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Quelle: Meunier Sylvain1,2,3, Perchet Thibaut1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Einheit für Lymphopoiese, Institut für Immunologie, Pasteur Institute, Paris, Frankreich
2 INSERM U1223, Paris, Frankreich
3 Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, Frankreich
4 Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, Frankreich
Die Abwehr von Krankheitserregern hängt von der Überwachung durch das Immunsystem ab. Dieses System ist komplex und umfasst viele Zelltypen, von denen jeder spezifische Funktionen hat. Diese komplexe Zusammensetzung ermöglicht Immunreaktionen auf eine große Vielfalt von Krankheitserregern und Verletzungen. Die adaptive Immunität ermöglicht spezifische Reaktionen gegen bestimmte Krankheitserreger. Die Mehrheit der Zellen, die für diese Art der Immunität verantwortlich sind, sind die Lymphozyten (B-Zellen und T-Zellen). In der Regel reagieren B-Zellen auf extrazelluläre Infektionen (z. B. bakterielle Infektionen) und T-Zellen auf intrazelluläre Infektionen (z. B. Virusinfektionen). Die verschiedenen Zelltypen in Lymphozytenpopulationen können durch die Kombination von Zelloberflächenproteinen, die sie exprimieren, und/oder durch eine Gruppe von abgesonderten Zytokinen charakterisiert werden.
Die magnetische Sortierung ermöglicht die Anreicherung von Zielzellpopulationen unter Verwendung magnetischer Eigenschaften und expressionierung eines oder mehrerer Zelloberflächenproteine (1, 2). Diese Technik besteht aus drei Schritten. Zunächst werden die Zellen mit magnetischen Perlen inkubiert, die mit einem oder mehreren monoklonalen Antikörpern gekoppelt sind. Zellen, die Oberflächenproteine ausdrücken, die an diese Antikörper binden, heften sich an die magnetischen Perlen. Dann werden die Zielzellpopulationen mit einem Magneten erfasst. Zum Abschluss werden die Zielzellen vom Magneten eluiert. Am Ende werden zwei Sortierprodukte erhalten, eines mit nicht beschrifteten Zellen und das zweite mit den Zielzellen gekoppelt mit den Magnetperlen. Säulen können verwendet werden, um die Effizienz der magnetischen Sortierung zu verbessern. In der Spalte verlängert ein nichtmagnetisches Element den Pfad der Zelle durch die Spalte. Daher wird der Zellfluss verlangsamt, was die Zellerfassung durch den Magneten erleichtert.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der magnetischen Trennung. Thymische Leukozyten sind mit Anti-CD3-biotinylierten Antikörpern gefärbt. Nach dem Waschen fixieren Streptavidin (SAV) gekoppelte Perlen das Biotin gezielt auf Anti-CD3-Antikörper. (1) Zellen werden in eine Spalte übertragen. (2) Der Magnet behält keine unbeschrifteten Zellen, während CD3-positive Zellen in der Spalte verbleiben. Schließlich wird die Säule vom Magneten getrennt und (3) CD3-positive Zellen werden im Medium eluiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Es gibt zwei Arten der magnetischen Sortierung (3). Bei der positiven Sortierung werden Von interessede Zellen mit den Magnetperlen erfasst. Bei der negativen Sortierung werden unerwünschte Zellen entfernt, indem sie mit den magnetischen Perlen, die die entsprechenden Antikörper tragen, aufgenommen werden. Diese MACS-Technik ermöglicht eine gute Anreicherung von Zielzellen und verbessert den Anteil der zurückgewonnenen Zellen von 1-20% auf 60-98% in einem Organ. Nach der Sortierung ist es notwendig, die Zellreinheit und die Sortierung nach verschiedenen Methoden (z.B. Durchflusszytometrie) zu überprüfen. Die MACS-Technik ist ideal, um eine Zielpopulation für andere Experimente wie Zellkultur oder Zellzyklusanalyse zu bereichern.
