Question 1

Was ist magnetisch-aktivierte Zellsortierung und wie trennt sie Zellen?

Accepted Answer

Magnetic-aktivierte Zellsortierung, oder MACS, ist eine Technik, die Zellen auf Grundlage spezifischer Epitope, die auf ihren Oberflächen exprimiert werden, trennt. Antikörper, die mit Biotin konjugiert sind, binden an Zielzellen, dann heften sich an Biotin gebundene magnetische Beads an die Biotin-markierten Zellen. Markierte Zellen haften an einem Magneten in einer Kolonne, während unmarkierte Zellen durchfließen, was zu einer Rückgewinnung von 60 bis 98% der Zielzellen führt.

Question 2

Wie funktioniert die Biotin-Streptavidin-Interaktion in MACS?

Accepted Answer

Biotin, das an Antikörper gebunden ist, die auf spezifische Zelloberflächenmarker abzielen, hat eine hohe Affinität für Streptavidinmoleküle, die mit magnetischen Perlen verschmolzen sind. Wenn Biotin und Streptavidin in Kontakt kommen, binden sie fest und beschichten Zielzellen mit magnetischen Perlen. Dieser Sandwich-Komplex aus Zelloberflächenmarker, Antikörper und magnetischer Perle ermöglicht die magnetische Aufnahme und Trennung.

Question 3

Welche Schritte sind an der Vorbereitung von Thymusgewebe für die MACS-Isolierung beteiligt?

Accepted Answer

Der Thymus wird entnommen und mechanisch mithilfe eines Zellsiebs und eines Stößels in einzelne Zellen dissoziiert. Unerwünschte Erythrozyten werden mit ACK-Puffer lysiert. Die Zellen werden dann zentrifugiert und in HBSS mit fetalem Kälberserum resuspendiert. Die Zellkonzentration wird auf 10 zum siebten Zellen pro Milliliter eingestellt, bevor die magnetische Markierung mit Anti-CD3-Antikörpern erfolgt.

Question 4

Wie werden CD3-positive T-Zellen während MACS markiert und eingefangen?

Accepted Answer

Zellen werden mit Biotin-gekoppelten Anti-CD3-Antikörpern für 20 Minuten auf Eis inkubiert, dann gewaschen. Streptavidin-gekoppelte magnetische Perlen werden hinzugefügt und für 20 Minuten inkubiert. Die markierte Zellsuspension wird in eine auf einem Magneten positionierte Säule pipettiert, wo CD3-positive Zellen adhieren, während unmarkierte Zellen in ein Sammelröhrchen fließen.

Question 5

Was ist der Zweck der Verwendung einer Säule im MACS-Trennprozess?

Accepted Answer

Die Säule enthält eine nicht-magnetische Matrix, die den Weg verlängert, den die Zellen durch das System zurücklegen. Dies verlangsamt den Zellfluss und ermöglicht mehr Zeit für magnetische Perlen, Zielzellen effizient einzufangen. Die Säule verbessert die Trenneffizienz und erhöht den Prozentsatz der wiedergewonnenen Zellen im Vergleich zur direkten magnetischen Trennung ohne Säule.

Question 6

Wie wird die Anreicherungseffizienz von CD3-positiven T-Zellen nach MACS überprüft?

Accepted Answer

Angereicherte und nicht angereicherte Zellproben werden mit fluoreszierenden Anti-CD3-Antikörpern gefärbt und unter Verwendung von Durchflusszytometrie analysiert. Punktdiagramme zeigen CD3-positive Lymphozyten, die vorwiegend in der angereicherten Probe erscheinen sollten. Die Häufigkeit der CD3-positiven Zellen unter allen Lymphozyten wird berechnet, wobei angereicherte T-Zellen typischerweise 80% oder mehr CD3-positive Zellen aufweisen.

Question 7

Was sind die Unterschiede zwischen positiver und negativer magnetischer Sortierung?

Accepted Answer

Bei der positiven Sortierung werden Zellen von Interesse mit magnetischen Perlen erfasst, die mit Antikörpern gekoppelt sind, die auf gewünschte Oberflächenmarker abzielen. Bei der negativen Sortierung werden unerwünschte Zellen entfernt, indem sie mit magnetischen Perlen gefangen werden, die geeignete Antikörper tragen. Beide Ansätze verwenden das gleiche MACS-Prinzip, unterscheiden sich jedoch darin, welche Zellpopulation beibehalten oder verworfen wird.

Magnetaktivierte Zellsortierung (MACS): Isolierung von T-Lymphozyten - Bewertungsquiz