ELISA-Test: Indirekt, Sandwich und kompetitiv
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Overview
Quelle: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3, und Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
2 Zentrum für Immunologie, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
3 Mikrobiologie, Immunologie und Krebsbiologie Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
4 Freimaurerkrebszentrum, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Enzymgebundener Immunsorbent-Assay (ELISA) wird häufig verwendet, um das Vorhandensein und/oder die Konzentration eines Antigens, Antikörpers, Peptids, Proteins, Hormons oder eines anderen Biomoleküls in einer biologischen Probe zu messen. Es ist extrem empfindlich, in der Lage, niedrige Antigenkonzentrationen zu erkennen. Die Empfindlichkeit von ELISA wird auf seine Fähigkeit zurückgeführt, die Wechselwirkungen zwischen einem einzelnen Antigen-Antikörper-Komplex zu erkennen (1). Darüber hinaus ermöglicht die Aufnahme eines enzymkonjugierten antigenspezifischen Antikörpers die Umwandlung eines farblosen Substrats in ein chromogenes oder fluoreszierendes Produkt, das von einem Plattenleser erkannt und leicht quantisiert werden kann. Im Vergleich zu den Werten, die durch titrated Mengen eines bekannten Antigens von Interesse erzeugt werden, kann die Konzentration des gleichen Antigens in den experimentellen Proben bestimmt werden. Verschiedene ELISA-Protokolle wurden angepasst, um Antigenkonzentrationen in einer Vielzahl von Versuchsproben zu messen, aber sie alle haben das gleiche Grundkonzept (2). Die Wahl des Typs von ELISA, der indirekt, Sandwich oder wettbewerbsfähig ist, hängt von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich der Komplexität der zu testenden Proben und der antigenspezifischen Antikörper, die zur Verwendung zur Verfügung stehen. Der indirekte ELISA wird häufig verwendet, um das Ergebnis einer immunologischen Reaktion zu bestimmen, wie z. B. die Messung der Konzentration eines Antikörpers in einer Probe. Der Sandwich-ELISA eignet sich am besten zur Analyse komplexer Proben, wie Gewebekulturüberstand oder Gewebelysate, bei denen der Analyt oder Antigen von Interesse Teil einer gemischten Probe ist. Schließlich wird der wettbewerbsfähige ELISA am häufigsten verwendet, wenn nur ein Antikörper zur Verfügung steht, um das Antigen von Interesse zu erkennen. Wettbewerbsfähige ELISAs sind auch nützlich, um ein kleines Antigen mit nur einem einzigen Antikörper-Epitop zu erkennen, das aufgrund von sterischer Behinderung zwei verschiedene Antikörper nicht aufnehmen kann. Das Protokoll wird die grundlegenden Verfahren für die indirekten, Sandwich- und wettbewerbsfähigen ELISA-Assays beschreiben.
Der indirekte ELISA-Assay wird häufig verwendet, um die Menge an Antikörpern im Serum oder im Überstand einer Hybridomkultur zu messen. Das allgemeine Verfahren für den indirekten ELISA-Test ist:
- Mantelbrunnen mit Antigenen
- Hinzufügen von Serum- oder Hybridomkultur-Überstand-Antikörpern (Primär- oder 1°-Antikörper)
- Inkubieren und waschen
- Sekundärer (oder 2°) enzymkonjugierter Antikörper hinzufügen
- Inkubieren und waschen
- Substrat hinzufügen
Der Sandwich-ELISA-Assay unterscheidet sich vom indirekten ELISA-Assay dadurch, dass das Verfahren keine Beschichtung der Platten mit einem gereinigten Antigen beinhaltet. Stattdessen wird ein “Capture”-Antikörper verwendet, um die Brunnen der Platte zu beschichten. Das Antigen wird zwischen dem Capture-Antikörper und einem zweiten “detektions”-Enzymkonjugatierten Antikörper “sandwiched” – wobei beide Antikörper spezifisch für das gleiche Antigen sind, jedoch an unterschiedlichen Epitopen (3). Durch Bindung an den Capture-Antikörper/Antigen-Komplex verbleibt der Detektionsantikörper in der Platte. Als Aufnahme- und Nachweisantikörper können entweder monoklonale Antikörper oder polyklonale Antisera verwendet werden. Der Hauptvorteil des Sandwich-ELISA besteht darin, dass die Probe nicht vor der Analyse gereinigt werden muss. Darüber hinaus kann der Test sehr empfindlich sein (4). Viele handelsübliche ELISA-Kits sind von der Sandwich-Vielfalt und verwenden getestete, abgestimmte Paare von Antikörpern. Das allgemeine Verfahren für den Sandwich ELISA Assay ist:
- Mantelbrunnen mit Capture-Antikörper
- Hinzufügen von Testproben mit Antigen
- Inkubieren und waschen
- Fügen Sie enzymkonjugierten Detektionsantikörper hinzu.
- Inkubieren und waschen
- Substrat hinzufügen
Die meisten handelsüblichen Sandwich-ELISA-Kits sind mit enzymkonjugierten Nachweisantikörpern ausgestattet. In Fällen, in denen kein enzymkonjugierter Detektionsantikörper verfügbar ist, kann ein sekundärer enzymkonjugierter Antikörper verwendet werden, der speziell für den Nachweisantikörper ist. Das Enzym auf dem sekundären Antikörper erfüllt die gleiche Rolle, d.h. das farblose Substrat in ein chromogenes oder fluoreszierendes Produkt umzuwandeln. Der oben erwähnte sekundäre enzymkonjugierte Antikörper würde eher in einem “hausgemachten” Sandwich-ELISA verwendet werden, das von einem Forscher entwickelt wurde, der beispielsweise eigene monoklonale Antikörper erzeugt hat. Ein Nachteil bei der Verwendung eines sekundären enzymkonjugierten Antikörpers besteht darin, sicher zu sein, dass er nur an den Nachweisantikörper bindet und nicht an den an die Platte gebundenen Capture-Antikörper. Dies würde zu einem messbaren Produkt in allen Brunnen führen, unabhängig vom Vorhandensein oder Fehlen von Antigen oder Detektionsantikörper.
Schließlich wird der wettbewerbsfähige ELISA-Test verwendet, um lösliche Antigene zu erkennen. Es ist einfach durchzuführen, aber es ist nur geeignet, wenn das gereinigte Antigen in einer relativ großen Menge verfügbar ist. Das allgemeine Verfahren für den wettbewerbsfähigen ELISA-Test ist:
- Mantelbrunnen mit Antigen
- Inkubieren und waschen
- Präinkubent-Testprobe mit enzymkonjugierten Primärantikörpern
- Mischung gut hinzufügen
- Inkubieren und waschen Sie alle ungebundenen enzymkonjugierten Primärantikörper
- Substrat hinzufügen
Der “Wettbewerb” in diesem Test kommt aus der Tatsache, dass mehr Antigen in der Testprobe in Schritt 3 verwendet wird in weniger Antikörper zur Verfügung, um an die Antigenbeschichtung des Brunnens zu binden führen. Somit hängt die Intensität des chromogenen/fluorogenen Produkts im Brunnen am Ende des Tests umgekehrt mit der in der Testprobe vorhandenen Antigenmenge zusammen.