In dieser Übungseinheit zeigen wir, wie thymische Leukozyten isoliert und anschließend thymische CD3-positive Zellen aus dem Mix mit der magnetischen Zellsortierungstechnik angereichert werden können.
1. Vorbereitung
2. Dissektion
3. Immunzellisolierung
4. Magnetische Kennzeichnung von Immunzellen
| mischen | Etikettierungsreagenzien | verdünnung |
| 1 | Anti-CD3 biotinylierter Antikörper | 1/400 (in HBSS 2% FCS) |
| 2 | Streptavidin gekoppelte Perlen | 1/5 (in HBSS 2% FCS) |
| 3 | Anti-CD3 BV421 | 1/200 (in HBSS 2% FCS) |
Tabelle 1: Antikörper mischen Zusammensetzung. Für die magnetische Trennung werden die Mischungen 1 und 2 verwendet. Mix 3 wird zur Bewertung der Zellanreicherung nach magnetischer Trennung verwendet.
5. Magnetische Trennung von CD3-positiven Zellen
6. Bewertung der Target-Cell-Anreicherung durch Durchflusszytometrie
7. Datenanalyse
Die magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) ist eine Technik, die es Forschern ermöglicht, Zellen auf der Grundlage spezifischer Epitope, die auf ihren Oberflächen exprimiert werden, zu trennen.
Der Prozess beginnt in der Regel mit der Extraktion eines Organs oder Gewebes, wie dem Thymus. Dann werden die Zellen mechanisch getrennt, in der Regel durch Zerkleinern, bis das Gewebe in einzelne Zellen zerlegt wird. Unerwünschte Zellen können in diesem Stadium durch Zugabe von Chemikalien entfernt werden. Zum Beispiel kann Ammoniumchlorid-Kalium oder ACK-Puffer verwendet werden, um unerwünschte Erythrozyten zu lysieren.
Als nächstes wird der Suspension ein Antikörper hinzugefügt, der mit einem Molekül namens Biotin konjugiert wird, und diese Komplexe binden an die Epitope der Oberfläche der Zielzellen. Biotin hat eine hohe Affinität zu einem anderen Molekül namens Streptavidin. Im nächsten Schritt werden den Antikörper-markierten Zellen Streptavidin-Moleküle zu magnetischen Perlen hinzugefügt. Wenn Biotin und Streptavidin in Kontakt kommen, binden sie fest. Das Ergebnis ist, dass die Interessenszellen mit magnetischen Perlen beschichtet sind. Dieser Komplex wird manchmal als Sandwich bezeichnet. In diesem Fall, CD3 auf der Zellmembran auf der Unterseite, dann Anti-CD3 konjugiert zu Biotin, und schließlich, Streptavidin konjugiert zu magnetischen Perlen.
Diese beschrifteten Zellen können nun in eine Spalte mit einer Matrix platziert werden, die, unterstützt durch die Schwerkraft, die Zellen langsam durch einen Magneten passieren lässt. Dabei kleben die magnetischen, mit Perlen beschrifteten Zellen am Rand des Rohres, das dem Magnet am nächsten liegt, während die nicht beschrifteten Zellen in einem Sammelrohr weitergeführt werden. Als nächstes können die beschrifteten Zellen aus der Säule entfernt werden, indem sie einfach den Magneten entfernen, eine Eluentenlösung hinzufügen und sanften Druck mit einem Kolben anwenden, um sie aus der Säule in ein frisches Sammelrohr zu spülen. Letztlich ermöglicht dieser Prozess 60 bis 98% Abruf der Zellen von Interesse.
In diesem Verfahren werden wir thymische Leukozyten von einer Maus isolieren und MACS verwenden, um CD3-positive T-Zellen zu sortieren, bevor wir die Effizienz der Sortierung mit FACS bestätigen.
