetat wieder aufsetzen, um die Erythrozyten zu lysieren. Warten Sie 2 min und machen Sie dann das Volumen bis zu 15 ml mit HBSS 2% FCS.
5. Zentrifugieren Sie das Rohr wieder bei 370 x g für 7 min bei 10°C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 5ml von HBSS 2% FCS wieder aus.
6. Zählen Sie die Zellen mit einem Trypan-Blau-Färbe-Assay und passen Sie die endgültige Zellkonzentration auf 10⁷ Zellen/ml mit einem entsprechenden Volumen von HBSS 2% FCS an.

4. Zellfärbung

1. Übertragen Sie 200 l der Zellsuspension in sechs FACS-Röhren, die mit 1 bis 6 gekennzeichnet sind.
2. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 370 x g für 7 min bei 10°C und entsorgen Sie den Überstand, um das Pellet zu vermeiden.
3. Als nächstes bereiten Sie sechs neuartige Antikörpermischungen vor, indem Sie gemäß Tabelle 1 eine angemessene Menge an Antikörpern zu 200 l HBSS 2% FCS hinzufügen.
4. Übertragen Sie diese Antikörpermischungen dann in die entsprechenden nummerierten FACS-Rohre.
5. Inkubieren Sie die Zellsuspensionen mit den Antikörpern für 20 Minuten auf Eis im Dunkeln gemischt.
6. Fügen Sie 1 ml HBSS 2% FCS zu jedem Rohr hinzu und zentrieren Sie dann wieder bei 370 x g für 3 min bei 10°C.
7. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 200 l HBSS 2% FCS wieder aus.
8. Übertragen Sie die resuspendierten Pellets in neue FACS-Rohre.

Tabelle 1: Antikörper mischen Zusammensetzung. Für das Experiment wurden sechs Mischungen von 200 l HBSS + Antikörper n. Chr. vorbereitet. Mix 1 ist für PMT-Einstellung, Mischungen 2 bis 5 sind für Kompensationseinstellungen und Mix 6 für die Zellensortierung.

5. FACS Kalibrierung

1. Schalten Sie zunächst den Sortierer ein und führen Sie"Fluidics Startup"durch.
2. Schalten Sie den Stream ein und warten Sie dann 15 min, bis sich der Stream stabilisiert.
3. Passen Sie die Amplitude des Stroms an, um eine abgetrennte Tropfenbildung zu erhalten. Klicken Sie dann auf den "Sweet Spot", um die Amplitudenanpassung abzuschließen.
4. Setzen Sie den Neutraldichtefilter (N.D.) Filter - 1.0 ein und öffnen Sie die "CST" Schnittstelle, die für Zytometer-Setup und -Tracking steht.
5. Um die tägliche Qualitätskontrolle durchzuführen, verdünnen Sie zuerst die CST-Perlen mit FACS-Medium nach den Anweisungen des Herstellers und führen Sie dann die CST-Kontrolle durch.
6. Sobald die CST-Steuerung abgeschlossen ist, ersetzen Sie den N.D. 1.0-Filter durch den N.D. 2.0-Filter am Zytometer.
7. Anschließend werden Tropfenverzögerungsperlen in FACS-Medium nach den Anweisungen des Herstellers verdünnt und dann in das FACS geladen.
8. Um sicherzustellen, dass eine ordnungsgemäße Sortierung Drop Delay-
   1. Klicken Sie zuerst auf "Spannung" und dann auf "Optischer Filter". Der rechte Quadrant sollte 100 % betragen. Stellen Sie bei Bedarf die rote Laserschraube am Zytometer links oder rechts ein, um 100% im rechten Quadranten zu erhalten.
   2. Führen Sie als Nächstes eine Testsortierung durch, um sicherzustellen, dass der Stream in das Auflistungsrohr fällt. Klicken Sie dazu auf "Waste Drawer" und starten Sie "TestSort". Überprüfen Sie, ob Seitenströme in Sammelrohre fallen. Wenn dies nicht der Fall ist, stellen Sie die Spannung ein, bis sie dies tun.
   3. Navigieren Sie zur experimentellen Vorlage. Öffnen Sie dann das "Accudrop Drop Delay" Experiment und klicken Sie auf das "Sortierlayout".
   4. Ändern Sie den Durchfluss, um 1000 bis 3000 Ereignisse pro Sekunde zu erhalten.
   5. Klicken Sie auf "Spannung" und dann auf "Optischer Filter". Der linke Quadrant sollte gleich 0 und der rechte Quadrant 100 sein.
   6. Klicken Sie im Fenster "Layoutsortieren " auf "Sortieren" und dann auf "Abbrechen". Der linke Quadrant sollte gleich 100 und der rechte Quadrant 0 sein. Wenn der linke Quadrant kleiner als 95 ist, klicken Sie auf"Auto Delay", um ihn automatisch anzupassen.