Eine Schlüsselkomponente in jeder Art von ELISA sind die titrierten Standards bekannter Konzentrationen, die es dem Benutzer ermöglichen, die antigenische Konzentration in den Testproben zu bestimmen. Typischerweise sind eine Reihe von Brunnen für die Erstellung einer Standardkurve vorgesehen, bei der bekannte Mengen eines gereinigten rekombinanten Proteins in abnehmenden Mengen zu den Brunnen hinzugefügt werden. Wenn diese Brunnen gleichzeitig mit den Testproben verarbeitet werden, kann der Anwender einen Referenzsatz von Absorptionswerten erhalten, die von einem Mikroplattenleser für bekannte Proteinkonzentrationen erhalten werden, um mit den Absorptionswerten für die Testproben zu gehen. Der Anwender kann dann eine Standardkurve berechnen, mit der die Testproben verglichen werden können, um die Menge des vorhandenen Proteins zu bestimmen. Die Standardkurve kann auch den Grad der Präzision der Verdünnungsherstellung des Benutzers bestimmen.
Schließlich erfordert der letzte Schritt in jedem der oben aufgeführten ELISA-Typen die Zugabe eines Substrats. Der Grad der Umwandlung des Substrats in das Produkt steht in direktem Zusammenhang mit der Menge des Enzyms, das im Brunnen vorhanden ist. Meerrettichperoxidase (HRP) und alkalische Phosphatase (AP) sind die häufigsten Enzyme, die konjugiert mit Antikörpern gefunden werden. Wie erwartet, gibt es eine Reihe von Substraten, die spezifisch für Enzyme verfügbar sind, die ein chromogenes oder fluoreszierendes Produkt produzieren. Darüber hinaus sind Substrate in einer Reihe von Empfindlichkeiten erhältlich, die die Gesamtempfindlichkeit des Assays erhöhen können. Der Anwender muss auch die Art der Instrumentierung berücksichtigen, die für das Ablesen der Platte am Ende des Experiments zur Verfügung steht, wenn er den zu verwendenden Substrattyp sowie den entsprechenden enzymkonjugierten Antikörper wählt.
Häufig verwendete chromogene Substrate für HRP umfassen 2,2′-Azinobis [3-Ethylbenzothiazolin-6-Sulfonsäure]-Diammoniumsalz (ABTS) und 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB), während p-Nitrophenylphosphat (PNPP) für AP verwendet wird. ABTS und TMB wasserlösliche grüne bzw. blau gefärbte Reaktionsprodukte herstellen. Das grüne ABTS-Produkt hat zwei Hauptabsorptionsspitzen, 410 und 650 nm, während das blaue TMB-Produkt am besten bei 370 und 652 nm nachgewiesen wird. Die Farben von ABTS und TMB ändern sich nach Zugabe einer sauren Stop-Lösung in Gelb, die am besten bei 450 nm gelesen wird. Die Farbentwicklung für ABTS ist langsam, während sie für TMB schnell ist. TMB ist empfindlicher als ABTS und kann ein höheres Hintergrundsignal erzeugen, wenn die enzymatische Reaktion zu lange dauert. PNPP produziert ein gelbes wasserlösliches Produkt nach DER AP-Umwandlung, das Licht bei 405 nm absorbiert.
Procedure
1. Indirekter ELISA
Ein indirekter ELISA ist einer, bei dem der primäre antigenspezifische Antikörper von einem sekundären konjugierten Antikörper erkannt wird. Das folgende Protokoll ist ein Beispiel für eine indirekte ELISA-Methode, bei der die Serumproben von Mit infizierten Mäusen des Influenza-A-Virus (IAV) auf das Vorhandensein von IAV-spezifischen IgG-Antikörpern getestet werden. Eine Stärke dieses Beispiels besteht darin, dass verschiedene sekundäre Antikörper verwendet werden können, die alle Antikörper-Isotypen oder bestimmte Isotypen (z. B. IgG) erkennen.
Beschichtungsantigen auf die Mikroplatte
- Beschichten Sie die Bohrungen einer 96-Well-ELISA-Platte mit gereinigtem Antigen, indem Sie 50 l gereinigtes Antigen (2 mg/ml gereinigtes A/PR/8 Influenza-A-Virus im 0,05M Tris-HCl-Puffer (pH 9,5)) in jeden Bohrgut der Platte einleiten.
- Bedecken Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4°C, damit sich das Antigen an die Platte bindet.
- Entfernen Sie nach der Inkubationsvervollständigung die Beschichtungslösung, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben.
Blockieren
- Blockieren Sie die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den beschichteten Brunnen durch Zugabe von 200 l Sperrpuffer, 5% Eselserum in 1X PBS wird hier pro Brunnen verwendet. Alternative Blockierreagenzien sind 5 % fettfreie Trockenmilch oder BSA in PBS oder normales Serum von einem Tier, bei dem der sekundäre Antikörper erzeugt wurde.
- Mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubieren.
- Entfernen Sie nach der Inkubation den Sperrpuffer, indem Sie die Platte flicken, und waschen Sie dann die Platte mit PBS, die 1% Tween-20 enthält.
Inkubation mit dem primären Antikörper
- Bereiten Sie eine serielle Verdünnung der Serumprobe vor, die den primären Antikörper enthält, um einen Verdünnungsbereich von 1 bis 204.800 zu erhalten, indem Sie 1X PBS verwenden. Dazu verdünnen Sie zuerst das Serum 1:12,5 und führen Sie dann eine 4X Verdünnung (Verdünnungsbereich – 1:12,5 bis 1:204,800) durch.
- Fügen Sie 100 l der seriell verdünnten Serumproben in die Brunnen.
- Abdeckplatte mit Klebeabdeckung und inkubieren bei Raumtemperatur für 1-2 h.
- Nach der Inkubation die Platte über ein Waschbecken und eine Waschplatte mit PBS mit 1% Tween-20 streichen.
Inkubation mit dem sekundären Antikörper
- Fügen Sie in diesem Experiment 100 L eines enzymkonjugierten Sekundärantikörpers, Der Meerrettichperoxidase, der HRP-konjugierten Esel-Anti-Maus-Sekundärinstand in diesem Experiment, zu jedem Brunnen hinzu.