Zunächst sollten Sie alle geeigneten Schutzausrüstungen einschließlich Labormantel und Handschuhe anziehen. Als nächstes waschen Sie eine Schere und Zange mit 70% Ethanol und trocknen Sie sie mit einem sauberen Papiertuch. Dann bereiten 200 Milliliter HBSS 2% fetale Kalbsserum, oder FCS, durch Mischen von vier Milliliter FCS mit 196 Milliliter HBSS.
Pin eine eingeschläferte Maus in einer Supine-Position auf einer Sezierplatte. Führen Sie mit Schere und Zange eine Längs-Laparotomie durch, um auf die Brusthöhle zuzugreifen. Entfernen Sie zuerst das Herz, um Zugang zum Thymus zu erhalten, der sich über dem Herzen befindet. Identifizieren Sie dann den Thymus, der aus zwei weißen Lappen besteht. Mit Zangen, lösen Sie den Thymus vorsichtig und legen Sie ihn auf eine Petrischale mit fünf MilliliterHBS2% FCS.
Um die Immunzellen zu isolieren, legen Sie den Thymus zunächst auf ein 40 Mikrometer Zellsieb in der Petrischale. Zerkleinern Sie das Gewebe mit einem Kolben, um es in die Schale zu dissoziieren. Danach spülen Sie den Kolben und das Sieb mit HBSS 2% FCS, um alle haftenden Zellen wiederherzustellen. Dann pipette die dissoziierten Thymuszellen und Flüssigkeit aus der Petrischale in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr. Waschen Sie die Petrischale mit fünf Millilitern HBSS 2% FCS und übertragen Sie diese Waschlösung auch auf das 15 Milliliter Zentrifugenrohr.
Als nächstes zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 mal g für sieben Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in zwei MilliliterACK-Lysingpuffer wieder auf, um die Erythrozyten zu lyse. Zwei Minuten bei Raumtemperatur auf der Bankplatte inkubieren. Dann bringen Sie das Volumen auf 14 Milliliter mit HBSS 2% FCS. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 mal g für sieben Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie dann den Überstand und setzen Sie die Zellen in fünf Millilitern HBSS 2% FCS wieder aus.
Schätzen Sie die Zellkonzentration anhand eines Malassez-Dias, wie im Protokoll zur FACS-Isolierung von B-Lymphozyten gezeigt, und passen Sie die Zellkonzentration auf 10 auf die siebten Zellen pro Milliliter mit HBSS 2% FCS an.
Übertragen Sie 500 Mikroliter Zelllösung in zwei FACS-Röhren. Beschriften Sie eine Röhre nicht angereicherte T-Zellen und die anderen röhrenangereicherten T-Zellen, die durch magnetische Beschriftung getrennt werden.
Zentrifugieren Sie das angereicherte T-Zellen-Rohr bei 370 mal g für drei Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 250 Mikroliter Biotin gekoppelten Anti-CD3-Antikörper verdünnt ein s.in 400 in HBSS 2% FCS. Inkubieren Sie die Zellen für 20 Minuten auf Eis und im Dunkeln. Fügen Sie drei Milliliter HBSS 2% FCS in die Rohre und zentrifugieren Sie sie wieder bei 370 mal g für drei Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 250 MikroliterStreptavidin-gekoppelten Perlen in HBSS 2% FCS verdünnt. Die Mischung aus Zellen und Perlen 20 Minuten lang auf Eis bebrüten. Als nächstes fügen Sie drei Milliliter HBSS 2% FCS in das Rohr, Pipette nach oben und unten zu mischen, und Zentrifuge wieder bei 370 mal g für drei Minuten bei 20 Grad Celsius. Setzen Sie das Pellet in zwei Milliliter HBSS 2% FCS aus.
