ELISA-Test: Indirekt, Sandwich und kompetitiv

1. Indirekter ELISA

Ein indirekter ELISA ist einer, bei dem der primäre antigenspezifische Antikörper von einem sekundären konjugierten Antikörper erkannt wird. Das folgende Protokoll ist ein Beispiel für eine indirekte ELISA-Methode, bei der die Serumproben von Mit infizierten Mäusen des Influenza-A-Virus (IAV) auf das Vorhandensein von IAV-spezifischen IgG-Antikörpern getestet werden. Eine Stärke dieses Beispiels besteht darin, dass verschiedene sekundäre Antikörper verwendet werden können, die alle Antikörper-Isotypen oder bestimmte Isotypen (z. B. IgG) erkennen.

Beschichtungsantigen auf die Mikroplatte

1. Beschichten Sie die Bohrungen einer 96-Well-ELISA-Platte mit gereinigtem Antigen, indem Sie 50 l gereinigtes Antigen (2 mg/ml gereinigtes A/PR/8 Influenza-A-Virus im 0,05M Tris-HCl-Puffer (pH 9,5)) in jeden Bohrgut der Platte einleiten.
2. Bedecken Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4°C, damit sich das Antigen an die Platte bindet.
3. Entfernen Sie nach der Inkubationsvervollständigung die Beschichtungslösung, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben.

Blockieren

4. Blockieren Sie die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den beschichteten Brunnen durch Zugabe von 200 l Sperrpuffer, 5% Eselserum in 1X PBS wird hier pro Brunnen verwendet. Alternative Blockierreagenzien sind 5 % fettfreie Trockenmilch oder BSA in PBS oder normales Serum von einem Tier, bei dem der sekundäre Antikörper erzeugt wurde.
5. Mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubieren.
6. Entfernen Sie nach der Inkubation den Sperrpuffer, indem Sie die Platte flicken, und waschen Sie dann die Platte mit PBS, die 1% Tween-20 enthält.

Inkubation mit dem primären Antikörper

7. Bereiten Sie eine serielle Verdünnung der Serumprobe vor, die den primären Antikörper enthält, um einen Verdünnungsbereich von 1 bis 204.800 zu erhalten, indem Sie 1X PBS verwenden. Dazu verdünnen Sie zuerst das Serum 1:12,5 und führen Sie dann eine 4X Verdünnung (Verdünnungsbereich - 1:12,5 bis 1:204,800) durch.
8. Fügen Sie 100 l der seriell verdünnten Serumproben in die Brunnen.
9. Abdeckplatte mit Klebeabdeckung und inkubieren bei Raumtemperatur für 1-2 h.
10. Nach der Inkubation die Platte über ein Waschbecken und eine Waschplatte mit PBS mit 1% Tween-20 streichen.

Inkubation mit dem sekundären Antikörper

11. Fügen Sie in diesem Experiment 100 L eines enzymkonjugierten Sekundärantikörpers, Der Meerrettichperoxidase, der HRP-konjugierten Esel-Anti-Maus-Sekundärinstand in diesem Experiment, zu jedem Brunnen hinzu.
12. Inkubieren Sie die Platte für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
13. Nach der Inkubation die Platte über ein Waschbecken ziehen und dann die Platte mit PBS mit 1% Tween-20 waschen.

entdeckung

14. Fügen Sie 100 l des Indikatorsubstrats (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)) in einer Konzentration von 1 mg/ml zu jedem Brunnen hinzu.
15. Inkubieren Sie die Platte mit dem Substrat für 5-10 min bei Raumtemperatur.
16. Nach 10 min stoppen Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 100 l 2N Schwefelsäure (H₂SO₄) hinzufügen.
    Innerhalb von 30 min nach Zugabe der Stop-Lösung, lesen Sie die Platte mit einem Mikroplattenleser bei 405 nm, um die Absorption der Brunnen zu bestimmen.

2. Sandwich ELISA

In dieser ELISA-Version wird die Versuchsprobe zwischen einem unkonjugierten Capture-Antikörper und einem konjugierten Detektionsantikörper "sandwichiert", die beide spezifisch für dasselbe Protein, aber an unterschiedlichen Epitopen sind. Im folgenden Sandwich-ELISA-Beispiel wurde die Konzentration von humanem TNF in unbekannter Probe anhand einer Standardkurve ermittelt, die aus der 2,5-fachen seriellen Verdünnung eines bekannten, rekombinanten menschlichen TNFs (mit einer Konzentration von 75 pg/ml) erzeugt wurde.

Beschichtungs-Capture-Antikörper an die Mikroplatte

1. Beschichten Sie die Bohrungen einer 96-Well-ELISA-Platte mit gereinigtem Capture-Antikörper, indem Sie jedem Bohrkörper der Platte 100 l Aufnahmeantikörper (1-10 g/ml-Bereich) hinzufügen.
2. Deckplatte mit Klebeplattenabdeckung abdecken und bei 4°C über Nacht bebrüten.
3. Nach der Inkubation entfernen Sie die Beschichtungslösung von der Platte, indem Sie die Platte über ein Waschbecken flicken.

Blockieren

4. Blockieren Sie die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den Antikörper-beschichteten Brunnen, indem Sie den Brunnen eine Blockierlösung von 200 l, 5 % fettfreie Trockenmilch, die PBS enthält, hinzufügen.
5. Mindestens 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubieren.
6. Entfernen Sie nach der Inkubation den Sperrpuffer, indem Sie die Platte flicken, und waschen Sie dann die Platte mit PBS, die 1% Tween-20 enthält.