- Inkubieren Sie die Platte für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Nach der Inkubation die Platte über ein Waschbecken ziehen und dann die Platte mit PBS mit 1% Tween-20 waschen.
entdeckung
- Fügen Sie 100 l des Indikatorsubstrats (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB)) in einer Konzentration von 1 mg/ml zu jedem Brunnen hinzu.
- Inkubieren Sie die Platte mit dem Substrat für 5-10 min bei Raumtemperatur.
- Nach 10 min stoppen Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 100 l 2N Schwefelsäure (H2SO4) hinzufügen.
Innerhalb von 30 min nach Zugabe der Stop-Lösung, lesen Sie die Platte mit einem Mikroplattenleser bei 405 nm, um die Absorption der Brunnen zu bestimmen.
2. Sandwich ELISA
In dieser ELISA-Version wird die Versuchsprobe zwischen einem unkonjugierten Capture-Antikörper und einem konjugierten Detektionsantikörper “sandwichiert”, die beide spezifisch für dasselbe Protein, aber an unterschiedlichen Epitopen sind. Im folgenden Sandwich-ELISA-Beispiel wurde die Konzentration von humanem TNF in unbekannter Probe anhand einer Standardkurve ermittelt, die aus der 2,5-fachen seriellen Verdünnung eines bekannten, rekombinanten menschlichen TNFs (mit einer Konzentration von 75 pg/ml) erzeugt wurde.
Beschichtungs-Capture-Antikörper an die Mikroplatte
- Beschichten Sie die Bohrungen einer 96-Well-ELISA-Platte mit gereinigtem Capture-Antikörper, indem Sie jedem Bohrkörper der Platte 100 l Aufnahmeantikörper (1-10 g/ml-Bereich) hinzufügen.
- Deckplatte mit Klebeplattenabdeckung abdecken und bei 4°C über Nacht bebrüten.
- Nach der Inkubation entfernen Sie die Beschichtungslösung von der Platte, indem Sie die Platte über ein Waschbecken flicken.
Blockieren
- Blockieren Sie die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den Antikörper-beschichteten Brunnen, indem Sie den Brunnen eine Blockierlösung von 200 l, 5 % fettfreie Trockenmilch, die PBS enthält, hinzufügen.
- Mindestens 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubieren.
- Entfernen Sie nach der Inkubation den Sperrpuffer, indem Sie die Platte flicken, und waschen Sie dann die Platte mit PBS, die 1% Tween-20 enthält.
Hinzufügen von Antigen-haltigen Testproben
- Fügen Sie 100 l der Testprobe zu den Bohrungen hinzu. Versiegeln Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung.
- 1-2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubieren.
- Nach der Inkubation entfernen Sie die Proben, indem Sie die Platte über das Waschbecken streichen, und waschen Sie dann die Brunnen mit 200 l 1X PBS, die 1% Tween-20 enthalten.
Enzymkonjugierte Detektionsantikörper hinzufügen
- Fügen Sie 100 L enzymkonjugierten Detektionsantikörper in einer voroptimierten Konzentration in die Brunnen ein.
- Versiegeln Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung und brüten Bei Raumtemperatur für 2 h.
- Entfernen Sie den ungebundenen Detektionsantikörper, indem Sie die Platte über ein Waschbecken streichen, und waschen Sie die Brunnen mit 200 l 1X PBS, die 1% Tween-20 enthalten.
entdeckung
- Fügen Sie 100 l des Indikatorsubstrats bei einer Konzentration von 1 mg/ml hinzu. Jeder gebundene enzymkonjugierte Detektionsantikörper wandelt das Substrat in ein nachweisbares Signal um.
- Inkubieren Sie die Platte für 5-10 min bei Raumtemperatur.
- Beenden Sie nach 5-10 min die enzymatische Reaktion, indem Sie den Brunnen 100 l 2N H2SO4 hinzufügen. Innerhalb von 30 min nach Zugabe der Stop-Lösung, lesen Sie die Platte mit einem Mikroplattenleser, um die Absorption der Brunnen zu bestimmen.
3. Wettbewerbsfähiger ELISA
Die Schritte eines wettbewerbsfähigen ELISA unterscheiden sich von denen, die in indirekt und Sandwich-ELISA verwendet werden, wobei der Hauptunterschied der wettbewerbsfähige Bindungsschritt zwischen dem Probenantigen und dem “Add-in”-Antigen ist. Das Probenantigen wird mit dem nicht beschrifteten Primärantikörper inkubiert. Diese Antikörper-Antigen-Komplexe werden dann der ELISA-Platte zugesetzt, die mit dem gleichen Antigen vorbeschichtet wurde. Nach einer Inkubationszeit wird jeder ungebundene Antikörper weggespült. Es besteht eine umgekehrte Korrelation zwischen der Menge an freiem Antikörper, die zur Bindung des Antigens im Brunnen zur Verfügung steht, und der Menge an Antigen in der ursprünglichen Probe. Zum Beispiel würde eine Probe mit reichlich Antigen mehr Antigen-Primär-Antikörper-Komplexe haben, so dass wenig ungebundener Antikörper an die ELISA-Platte zu binden. Anschließend wird den Brunnen ein enzymkonjugierter Sekundärantikörper zugesetzt, gefolgt vom Substrat.
Beschichtungsantigen auf die Mikroplatte
- Beschichten Sie die Bohrungen einer 96-Well-ELISA-Platte mit 100 l gereinigtem Antigen in einer Konzentration von 1-10 g/ml.
- Deckplatte mit Klebeplattenabdeckung abdecken und über Nacht bei 4°C bebrüten.
- Entfernen Sie nach der Inkubation die ungebundene Antigenlösung aus den Brunnen, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben.
Blockieren
- Blockieren Sie die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den beschichteten Brunnen, indem Sie jedem Bohrgut 200 L Sperrpuffer hinzufügen, der entweder 5 % fettfreie Trockenmilch oder BSA in PBS sein kann.
- Inkubieren Sie die Platte für mindestens 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C.
Inkubationsprobe (Antigen) mit dem primären Antikörper
- Während der Blockierung der Brunnen, bereiten Sie die Antigen-Antikörper-Mischung durch Mischen 150 l Probe Antigen und 150 l primären Antikörper für jeden Brunnen in den Test.
- Inkubieren Sie diese Mischung für 1 h bei 37°C.
Antigen-Antikörper-Mischung in den Brunnen geben
- Entfernen Sie nun den Sperrpuffer aus den Brunnen, indem Sie die Platte über eine Spüle schieben.
- Dann waschen Sie die Brunnen mit 1X PBS enthalten Tween-20.
- Fügen Sie 100 l der Probe Antigen-Primär-Antikörper-Mischung.
- Inkubieren Sie die Platte bei 37°C für 1 h.