Legen Sie die Säule auf den Magneten und fügen Sie drei Milliliter HBSS 2% FCS hinzu, um das System zu befeuchten. Dann pipette die gefärbten Zellen in die Spalte. Nachdem die Zellsuspension durch die Säule geht, waschen Sie die Säule dreimal mit drei Millilitern HBSS 2% FCS. Entfernen Sie als Nächstes die Säule vom Magneten und legen Sie sie in ein 15-Milliliter-Rohr. Um die Zielzellen zu löschen, fügen Sie der Spalte fünf Milliliter HBSS 2% FCS hinzu und spülen Sie die Spalte mit einem Kolben. Wiederholen Sie diesen Schritt mit weiteren fünf Millilitern HBSS 2% FCS.
Um die Wirksamkeit der Zielzellisolierung zu bewerten, übertragen Sie zunächst 500 Mikroliter eluierte Zellsuspension in ein FACS-Rohr und beschriften Sie sie angereicherte T-Zellen. Dann zentrifugieren Sie sowohl die angereicherten als auch die nicht angereicherten Rohre bei 370 mal g für sieben Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand, und fügen Sie dann 100 Mikroliter fluoreszierender Antikörper, der in 200 in HBSS 2% FCS verdünnt wird, in beide Röhren. Inkubieren Sie die Zellen für 20 Minuten auf Eis und im Dunkeln. Als nächstes fügen Sie drei Milliliter HBSS 2% FCS in die Rohre und zentrifugieren Sie sie bei 370 mal g für drei Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Pellets in 250 Mikroliter HBSS 2% FCS wieder aus. Bewerten Sie nun die CD3-positive Zellanreicherungsrate mithilfe der Durchflusszytometrie, wie im FACS-Protokoll gezeigt.
Nun werden wir die Häufigkeit von CD3-positiven Lymphozyten unter allen Thymosyten bestimmen, die vom Mausthymus isoliert wurden. Um zu starten, doppelklicken Sie auf das FlowJo-Symbol und ziehen Sie die Dateien für jede Röhre im gesamten Beispielfenster. Doppelklicken Sie dann auf die angereicherte T-Zellen-Datei, um die zellen, die von dieser Probe aufgezeichnet wurden, auf einem Punktdiagramm anzuzeigen, das Vorwärtsstreuung, FSCA auf der x-Achse und Seitenstreuung, SSCA, auf der y-Achse anzeigt.
Klicken Sie auf Polygon, um die Lymphozytenpopulationen zu umkreisen. Doppelklicken Sie anschließend auf die eingekreiste Grundgesamtheit, um ein neues Fenster zu erstellen. Wählen Sie FSC-W auf der y-Achse und FSC-A auf der x-Achse und kreisen Sie die FSA-W-Negativzellen. Benennen Sie im Identifikationsfenster für die Untergrundgesamtheit die Zellenpopulation Als Einzelzellen. Klicken Sie als Nächstes im Identifikationsfenster der Untergrundbevölkerung auf OK und doppelklicken Sie dann auf die eingekreiste Grundgesamtheit, um ein neues Fenster zu erstellen. Wählen Sie CD3 auf der y-Achse aus, und kreisen Sie die CD3-positiven Zellen. Benennen Sie im Identifikationsfenster für die Untergrundgesamtheit Die T-Zellen Der Zellenderpopulation. Wiederholen Sie dies mit der nicht angereicherten T-Zellen-Datei. Um die Zellenpopulation zu visualisieren, klicken Sie auf Layout-Editor, und ziehen Sie die T-Zellen-Population aus angereicherten T-Zellen und nicht angereicherten T-Zellen-Dateien auf die Registerkarte.