Hinzufügen von Antigen-haltigen Testproben

7. Fügen Sie 100 l der Testprobe zu den Bohrungen hinzu. Versiegeln Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung.
8. 1-2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubieren.
9. Nach der Inkubation entfernen Sie die Proben, indem Sie die Platte über das Waschbecken streichen, und waschen Sie dann die Brunnen mit 200 l 1X PBS, die 1% Tween-20 enthalten.

Enzymkonjugierte Detektionsantikörper hinzufügen

10. Fügen Sie 100 L enzymkonjugierten Detektionsantikörper in einer voroptimierten Konzentration in die Brunnen ein.
11. Versiegeln Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung und brüten Bei Raumtemperatur für 2 h.
12. Entfernen Sie den ungebundenen Detektionsantikörper, indem Sie die Platte über ein Waschbecken streichen, und waschen Sie die Brunnen mit 200 l 1X PBS, die 1% Tween-20 enthalten.

entdeckung

13. Fügen Sie 100 l des Indikatorsubstrats bei einer Konzentration von 1 mg/ml hinzu. Jeder gebundene enzymkonjugierte Detektionsantikörper wandelt das Substrat in ein nachweisbares Signal um.
14. Inkubieren Sie die Platte für 5-10 min bei Raumtemperatur.
15. Beenden Sie nach 5-10 min die enzymatische Reaktion, indem Sie den Brunnen 100 l 2N H₂SO₄ hinzufügen. Innerhalb von 30 min nach Zugabe der Stop-Lösung, lesen Sie die Platte mit einem Mikroplattenleser, um die Absorption der Brunnen zu bestimmen.

3. Wettbewerbsfähiger ELISA

Die Schritte eines wettbewerbsfähigen ELISA unterscheiden sich von denen, die in indirekt und Sandwich-ELISA verwendet werden, wobei der Hauptunterschied der wettbewerbsfähige Bindungsschritt zwischen dem Probenantigen und dem "Add-in"-Antigen ist. Das Probenantigen wird mit dem nicht beschrifteten Primärantikörper inkubiert. Diese Antikörper-Antigen-Komplexe werden dann der ELISA-Platte zugesetzt, die mit dem gleichen Antigen vorbeschichtet wurde. Nach einer Inkubationszeit wird jeder ungebundene Antikörper weggespült. Es besteht eine umgekehrte Korrelation zwischen der Menge an freiem Antikörper, die zur Bindung des Antigens im Brunnen zur Verfügung steht, und der Menge an Antigen in der ursprünglichen Probe. Zum Beispiel würde eine Probe mit reichlich Antigen mehr Antigen-Primär-Antikörper-Komplexe haben, so dass wenig ungebundener Antikörper an die ELISA-Platte zu binden. Anschließend wird den Brunnen ein enzymkonjugierter Sekundärantikörper zugesetzt, gefolgt vom Substrat.

Beschichtungsantigen auf die Mikroplatte

1. Beschichten Sie die Bohrungen einer 96-Well-ELISA-Platte mit 100 l gereinigtem Antigen in einer Konzentration von 1-10 g/ml.
2. Deckplatte mit Klebeplattenabdeckung abdecken und über Nacht bei 4°C bebrüten.
3. Entfernen Sie nach der Inkubation die ungebundene Antigenlösung aus den Brunnen, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben.

Blockieren

4. Blockieren Sie die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den beschichteten Brunnen, indem Sie jedem Bohrgut 200 L Sperrpuffer hinzufügen, der entweder 5 % fettfreie Trockenmilch oder BSA in PBS sein kann.
5. Inkubieren Sie die Platte für mindestens 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C.

Inkubationsprobe (Antigen) mit dem primären Antikörper

6. Während der Blockierung der Brunnen, bereiten Sie die Antigen-Antikörper-Mischung durch Mischen 150 l Probe Antigen und 150 l primären Antikörper für jeden Brunnen in den Test.
7. Inkubieren Sie diese Mischung für 1 h bei 37°C.

Antigen-Antikörper-Mischung in den Brunnen geben

8. Entfernen Sie nun den Sperrpuffer aus den Brunnen, indem Sie die Platte über eine Spüle schieben.
9. Dann waschen Sie die Brunnen mit 1X PBS enthalten Tween-20.
10. Fügen Sie 100 l der Probe Antigen-Primär-Antikörper-Mischung.
11. Inkubieren Sie die Platte bei 37°C für 1 h.
12. Entfernen Sie die Probenmischung, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben.
13. Waschen Sie dann die Brunnen mit 1X PBS, die 1% Tween-20 enthalten, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen.

Hinzufügen des sekundären Antikörpers

14. Fügen Sie jedem Brunnen 100 l eines enzymkonjugierten Sekundärantikörpers, der in diesem Fall AP-konjugierter Antikörper ist, hinzu.
15. Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei 37°C.
16. Waschen Sie die Platte nach der Inkubation mit 1X PBS, die 1% Tween-20 enthält.

entdeckung

17. Fügen Sie jedem Brunnen 100 l der Substratlösung hinzu.
18. Warten Sie auf 5-10 min.
19. Nach 10 min beenden Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie den Brunnen 100 l 2N Schwefelsäure zusetzen. Messen Sie dann die Absorption in einem Mikroplattenleser innerhalb von 30 min nach Zugabe der Stop-Lösung