- Entfernen Sie die Probenmischung, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben.
- Waschen Sie dann die Brunnen mit 1X PBS, die 1% Tween-20 enthalten, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen.
Hinzufügen des sekundären Antikörpers
- Fügen Sie jedem Brunnen 100 l eines enzymkonjugierten Sekundärantikörpers, der in diesem Fall AP-konjugierter Antikörper ist, hinzu.
- Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei 37°C.
- Waschen Sie die Platte nach der Inkubation mit 1X PBS, die 1% Tween-20 enthält.
entdeckung
- Fügen Sie jedem Brunnen 100 l der Substratlösung hinzu.
- Warten Sie auf 5-10 min.
- Nach 10 min beenden Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie den Brunnen 100 l 2N Schwefelsäure zusetzen. Messen Sie dann die Absorption in einem Mikroplattenleser innerhalb von 30 min nach Zugabe der Stop-Lösung
Enzymgebundener Immunosorbent Assay oder ELISA ist ein hochempfindlicher quantitativer Test, der häufig verwendet wird, um die Konzentration eines Analyten wie Zytokine und Antikörper in einer biologischen Probe zu messen. Das allgemeine Prinzip dieses Assays umfasst drei Schritte: beginnend mit der Erfassung oder Immobilisierung des Zielanalyten auf einer Mikroplatte, gefolgt vom Nachweis des Analyten durch zielspezifische Detektionsproteine und schließlich der Enzymreaktion, bei der ein konjugiertes Enzym wandelt sein Substrat in ein farbiges Produkt um. Basierend auf verschiedenen Methoden der Erfassung und Detektion kann ELISA von vier Typen sein: direkt, indirekt, Sandwich und wettbewerbsfähig.
Bei direktem ELISA wird das Zielantigen zunächst an die Platte gebunden und dann durch einen bestimmten Detektionsantikörper nachgewiesen. Diese Methode wird häufig zum Screening von Antikörpern für ein bestimmtes Antigen verwendet. Indirekter ELISA wird zum Nachweis von Antikörpern in einer Probe verwendet, um Immunantworten zu quantifizieren. Die Platte wird zunächst mit einem spezifischen Aufnahmeantigen beschichtet, das den Zielantikörper immobilisiert, und dieser Antigen-Antikörper-Komplex wird dann mit einem zweiten Antikörper nachgewiesen.
Bei Sandwich-ELISA ist das Zielanalyt ein Antigen, das mit einem Capture-Antikörper auf der Platte aufgenommen und dann vom Detektionsantikörper erfasst wird und somit ein Antikörper-Antigen-Antikörper-Sandwich bildet. Diese Methode ist nützlich, um die Konzentration eines Antigens in einer gemischten Probe zu messen.
Competitive ELISA wird verwendet, wenn nur ein Antikörper für ein Zielantidem von Interesse verfügbar ist. Die Platte wird zuerst mit dem gereinigten Antigen beschichtet. In der Zwischenzeit wird die Probe, die das Antigen enthält, mit dem Antikörper vorinkubiert und dann der Platte zugesetzt, damit freie Antikörpermoleküle an das immobilisierte Antigen binden können. Je höher das Signal von der Platte, desto niedriger ist die Antigenkonzentration in der Probe. Bei allen vier Arten von ELISA, direkt, indirekt, Sandwich und wettbewerbsfähig, wird der Nachweisantikörper entweder direkt mit dem Enzym konjugiert oder kann indirekt durch einen anderen Antikörper oder ein anderes Protein mit ihm in Verbindung gebracht werden.
Die für die Reaktion gebräuchlichen Enzyme sind Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase mit ihren jeweiligen Substraten, die beide ein lösliches, farbiges Produkt produzieren, das mit einem Plattenleser gemessen und quantifiziert werden kann. In diesem Video werden Sie beobachten, wie indirekte ELISA, Sandwich-ELISA und wettbewerbsfähiger ELISA ausgeführt werden, gefolgt von Beispielen für die Quantifizierung des Zielanalyten aus den indirekten und Sandwich-ELISA-Methoden.
Das erste Experiment wird zeigen, wie indirektes ELISA verwendet wird, um das Vorhandensein von Anti-Influenza-Virus-Antikörpern in Serum zu bestimmen, die von influenzainfizierten Mäusen gewonnen werden.
Zunächst 50 Mikroliter gereinigtes Antigen – in diesem Fall 2 Milligramm pro Milliliter gereinigtes A/PR/8 Influenza-A-Virus – zu jedem Brunnen einer 96-Well-ELISA-Platte hinzufügen. Als nächstes bedecken Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius, damit sich das Antigen an die Platte bindet. Entfernen Sie am nächsten Tag die Beschichtungslösung, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben. Als nächstes blockieren Sie die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den beschichteten Brunnen, indem Sie 200 Mikroliter eines Sperrpuffers – hier 5% Eselserum in 1X PBS- zu jedem Brunnen hinzufügen. Lassen Sie die Platte mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation den Sperrpuffer und waschen Sie die Platte, indem Sie 200 Mikroliter 1X PBS hinzufügen, die 1% Tween-20 enthalten. Streichen Sie die Platte noch einmal über das Waschbecken, um die Wäsche zu entfernen.
Bereiten Sie dann die Testproben vor, indem Sie 460 Mikroliter PBS in ein frisches Rohr geben und dann 40 Mikroliter Serum hinzufügen, um eine Verdünnung von 1 bis 12,5 zu erzielen. Dann fügen Sie 300 Mikroliter PBS zu einem zweiten Rohr hinzu, und fügen Sie dann 100 Mikroliter der ersten Verdünnung hinzu. Setzen Sie diesen seriellen Verdünnungsbereich fort, bis sie eine endgültige Probe mit einer Verdünnung von 1 bis 204.800 erhalten. Fügen Sie die seriell verdünnten Serumproben in dreifacher Auslage zu den Brunnen hinzu. Bedecken Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung und brüten Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Als nächstes entfernen Sie die Proben, indem Sie die Platte in die Spüle streichen und dann die Platte waschen, indem Sie 200 Mikroliter 1X PBS hinzufügen, die 1% Tween-20 enthalten. Streichen Sie erneut die Platte, um die Wäsche zu entfernen.
Fügen Sie nun 100 Mikroliter eines enzymkonjugierten Sekundärantikörpers hinzu, der in diesem Experiment eine Meerrettichperoxidase oder HRP, konjugierte Esel-Anti-Maus-Sekundär, zu jedem Brunnen ist. Inkubieren Sie die Platte für eine Stunde bei Raumtemperatur, und flicken Sie die Platte, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Waschen Sie die Platte mit 1X PBS mit 1% Tween-20 und wenden Sie dann 100 Mikroliter des Indikatorsubstrats mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter auf jeden Brunnen auf. Inkubieren Sie die Platte mit dem Substrat für 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur. In diesem Beispiel wird das farblose Substrat 3,3′, 5,5′ – Tetramethylbenzidin oder TMB, Substrat, eine blaue Farbe, wenn HRP vorhanden ist. Nach 10 Minuten die enzymatische Reaktion beenden, indem Sie 100 Mikroliter 2N Schwefelsäure hinzufügen. Die Proben werden eine gelbe Farbe.
Innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stop-Lösung, legen Sie die Platte in einen Mikroplattenleser und lesen Sie die Platte bei der entsprechenden Wellenlänge für das Substrat, um die Absorption der Brunnen zu bestimmen.
Um mit dem Sandwich-ELISA zu beginnen, muss die Platte mit gereinigtem Capture-Antikörper beschichtet werden. Dazu fügen Sie 100 Mikroliter des Capture-Antikörpers in einer Konzentration im Bereich von 1-10 Mikrogramm pro Milliliter zu jedem Brunnen einer 96-Well-ELISA-Platte hinzu. Als nächstes bedecken Sie die Platte mit einer Klebeplattenabdeckung und bebrüten die Platte dann über Nacht bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation die Beschichtungslösung, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben.
Blockieren Sie nun die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den beschichteten Brunnen, indem Sie 200 Mikroliter 5% fettfreie Trockenmilch in die Brunnen geben. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für mindestens 2 Stunden. Entfernen Sie anschließend den Sperrpuffer, und waschen Sie dann die Brunnen mit 1X PBS, die 1% Tween-20 enthalten. Entfernen Sie die Wäsche, indem Sie die Platte über das Waschbecken streichen. Fügen Sie nun 100 Mikroliter der Probe in die Brunnen, versiegeln Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung und inkubieren Sie sie dann bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Nach der Inkubation entfernen Sie die Proben, indem Sie die Platte über das Waschbecken streichen und dann die Brunnen mit 200 Mikrolitern 1X PBS mit 1% Tween-20 waschen. Streichen Sie die Platte über das Waschbecken, um die Wäsche zu entfernen und fügen Sie dann 100 Mikroliter enzymkonjugierten Detektionsantikörper in die Brunnen.
Versiegeln Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation den ungebundenen Detektionsantikörper, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben und die Brunnen mit 200 Mikrolitern 1X PBS mit 1% Tween-20 waschen. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter des Indikatorsubstrats bei einer Konzentration von 1 Milligramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie die Platte für 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 10 Minuten stoppen Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 100 Mikroliter 2N Schwefelsäure in die Brunnen geben und dann die Platte innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stop-Lösung in einem Mikroplattenleser lesen.
Um einen wettbewerbsfähigen ELISA durchzuführen, beschichten Sie zunächst die Brunnen einer 96-Well-ELISA-Platte mit 100 Mikroliter gereinigtem Antigen in einer Konzentration von 1-10 Mikrogramm pro Milliliter. Bedecken Sie die Platte mit einer Klebeplattenabdeckung und bebrüten Sie dann über Nacht bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie anschließend die ungebundene Antigenlösung aus den Brunnen, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben.
Als nächstes blockieren Sie die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den beschichteten Brunnen, indem Sie jedem Brunnen 200 Mikroliter Sperrpuffer hinzufügen- hier 5% fettfreie Trockenmilch in PBS. Inkubieren Sie die Platte für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur. Während der Blockierung der Brunnen, bereiten Sie die Antigen-Antikörper-Mischung in einem 1. 5 Milliliter Tube durch Zugabe von 150 Mikroliter n. Antigen probe zu 150 Mikroliter Primärantikörper für jeden Brunnen im Test. Inkubieren Sie diese Mischung für 1 Stunde bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nun den Sperrpuffer aus den Brunnen, indem Sie die Platte über eine Spüle schieben. Dann waschen Sie die Brunnen mit 1X PBS enthaltenTween 20 und fügen Sie dann 100 Mikroliter der Probe Antigen-Primär-Antikörper-Mischung.
Lassen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für eine Stunde bebrüten. Als nächstes entfernen Sie die Probenmischung, indem Sie die Platte über ein Waschbecken streichen und dann die Brunnen mit 1X PBS mit 1% Tween-20 waschen, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Fügen Sie 100 Mikroliter eines enzymkonjugierten Sekundärantikörpers zu jedem Brunnen hinzu und bebrüten die Platte für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Danach waschen Sie die Platte mit 1X PBS, die 1% Tween-20 enthält, und fügen Sie dann 100 Mikroliter der Substratlösung zu jedem Brunnen hinzu. Warten Sie 5-10 Minuten. Beenden Sie nach 10 Minuten die enzymatische Reaktion, indem Sie 100 Mikroliter 2N Schwefelsäure hinzufügen und messen Sie dann die Absorption in einem Mikroplattenleser innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stop-Lösung.
Für den semiquantitativen indirekten ELISA-Test wurde das Vorhandensein von Influenza-A-Virus-Antikörpern in seriell verdünnten Serumproben von Influenza-A-infizierten Mäusen bestimmt, indem die Absorption jedes Brunnens bei 405 Nanometern in einem Plattenleser gelesen wurde. Diese Rohdaten werden zu Berechnungszwecken in ein Spreadsheet exportiert. In diesem Experiment wurden die seriell verdünnten Serumproben, die von 1 – 12,5 bis 1 – 204.800 reichen, in Dreifacher Ausführung wiederholt.
Um die Daten zu analysieren, wird der mittlere Absorptionswert für jeden Satz von Triplicaten berechnet, indem alle Werte für jede Verdünnung addiert und die Summe durch 3 dividiert wird. Sobald der Mittelwert für jeden Satz von Triplicaten bestimmt ist, werden die mittleren OD450-Messwerte gegen die seriellen Verdünnungen dargestellt. Die OD-Werte nehmen ab, wenn das Serum verdünnt wird, was darauf hindeutet, dass in den verdünnteren Proben weniger Antikörper gefunden werden. Im quantitativen Sandwich-ELISA wurden Verdünnungen bekannter Standards, in diesem Fall rekombinantes Human TNFalpha, einer 96-Well-Platte zugesetzt und zusammen mit den unbekannten Proben gelesen.
Um die Standardkurve zu erstellen, wurde der mittlere Absorptionswert für jeden Satz von Messwerten der bekannten Konzentrationen berechnet. Anschließend wurde der mittlere Absorptionswert auf der y-Achse gegen die bekannten Proteinkonzentrationen auf der x-Achse dargestellt. Eine optimale Anpassungskurve wird durch die Punkte im Diagramm hinzugefügt.