Punktdiagramme, die CD3-positive Lymphozyten darstellen, werden angezeigt. CD3-positive Zellen sollten nur in der Population von Interesse in der CD3-positiven angereicherten Röhre erscheinen. Um die Anreicherung von CD3-positiven Lymphozyten in den sortierten Zellen auszuwerten, klicken Sie auf den Tabelleneditor, und ziehen Sie dann die T-Zellen-Population aus angereicherten T-Zellen und nicht angereicherten T-Zellen-Dateien in die Tabelle. Wählen Sie im Statistikmenü Frequenz der Lymphozytenzellen aus, um den Prozentsatz der CD3-positiven Zellen in allen Lymphozyten zu überprüfen. Klicken Sie dann auf Tabelle erstellen. Parameterwerte werden in einer neuen Tabelle angezeigt. Bei den angereicherten T-Zellen sollte die Frequenz von CD3-positiven Zellen bei etwa 80% oder höher liegen.
Die magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) ist eine Technik, die es Forschern ermöglicht, Zellen anhand spezifischer Epitope zu trennen, die auf ihren Oberflächen exprimiert werden.
Der Prozess beginnt in der Regel mit der Entnahme eines Organs oder Gewebes, wie z. B. des Thymus. Dann werden die Zellen mechanisch getrennt, in der Regel durch Zerkleinern, bis das Gewebe in einzelne Zellen zerlegt ist. Unerwünschte Zellen können in diesem Stadium durch Zugabe von Chemikalien entfernt werden. Zum Beispiel kann Ammoniumchlorid-Kalium oder ACK-Puffer verwendet werden, um unerwünschte Erythrozyten zu lysieren.
Als nächstes wird ein Antikörper, der an ein Molekül namens Biotin konjugiert ist, zu der Suspension hinzugefügt, und diese Komplexe binden an die Epitope der Oberfläche der Zielzellen. Biotin hat eine hohe Affinität zu einem anderen Molekül namens Streptavidin. Im nächsten Schritt werden Streptavidin-Moleküle, die mit magnetischen Kügelchen fusioniert sind, zu den Antikörper-markierten Zellen hinzugefügt. Wenn das Biotin und Streptavidin in Kontakt kommen, binden sie sich fest. Das Ergebnis ist, dass die interessierenden Zellen mit magnetischen Kügelchen beschichtet werden. Dieser Komplex wird manchmal auch als Sandwich bezeichnet. In diesem Fall CD3 auf der Zellmembran am Boden, dann Anti-CD3, konjugiert mit Biotin und schließlich Streptavidin, konjugiert mit magnetischen Kügelchen.
Diese markierten Zellen können nun in eine Säule mit einer Matrix gelegt werden, die es den Zellen mit Hilfe der Schwerkraft ermöglicht, langsam an einem Magneten vorbeizugehen. Dabei kleben die magnetischen Kügelchen-markierten Zellen an dem Rand des Röhrchens, das dem Magneten am nächsten liegt, während die unmarkierten Zellen in ein darunter liegendes Sammelröhrchen gelangen. Als nächstes können die markierten Zellen aus der Säule entfernt werden, indem einfach der Magnet entfernt, eine Eluentenlösung hinzugefügt und mit einem Kolben sanfter Druck ausgeübt wird, um sie aus der Säule in ein frisches Sammelröhrchen zu spülen. Letztendlich ermöglicht dieser Prozess eine Rückgewinnung von 60 bis 98 % der interessierenden Zellen.
In diesem Verfahren werden wir Thymus-Leukozyten aus einer Maus isolieren und mit MACS CD3-positive T-Zellen aussortieren, bevor wir die Effizienz der Sortierung mit FACS bestätigen.
Ziehen Sie zunächst eine geeignete Schutzausrüstung an, z. B. einen Laborkittel und Handschuhe. Waschen Sie anschließend eine Präparierschere und eine Pinzette mit 70 % Ethanol und trocknen Sie sie mit einem sauberen Papiertuch ab. Bereiten Sie dann 200 Milliliter HBSS 2% fötales Kälberserum oder FCS vor, indem Sie vier Milliliter FCS mit 196 Millilitern HBSS mischen.