6. Durchflusszytometrie und Reinheitskontrolle

1. Beginnen Sie die Durchflusszytometrie, indem Sie mit der Röhre 1 (ungefärbte Zellen) beginnen, um die Zellmorphologie und die negativen Spitzen der Fluorchrome zu definieren. Richten Sie die Vorwärts- und Seitenstreuung ein und definieren Sie die Spannungen der einzelnen Fluoreszenzparameter. Platzieren Sie die negative Population in den ersten zehn Jahren, indem Sie die Raster auf jedem Punktdiagramm verwenden.
2. Als nächstes lasten Sie Rohr 2 (einfarbige Farbregelung) im Zytometer. Passen Sie die Spektralüberlappung an, bis die negativen und positiven Mediane der Grundgesamtheit ausgerichtet sind, oder verwenden Sie die automatische Berechnungssoftware. Es ist wichtig, das Signal auf der Skala zu halten. Kompensationskontrollen müssen den Einstellungen für experimentelle Fluorchrome und Detektoren entsprechen. Rekord 10.000 Events.
3. Wiederholen Sie diese Schritte mit Tube 3, 4 und 5 (andere Einzelfarbensteuerungen).
4. Als Nächstes laden Sie Tube 6 (mehrbefleckte Zellen) und definieren Sie Zellpopulationen von Interesse, indem Sie eine spezifische Gating-Strategie verwenden.
5. Wählen Sie im Fenster Layout sortieren die von Interesse bestochene Zellenpopulation aus. Wählen Sie den Zellenschwellenwert in den "Zielereignissen" und die Genauigkeitsstufe in der "Genauigkeit" aus. Hier wird nur eine Population sortiert, aber vier verschiedene Populationen können gleichzeitig sortiert werden.
6. Sobald Sie bereit sind, klicken Sie auf "Sortieren" und "OK", dann warten Sie auf die Zellensortierung.
7. Sobald die Zellsortierung abgeschlossen ist, führen Sie eine Reinheitskontrolle durch, indem Sie zuerst 10 l sortierte Zellen in ein neues FACS-Rohr mit 90 MikroliterHBSS 2% FCS pipetieren.
8. Dann laden Sie das Rohr das Zytometer. Zeichnen und analysieren Sie die Phänotypen der Zellen, um zu überprüfen, ob die Gating-Strategie wie beabsichtigt funktioniert hat.

7. Datenanalyse

1. Öffnen Sie die 'FlowJo' Software und ziehen Sie die Dateien für jede Röhre im Fenster"Alle Beispiele".
2. Doppelklicken Sie auf eine Datei, um sie in einem neuen Fenster zu öffnen.
3. Klicken Sie auf das "Polygon" und erstellen Sie die zuvor verwendete Gating-Strategie neu.
4. Wiederholen Sie die Schritte mit allen anderen Dateien.
5. Um die Punktdiagramme zu visualisieren, klicken Sie auf "Layout-Editor" und ziehen Sie die Vonstächen-Populationen aus Tube 6 und reinheitskontrolle in der Layout-Editor-Registerkarte. Zellen sollten nur in der Bevölkerung von Interesse an Reinheitskontrolle erscheinen (siehe Abbildung 2).
6. Um die Reinheit der B-Lymphozyten in den sortierten Zellen zu überprüfen, klicken Sie auf "Tabelleneditor". Ziehen Sie B-Lymphozytenpopulation aus Tube 6 und Reinheitskontrolle in der Tabelle.
7. Wählen Sie im Menü "Statistik" die Frequenz von CD45⁺ Zellen aus, um die Reinheit dieser Zellpopulation zu testen, und klicken Sie dann auf "Tabelle erstellen".
8. Parameterwerte werden in einer neuen Tabelle angezeigt. Überprüfen Sie im Reinheitskontrollfenster die Häufigkeit von B-Lymphozyten innerhalb der CD45⁺ Zellen, die höher als 98 % sein sollten (siehe Abbildung 2, untere Platte).