Sobald die Standardkurve erzeugt ist, kann die Menge des TNFalpha-Proteins in der Testprobe durch erste Berechnung des mittleren Absorptionswertes für die Testprobe bestimmt werden. In diesem Beispiel ergaben die Testbeispiele OD450-Werte von 0,636 und 0. 681. Wenn man diese Werte addiert und die Summe durch 2 dividiert, ergibt sich ein Durchschnitt von 0,659. Von der y-Achse im Standardkurvendiagramm eine horizontale Linie von diesem Absorptionswert bis zur Standardkurve ausdehnen. Am Schnittpunkt eine vertikale Linie zur x-Achse ausdehnen und die entsprechende Konzentration ablesen, die in dieser Testprobe einer TNFalpha-Konzentration von 38,72 Piktogrammen pro Milliliter entspricht.
Results
Im folgenden Beispiel eines indirekten ELISA wurde das Vorhandensein eines Influenza-A-Virus (IAV)-spezifischen IgG im Serum von IAV-infizierten Mäusen bestimmt. C57Bl/6-Mäuse wurden mit dem Influenza-A-Virus infiziert (A/PR/8; 105 PFU in 100 L PBS i.p.) und Serum wurde 28 Tage später gesammelt. Um die Menge an IAV-spezifischem IgG im Serum zu quantifizieren, wurden 96-Well-ELISA-Platten über Nacht bei 4°C mit dem gereinigten A/PR/8 Influenza-A-Virus (50 l/well von 2 mg/ml PBS-Virus) beschichtet. Beschichtete Platten wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 5% normalem Eselserum in PBS blockiert, gefolgt von einer Inkubation mit verdünnten Serumproben von IAV-herausgeforderten Mäusen über Nacht bei 4°C. Das Serum wurde zunächst 1:12,5 verdünnt, gefolgt von 1:4 Verdünnungen (Verdünnungsbereich – 1:12,5 bis 1:204,800). Nach dem Waschen wurden die Teller mit einer alkalischen Phosphatase (AP)-konjugierten Esel Anti-Maus-IgG für 1 h inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und dann p-Nitrophenylphosphat (PNPP; 1 mg/ml, 100 l/well) zugegeben. Die farblose PNPP-Lösung wird gelb, wenn AP vorhanden ist. Nach 5-10 min wurde die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 100 l/well 2N H2SO4gestoppt. Die Platte wurde auf einem Mikroplattenleser bei 405 nm gelesen. Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 1 und Abbildung 1 dargestellt.
| probe | Wells | OD405 | knauserig |
| Serum 1:12,5 | A1 | 2.163 | 2.194 |
| B1 | 2.214 | ||
| C1 | 2.204 | ||
| Serum 1:50 | A1 | 1.712 | 1.894 |
| B1 | 2.345 | ||
| C1 | 1.624 | ||
| Serum 1:200 | A1 | 1.437 | 1.541 |
| B1 | 1.73 | ||
| C1 | 1.456 | ||
| Serum 1:800 | A1 | 1.036 | 0.957 |
| B1 | 0.912 | ||
| C1 | 0.923 | ||
| Serum 1:3200 | A1 | 0.579 | 0.48 |
| B1 | 0.431 | ||
| C1 | 0.429 | ||
| Serum 1:12800 | A1 | 0.296 | 0.281 |
| B1 | 0.312 | ||
| C1 | 0.236 | ||
| Serum 1:51200 | A1 | 0.308 | 0.283 |
| B1 | 0.299 | ||
| C1 | 0.243 | ||
| Serum 1:204800 | A1 | 0.315 | 0.303 |
| B1 | 0.298 | ||
| C1 | 0.297 |
Tabelle 1: Indirekte ELISA-Assay-Daten. Serumverdünnungen (von 1:12,5 bis 1:204.800), von Influenza-A-Virus (IAV)-infizierten Mäusen, die IAV-spezifische IgG-Werte, optische Dichtewerte (OD) (405 nm) und mittlere OD405-Werte enthalten.
Abbildung 1: Indirekte ELISA-Assay-Streuungsdiagramm egrinieren von mittleren OD405-Werten (+ S. D.) und Serumverdünnungen (von 1:12,5 bis 1:204.800), des Influenza-A-Virus (IAV)-spezifischen IgG im Serum von IAV-infizierten Mäusen. Die OD405-Werte können umgekehrt mit den Serumverdünnungen korreliert werden.
Im folgenden Beispiel eines Sandwich-ELISA wurde den angegebenen Bohrungen einer 96-Well-Flachbodenplatte eine Verdünnung der rekombinanten menschlichen TNF-Standards (ab einer Konzentration von 75 pg/ml) hinzugefügt. Diese Standards führten zu einer entsprechenden 2,5-fachen Veränderung der Absorptionswerte.
| probe | Konzentration (pg/ml) | Wells | Werte | Mittelwert | Zurück-Konzentrationsberechnung | durchschnitt |
| Standard 1 | 75 | A1 | 1.187 | 1.169 | 76.376 | 75.01 |
| A2 | 1.152 | 73.644 | ||||
| Standard 2 | 30 | B1 | 0.534 | 0.52 | 30.827 | 29.962 |
| B2 | 0.506 | 29.098 | ||||
| Standard 3 | 12 | C1 | 0.23 | 0.217 | 12.838 | 12.105 |
| C2 | 0.204 | 11.372 | ||||
| Standard 4 | 4.8 | D1 | 0.09 | 0.084 | 5.055 | 4.726 |
| D2 | 0.078 | 4.398 | ||||
| Standard 5 | 1.92 | E1 | 0.033 | 0.031 | 1.941 | 1.86 |
| E2 | 0.03 | 1.778 | ||||
| Standard 6 | 0.768 | F1 | 0.009 | 0.011 | 0.626 | 0.764 |
| F2 | 0.014 | 0.901 | ||||
| Standard 7 | 0.307 | G1 | 0.002 | 0.004 | 0.238 | 0.377 |
| G2 | 0.007 | 0.516 |
Tabelle 2: TNF-Sandwich-ELISA-Standardkurvendaten. Eine Verdünnung der rekombinanten menschlichen TNF-Normen (75 bis 0,3 pg/ml), OD-Werte (450 nm), mittlere OD450-Werte, Rückkonzentrationsberechnungen und deren Durchschnittswerte.
Abbildung 2: Standardkurve für TNF-Sandwich-ELISA. Eine Verdünnung der rekombinanten menschlichen TNF-Normen (75 bis 0,3 pg/ml) wurde mit Sandwich-ELISA analysiert. Die OD450-Werte können direkt mit den Standardverdünnungskonzentrationen korreliert werden. Anhand der Standardkurve, die einer Konzentration von 38,72 pg/ml entspricht, wurde die Menge des TNF-Proteins in der Testprobe ermittelt.