Stecken Sie eine euthanasierte Maus in Rückenlage auf eine Sezierplatte. Führen Sie mit Schere und Pinzette eine Längslaparotomie durch, um Zugang zur Brusthöhle zu erhalten. Entfernen Sie zunächst das Herz, um Zugang zum Thymus zu erhalten, der sich über dem Herzen befindet. Identifizieren Sie dann den Thymus, der aus zwei weißen Lappen besteht. Lösen Sie den Thymus vorsichtig mit einer Pinzette ab und legen Sie ihn mit fünf Millilitern HBSS 2% FCS auf eine Petrischale.
Um die Immunzellen zu isolieren, legen Sie den Thymus zunächst auf ein 40 Mikrometer großes Zellsieb in die Petrischale. Zerdrücken Sie das Gewebe mit einem Kolben, um es in die Schale zu dissoziieren. Spülen Sie danach den Kolben und das Sieb mit HBSS 2% FCS, um anhaftende Zellen zu gewinnen. Pipettieren Sie dann die dissoziierten Thymuszellen und die Flüssigkeit aus der Petrischale in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Petrischale mit fünf Millilitern HBSS 2% FCS und geben Sie diese Waschlösung ebenfalls in das 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Als nächstes zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 370 mal g für sieben Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern ACK-Lysingpuffer, um die Erythrozyten zu lysieren. Zwei Minuten bei Raumtemperatur auf der Tischplatte inkubieren. Bringen Sie dann das Volumen auf 14 Milliliter mit HBSS 2% FCS. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 370 mal g für sieben Minuten bei 20 Grad Celsius. Verwerfen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern HBSS 2% FCS.
Schätzen Sie die Zellkonzentration anhand eines Malassez-Objektträgers, wie im Protokoll für die FACS-Isolierung von B-Lymphozyten gezeigt, und passen Sie die Zellkonzentration auf 10 bis siebte Zellen pro Milliliter mit HBSS 2% FCS an.
Füllen Sie 500 Mikroliter Zelllösung in zwei FACS-Röhrchen um. Markieren Sie in einem Röhrchen nicht angereicherte T-Zellen und in dem anderen Röhrchen angereicherte T-Zellen, die durch magnetische Markierung getrennt werden.
Zentrifugieren Sie das angereicherte T-Zellen-Röhrchen bei 370 mal g für drei Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 250 Mikrolitern biotingekoppeltem Anti-CD3-Antikörper, verdünnt 1 zu 400 in HBSS 2% FCS. Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang auf Eis und im Dunkeln. Geben Sie drei Milliliter HBSS 2% FCS in die Röhrchen und zentrifugieren Sie sie erneut bei 370 mal g für drei Minuten bei 20 Grad Celsius. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 250 Mikrolitern Streptavidin-gekoppelten Kügelchen resuspendieren, die jeweils fünf in HBSS 2 % FCS verdünnt sind. Inkubieren Sie die Mischung aus Zellen und Kügelchen 20 Minuten lang auf Eis. Geben Sie dann drei Milliliter HBSS 2% FCS in das Röhrchen, pipettieren Sie zum Mischen auf und ab und zentrifugieren Sie erneut bei 370 mal g für drei Minuten bei 20 Grad Celsius. Resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern HBSS 2% FCS.
Setzen Sie die Säule auf den Magneten und fügen Sie drei Milliliter HBSS 2 % FCS hinzu, um das System zu befeuchten. Pipettieren Sie dann die gefärbten Zellen in die Säule. Nachdem die Zellsuspension die Säule durchlaufen hat, waschen Sie die Säule dreimal mit drei Millilitern HBSS 2 % FCS. Entfernen Sie anschließend die Säule vom Magneten und legen Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Um die Zielzellen zu eluieren, geben Sie fünf Milliliter HBSS 2% FCS in die Säule und spülen Sie die Säule mit einem Kolben. Wiederholen Sie diesen Schritt mit weiteren fünf Millilitern HBSS 2% FCS.
