Magnetaktivierte Zellsortierung (MACS): Isolierung von T-Lymphozyten

1. Vorbereitung

1. Vor Beginn Laborhandschuhe und entsprechende Schutzkleidung anziehen.
2. Waschen Sie alle Sezierwerkzeuge, zuerst mit einem Waschmittel und dann mit 70% Ethanol und trocknen Sie sie dann mit einem sauberen Papiertuch.
3. Bereiten Sie 200 ml von Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) vor, die 2% fetales Kalbsserum (FCS) enthält.

2. Dissektion

1. Pin eine eingeschläferte Maus auf eine Sezierplatte in der Supine-Position.
2. Mit Schere und Zange führen Sie eine Längs-Laparotomie durch, um auf die Brusthöhle zuzugreifen.
3. Entfernen Sie das Herz, um Zugang zum Thymus zu erhalten, der sich über dem Herzen befindet. Identifizieren Sie dann den Thymus, der aus zwei weißen Lappen besteht und sich in der Brusthöhle über dem Herzen befindet.
4. Mit Zangen den Thymus vorsichtig lösen und auf die Petrischale mit 5 ml HBSS 2% FCS legen.

3. Immunzellisolierung

1. Legen Sie den Thymus auf ein 40-m-Zellsieb über die gleiche Petrischale. Crush den Thymus mit einem Kolben, um es in der gleichen Schale zu dissoziieren.
2. Den dissoziierten Thymus und die Flüssigkeit in ein 15 ml Zentrifugenrohr übertragen.
3. Die Petrischale mit 5 ml HBSS 2% FCS waschen und das gewaschene Medium auch in das gleiche Zentrifugenrohr übertragen.
4. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 x g für 7 min bei 20°C und entsorgen Sie den Überstand, um das Pellet zu vermeiden.
5. Das Pellet in 2 ml Kaliumacetat wieder aufsetzen, um die Erythrozyten zu lysieren. Warten Sie 2 min und machen Sie dann das Volumen bis zu 14 ml mit HBSS 2% FCS.
6. Zentrifugieren Sie das Rohr wieder bei 370 x g für 7 min bei 20°C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 5 ml HBSS 2% FCS wieder aus.
7. Schätzen Sie die Zellkonzentration mit dem Trypan-Blau-Färbe-Assay und passen Sie die endgültige Zellkonzentration auf 10⁷ Zellen/ml mit einem entsprechenden Volumen von HBSS 2% FCS an.

4. Magnetische Kennzeichnung von Immunzellen

1. Nehmen Sie zwei FACS-Rohre. Beschriften Sie eine Röhre, "nicht angereicherte T-Zellen", und die andere Röhre, "angereicherte T-Zellen" - die durch magnetische Beschriftung getrennt werden.
2. Verteilen Sie die Zelllösung in jede der beiden FACS-Röhren.
3. Zentrifugieren Sie das "angereicherte T-Zellen"-Rohr bei 370 x g für 3 min bei 20°C und entsorgen Sie den Überstand, der das Pellet vermeidet.
4. Setzen Sie das Pellet in 250 l biotinylierten Antikörpern gegen CD3 aus (Tabelle 1, Mix 1).

mischen	Etikettierungsreagenzien	verdünnung
1	Anti-CD3 biotinylierter Antikörper	1/400 (in HBSS 2% FCS)
2	Streptavidin gekoppelte Perlen	1/5 (in HBSS 2% FCS)
3	Anti-CD3 BV421	1/200 (in HBSS 2% FCS)

Tabelle 1: Antikörper mischen Zusammensetzung. Für die magnetische Trennung werden die Mischungen 1 und 2 verwendet. Mix 3 wird zur Bewertung der Zellanreicherung nach magnetischer Trennung verwendet.

5. Die Zellsuspensions-Antikörper-Mischung 15 Minuten bei 4°C im Dunkeln inkubieren.
6. Fügen Sie 3 ml HBSS 2% FCS in die Rohre und zentrifugieren Sie sie wieder bei 370 x g für 3 min bei 20°C.
7. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 250 L Streptavidin-gekoppelten Perlen wieder auf (Tabelle 1, Mix 2).
8. Die Zellmischung und perlen 20 min auf Eis bebrüten.
9. Als nächstes fügen Sie 3 ml HBSS 2% FCS hinzu und mischen Sie gut und Zentrifuge wieder bei 370 x g für 3 min bei 20°C.
10. Setzen Sie das Pellet in 2 ml HBSS 2% FCS aus.