Sobald die Standardkurve erzeugt wurde, wurde die Menge des TNF-Proteins in der Testprobe bestimmt. In diesem Sandwich-ELISA-Beispiel ergaben die Testproben OD450 Messwerte von 0,636 und 0,681, was einem Durchschnitt von 0,6585 entspricht. Bei der Darstellung dieses OD450-Messwerts auf dem obigen Diagramm entspricht dies einer TNF-Konzentration von 38,72 pg/ml.
Applications and Summary
Wie gezeigt, fällt eine Reihe von Immunoassays (mit leichten Variationen in den Protokollen) in die ELISA-Technikfamilie. Die Bestimmung, welche Version von ELISA verwendet werden soll, hängt von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich des Antigens, des monoklonalen Antikörpers, der für ein bestimmtes Antigen verfügbar ist, und der gewünschten Empfindlichkeit des Assays (5). Einige Stärken und Schwächen der verschiedenen hier beschriebenen ELISAs sind:
| Elisa | Stärken | Schwächen |
| nicht direkt | 1) Hohe Empfindlichkeit aufgrund der Tatsache, dass mehrere enzymkonjugierte sekundäre Antikörper an den primären Antikörper binden können | 1) Hohes Hintergrundsignal kann auftreten, weil die Beschichtung des Antigens, das für die Platte von Interesse ist, nicht spezifisch ist (d. h., alle Proteine in der Probe werden die Platte beschichten) |
| 2) Viele verschiedene primäre Antikörper können von einem einzigen enzymkonjugierten sekundären Antikörper erkannt werden, der dem Anwender die Flexibilität gibt, denselben enzymkonjugierten sekundären Antikörper in vielen verschiedenen ELISA zu verwenden (unabhängig vom antigen, das nachgewiesen wird) | ||
| 3) Beste Wahl, wenn nur ein einziger Antikörper für das Antigen von Interesse zur Verfügung steht | ||
| sandwich | 1) Die Verwendung von antigenspezifischen Erfassungs- und Detektions-Monoklonen verstärkt die Empfindlichkeit und Spezifität des Assays (im Vergleich zum indirekten ELISA) | 1) Die Optimierung der Konzentrationen der monoklonalen Antikörper zur Erfassung und Detektion kann schwierig sein (besonders bei nicht-kommerziellen Kits) |
| 2) Beste Wahl für den Nachweis eines großen Proteins mit mehreren Epitopen (wie z. B. Zytokin) | ||
| kämpferisch | 1) Unreine Proben können verwendet werden | 1) Erfordert eine große Menge an hochreinem Antigen verwendet werden, um Platte zu beschichten |
| 2) Geringere Empfindlichkeit gegenüber Reagenzienverdünnungseffekten | ||
| 3) Ideal zum Nachweis kleiner Moleküle (z. B. Hapten) |
Tabelle 3: Zusammenfassung. Eine Zusammenfassung der Stärken und Schwächen der verschiedenen ELISA-Techniken.
Während eine einfache und nützliche Technik, gibt es auch einige Nachteile zu jedem ELISA. Eine davon ist die Ungewissheit über die Menge des Proteins, das für die Testproben von Interesse ist. Ist die Menge zu hoch oder zu niedrig, können die vom Mikroplattenleser ermittelten Absorptionswerte über bzw. unter die Grenzen der Standardkurve fallen. Dies wird es schwierig, die Menge des Proteins in den Testproben genau zu bestimmen. Wenn die Werte zu hoch sind, kann die Probe vor dem Hinzufügen zu den Plattenbrunnen verdünnt werden. Die Endwerte müssten dann entsprechend dem Verdünnungsfaktor angepasst werden. Wie bereits erwähnt, erfordern hausgemachte Kits oft eine sorgfältige Optimierung der Antikörperkonzentrationen, die verwendet werden, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen.
References
- Porstmann, T. and Kiessig S.T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
- Suleyman Aydin. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides, 72, 4-15 (2015).
- Gan. S. D. and Patel K. R. Enzyme Immunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Investigative Dermatology, 133 (9), 1-3 (2013).
- Kohl, T. O. and Ascoli C.A. Immunometric Antibody Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Cold Spring Harbor Protocols, 1 (6), (2017).
- Sakamoto, S., Putalun, W., Vimolmangkang, S., Phoolcharoen, W., Shoyama, Y., Tanaka, H., and Morimoto S. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of natural medicines, 72 (1), 32-42 (2018).
Transcript
Enzyme-linked Immunosorbent Assay, or ELISA is a highly sensitive quantitative assay commonly used to measure the concentration of an analyte like cytokines and antibodies in a biological sample. The general principle of this assay involves three steps: starting with capture, or immobilization, of the target analyte on a micro plate, followed by the detection of the analyte by target-specific detection proteins, and lastly, enzyme reaction, where a conjugated enzyme converts its substrate to a colored product. Based on different methods of capture and detection, ELISA can be of four types: direct, indirect, sandwich, and competitive.
For direct ELISA, the target antigen is first bound to the plate, and is then detected by a specific detection antibody. This method is commonly used for screening antibodies for a specific antigen. Indirect ELISA is used for detecting antibodies in a sample in order to quantify immune responses. The plate is first coated with a specific capture antigen, which immobilizes the target antibody, and this antigen-antibody complex is then detected using a second antibody.
In the case of sandwich ELISA, the target analyte is an antigen, which is captured on the plate using a capture antibody and then detected by the detection antibody, hence forming an antibody-antigen-antibody sandwich. This method is useful for measuring the concentration of an antigen in a mixed sample.
Competitive ELISA is used when only one antibody is available for a target antigen of interest. The plate is first coated with the purified antigen. Meanwhile, the sample containing the antigen is pre-incubated with the antibody and then added to the plate, to allow any free antibody molecules to bind to the immobilized antigen. The higher the signal from the plate, the lower the antigen concentration in the sample. In all of the four types of ELISA, direct, indirect, sandwich, and competitive, the detection antibody is either directly conjugated to the enzyme or can be indirectly linked to it through another antibody or protein.
The enzymes commonly used for the reaction are horseradish peroxidase or alkaline phosphatase with their respective substrates, both producing a soluble, colored product that can be measured and quantified using a plate reader. In this video, you will observe how to perform indirect ELISA, sandwich ELISA, and competitive ELISA, followed by examples of quantification of the target analyte from the indirect and sandwich ELISA methods.
The first experiment will demonstrate how to use indirect ELISA to determine the presence of anti-influenza virus antibodies in serum obtained from influenza-infected mice.