Um die Wirksamkeit der Zielzellisolierung zu bewerten, werden zunächst 500 Mikroliter der eluierten Zellsuspension in ein FACS-Röhrchen überführt und die angereicherten T-Zellen markiert. Zentrifugieren Sie dann sowohl die angereicherten als auch die nicht angereicherten Röhrchen bei 370-mal g für sieben Minuten bei 20 Grad Celsius. Der Überstand wird verworfen und dann 100 Mikroliter fluoreszierender Antikörper, verdünnt von eins zu 200 in HBSS 2 % FCS, in beide Röhrchen gegeben. Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang auf Eis und im Dunkeln. Geben Sie anschließend drei Milliliter HBSS 2% FCS in die Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 370 mal g für drei Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in 250 Mikrolitern HBSS 2 % FCS. Bewerten Sie nun die CD3-positive Zellanreicherungsrate mithilfe der Durchflusszytometrie, wie im FACS-Protokoll gezeigt.
Nun werden wir die Häufigkeit von CD3-positiven Lymphozyten unter allen Thymozyten bestimmen, die aus dem Thymus der Maus isoliert wurden. Um zu beginnen, doppelklicken Sie auf das FlowJo-Symbol und ziehen Sie die Dateien für jede Röhre in das Fenster für alle Proben. Doppelklicken Sie dann auf die angereicherte T-Zellen-Datei, um die aus dieser Stichprobe aufgezeichneten Zellen in einem Punktdiagramm anzuzeigen, das die Vorwärtsstreuung (FSCA) auf der x-Achse und die Seitenstreuung (SSCA) auf der y-Achse anzeigt.
Klicken Sie auf das Polygon, um die Lymphozytenpopulationen einzukreisen. Doppelklicken Sie anschließend auf die eingekreiste Bevölkerung, um ein neues Fenster zu erstellen. Wählen Sie FSC-W auf der y-Achse und FSC-A auf der x-Achse aus, und kreisen Sie die negativen Zellen FSA-W ein. Nennen Sie im Fenster zur Identifizierung der Teilpopulation Ihre Zellpopulation Einzelne Zellen. Klicken Sie anschließend im Fenster zur Identifizierung der Teilpopulation auf OK und doppelklicken Sie dann auf die eingekreiste Bevölkerung, um ein neues Fenster zu erstellen. Wählen Sie CD3 auf der y-Achse aus, und kreisen Sie die CD3-positiven Zellen ein. Benennen Sie im Fenster zur Identifizierung der Teilpopulation Ihrer Zellpopulation T-Zellen. Wiederholen Sie den Vorgang mit der Datei mit den nicht angereicherten T-Zellen. Um Ihre Zellpopulation zu visualisieren, klicken Sie auf Layout-Editor und ziehen Sie die T-Zellpopulation aus den Dateien mit angereicherten T-Zellen und nicht angereicherten T-Zellen auf die Registerkarte.
Punktdiagramme, die CD3-positive Lymphozyten darstellen, werden angezeigt. CD3-positive Zellen sollten nur in der Population auftreten, die in der CD3-positiv angereicherten Röhre von Interesse ist. Um die Anreicherung von CD3-positiven Lymphozyten in den sortierten Zellen zu bewerten, klicken Sie auf Tabelleneditor und ziehen Sie dann die T-Zell-Population aus angereicherten T-Zellen und nicht angereicherten T-Zellen in die Tabelle. Wählen Sie im Statistikmenü die Option Häufigkeit von Lymphozytenzellen, um den Prozentsatz der CD3-positiven Zellen in allen Lymphozyten zu überprüfen. Klicken Sie dann auf Tabelle erstellen. Die Parameterwerte werden in einer neuen Tabelle angezeigt. Bei den angereicherten T-Zellen sollte die Häufigkeit der CD3-positiven Zellen bei etwa 80 % oder mehr liegen.
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