5. Magnetische Trennung von CD3-positiven Zellen

1. Legen Sie die Säule auf den Magneten und fügen Sie 3 ml HBSS 2% FCS hinzu, um das System zu befeuchten. Warten Sie 5 Minuten.
2. Pipetten Sie anschließend die beschrifteten Zellen in die Spalte.
3. Nachdem die Zellsuspension durch die Säule geht, waschen Sie die Säule X3 mal mit 3 ml HBSS 2% FCS.
4. Entfernen Sie dann die Säule vom Magneten und legen Sie sie in ein 15 ml Sammelrohr.
5. Um die Zielzellen zu löschen, fügen Sie der Spalte 5 ml HBSS 2% FCS hinzu und spülen Sie die Spalte mit dem Kolben.
6. Wiederholen Sie den Elutionsschritt mit einem weiteren 5 ml HBSS 2% FCS.

6. Bewertung der Target-Cell-Anreicherung durch Durchflusszytometrie

1. Übertragen Sie 500 l eluierte Zellsuspension in ein FACS-Rohr mit der Bezeichnung "angereicherte T-Zellen". Übertragen Sie 200 L der Suspension "nicht angereicherter T-Zellen" auf eine zweite FACS.
2. Dann zentrifugieren beide Rohre bei 370 x g für 7 min bei 20°C.
3. Entsorgen Sie den Überstand, und fügen Sie beiden Röhren 100 l fluoreszierenden Antikörper Mix 3 (siehe Tabelle 1) hinzu.
4. Inkubieren Sie beide Rohre für 20 min bei 4°C im Dunkeln.
5. Als nächstes fügen Sie 3 ml HBSS 2% FCS zu den Röhren hinzu und zentrifugieren Sie sie bei 370 x g für 3 min bei 20°C.
6. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie dann jedes Rohr in 250 l HBSS 2% FCS wieder aus.
7. Bewerten Sie nun die CD3-positive Zellanreicherungsrate durch Durchflusszytometrie.

7. Datenanalyse

1. Öffnen Sie das "FlowJo"-Symbol und ziehen Sie die Dateien für jede Röhre im Fenster"Alle Beispiele".
2. Doppelklicken Sie auf die Datei "angereicherte T-Zellen", um das Punktdiagramm anzuzeigen, das die Vorwärtsstreuung (FSC-A) auf der X-Achse und die Seitenstreuung (SSC-A) auf der Y-Achse anzeigt.
3. Klicken Sie auf "Polygon", um die Lymphozytenpopulationen zu umkreisen.
4. Doppelklicken Sie anschließend auf die eingekreiste Grundgesamtheit, um ein neues Fenster zu erstellen.
5. Wählen Sie "FSC-W" auf der Y-Achse und "FSC-A" auf der X-Achse und kreisen Sie die FSA-W-Negativzellen. Benennen Sie im Fenster "Subpopulation identification" die Zellpopulation als "einzelzellen".
6. Doppelklicken Sie auf die eingekreiste Bevölkerung, um ein neues Fenster zu erstellen. Wählen Sie "CD3" auf der Y-Achse aus, und kreisen Sie die CD3-positiven Zellen. Benennen Sie im Fenster "Subpopulation identification" Ihre Zellenpopulation "T-Zellen".
7. Wiederholen Sie dies mit den "nicht angereicherten T-Zellen".
8. Um die Zellpopulation zu visualisieren, klicken Sie auf"Layout-Editor" und ziehen Sie die "T-Zellen"-Populationaus "angereicherten T-Zellen" und "nicht angereicherten T-Zellen"-Dateien in die Registerkarte.
9. Punktdiagramme, die CD3+ Lymphozyten darstellen, werden angezeigt. CD3+-Zellen sollten nur in der Population von Interesse in der CD3+ angereicherten Röhre erscheinen.
10. Um die Anreicherung von CD3+-Lymphozyten in den sortierten Zellen auszuwerten, klicken Sie auf"Tabelleneditor", und ziehen Sie dann die "T-Zellen"-Population aus den Dateien "angereicherte T-Zellen" und "nicht angereicherte T-Zellen" in die Tabelle.
11. Wählen Sie im Menü "Statistik" zellen "Häufigkeit von Lymphozyten" aus, um den Prozentsatz der CD3+-Zellen in allen Lymphozyten zu überprüfen, und klicken Sie dann auf " Tabelleerstellen".
12. Parameterwerte werden in einer neuen Tabelle angezeigt. Bei den "angereicherten T-Zellen" sollte die Frequenz der CD3+-Zellen bei etwa 80 % liegen.