To begin, add 50 microliters of purified antigen – in this case, 2 milligrams per milliliter of purified A/PR/8 Influenza A virus- to each well of a 96-well ELISA plate. Next, cover the plate with an adhesive cover and incubate it overnight at 4 degrees celsius to allow the antigen to bind to the plate. The following day, remove the coating solution by flicking the plate over a sink. Next, block the remaining protein-binding sites in the coated wells by adding 200 microliters of a blocking buffer- here, 5% donkey serum in 1X PBS- to each well. Leave the plate to incubate for at least 2 hours at room temperature. Following the incubation, remove the blocking buffer and then wash the plate by adding 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Flick the plate over the sink once more to remove the wash.
Then, prepare the test samples by adding 460 microliters of PBS to a fresh tube, and then adding 40 microliters of serum to make a 1 to 12.5 dilution. Then, add 300 microliters of PBS to a second tube, and then add 100 microliters of the first dilution. Continue this serial dilution range until obtaining a final sample with a dilution of 1 to 204,800. Add the serially diluted serum samples in triplicate to the wells. Cover the plate with an adhesive cover and incubate at room temperature for an hour. Next, remove the samples by flicking the plate into the sink and then wash the plate by adding 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Once again, flick the plate to remove the wash.
Now, add 100 microliters of an enzyme-conjugated secondary antibody, which in this experiment is a horseradish peroxidase, or HRP, conjugated donkey anti-mouse secondary, to each well. Incubate the plate for one hour at room temperature, and flick the plate to remove any excess liquid. Wash the plate with 1X PBS containing 1% Tween-20 and then apply 100 microliters of the indicator substrate at a concentration of one milligram per milliliter to each well. Incubate the plate with the substrate for 5 to 10 minutes at room temperature. In this example, the colorless 3,3′, 5,5′ – tetramethylbenzidine, or TMB, substrate turns a blue color when HRP is present. After 10 minutes, stop the enzymatic reaction by adding 100 microliters of 2N sulfuric acid. The samples will turn a yellow color.
Within 30 minutes of adding the stop solution, insert the plate into a microplate reader and read the plate at the appropriate wavelength for the substrate to determine the absorbance of the wells.
To begin the sandwich ELISA, the plate must be coated with purified capture antibody. To do this, add 100 microliters of the capture antibody at a concentration within the 1-10 microgram per milliliter range, to each well of a 96-well ELISA plate. Next, cover the plate with an adhesive plate cover and then incubate the plate overnight at 4 degrees celsius. After the incubation, remove the coating solution by flicking the plate over a sink.
Now, block the remaining protein- binding sites in the coated wells by adding 200 microliters of 5% nonfat dry milk to the wells. Incubate the plate at room temperature for at least 2 hours. Next, remove the blocking buffer, and then wash the wells with 1X PBS containing 1% Tween-20. Remove the wash by flicking the plate over the sink. Now, add 100 microliters of the test sample to the wells, seal the plate with an adhesive cover, and then incubate it at room temperature for 2 hours. After incubation, remove the samples by flicking the plate over the sink and then wash the wells with 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Flick the plate over the sink to remove the wash and then add 100 microliters of enzyme-conjugated detection antibody to the wells.
Seal the plate with an adhesive cover. Leave the plate to incubate at room temperature for 2 hours. After the incubation, remove the unbound detection antibody by flicking the plate over a sink and wash the wells with 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Next, add 100 microliters of the indicator substrate at a concentration of 1 milligram per milliliter, and incubate the plate for 5 to 10 minutes at room temperature. After 10 minutes, stop the enzymatic reaction by adding 100 microliters of 2N sulfuric acid to the wells and then read the plate within 30 minutes of adding the stop solution in a microplate reader.
To perform a competitive ELISA, first coat the wells of a 96-well ELISA plate with 100 microliters of purified antigen at a concentration of 1-10 micrograms per milliliter. Cover the plate with an adhesive plate cover and then incubate overnight at 4 degrees celsius. Following this, remove the unbound antigen solution from the wells by flicking the plate over a sink.
Next, block the remaining protein-binding sites in the coated wells by adding 200 microliters of blocking buffer to each well- here, 5% nonfat dry milk in PBS. Incubate the plate for at least 2 hours at room temperature. While blocking the wells, prepare the antigen-antibody mixture in a 1. 5 milliliter tube by adding 150 microliters of sample antigen to 150 microliters of primary antibody for each well in the assay. Incubate this mixture for 1 hour at 37 degrees celsius. Now, remove the blocking buffer from the wells by flicking the plate over a sink. Then, wash the wells with 1X PBS containing Tween 20 and then add 100 microliters of the sample antigen- primary antibody mixture.
Leave the plate to incubate at 37 degrees celsius for one hour. Next, remove the sample mixture by flicking the plate over a sink and then wash the wells with 1X PBS containing 1% Tween-20 to remove any unbound antibody. Add 100 microliters of an enzyme-conjugated secondary antibody to each well and incubate the plate for one hour at 37 degrees celsius. Following this, wash the plate with 1X PBS containing 1% Tween-20 and then add 100 microliters of the substrate solution to each well. Wait for 5-10 minutes. After 10 minutes, stop the enzymatic reaction by adding 100 microliters of 2N sulfuric acid and then measure the absorbance in a microplate reader within 30 minutes of adding the stop solution.
For the semi-quantitative indirect ELISA assay, the presence of influenza A virus antibodies in serially diluted samples of serum from influenza A- infected mice was determined by reading the absorbance of each well at 405 nanometers in a plate reader. This raw data is exported to a spread sheet for calculation purposes. In this experiment, the serially diluted serum samples, which range from 1 – 12.5, to 1 – 204,800, were repeated in triplicate.
To analyze the data, the mean absorbance value is therefore calculated for each set of triplicates by adding all the values for each dilution and dividing the sum by 3. Once the mean for each set of triplicates is determined, the mean OD450 readings are plotted against the serial dilutions. The OD readings decrease as the serum is diluted, indicating that less antibodies are found in the more diluted samples. In the quantitative sandwich ELISA, dilutions of known standard, in this case recombinate Human TNFalpha, were added to a 96-well plate and read along with the unknown samples.
To create the standard curve, the mean absorbance value for each set of readings of the known concentrations was calculated. Then, the mean absorbance value was plotted on the y-axis, against the known protein concentrations on the x-axis. A best fit curve is added through the points in the graph.
Once the standard curve is generated, the amount of TNFalpha protein in the test sample can be determined by first calculating the mean absorbance value for the test sample. In this example, the test samples gave OD450 readings of 0.636 and 0. 681. Adding these values and dividing the sum by 2 gives an average of 0.659. From the y-axis on the standard curve graph, extend a horizontal line from this absorbance value to the standard curve. At the point of intersection, extend a vertical line to the x-axis and read the corresponding concentration which, in this test sample, corresponds to a TNFalpha concentration of 38.72 picograms per milliliter.
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