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Quelle: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3, und Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
2 Zentrum für Immunologie, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
3 Mikrobiologie, Immunologie und Krebsbiologie Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
4 Freimaurerkrebszentrum, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Enzymgebundener Immunsorbent-Assay (ELISA) wird häufig verwendet, um das Vorhandensein und/oder die Konzentration eines Antigens, Antikörpers, Peptids, Proteins, Hormons oder eines anderen Biomoleküls in einer biologischen Probe zu messen. Es ist extrem empfindlich, in der Lage, niedrige Antigenkonzentrationen zu erkennen. Die Empfindlichkeit von ELISA wird auf seine Fähigkeit zurückgeführt, die Wechselwirkungen zwischen einem einzelnen Antigen-Antikörper-Komplex zu erkennen (1). Darüber hinaus ermöglicht die Aufnahme eines enzymkonjugierten antigenspezifischen Antikörpers die Umwandlung eines farblosen Substrats in ein chromogenes oder fluoreszierendes Produkt, das von einem Plattenleser erkannt und leicht quantisiert werden kann. Im Vergleich zu den Werten, die durch titrated Mengen eines bekannten Antigens von Interesse erzeugt werden, kann die Konzentration des gleichen Antigens in den experimentellen Proben bestimmt werden. Verschiedene ELISA-Protokolle wurden angepasst, um Antigenkonzentrationen in einer Vielzahl von Versuchsproben zu messen, aber sie alle haben das gleiche Grundkonzept (2). Die Wahl des Typs von ELISA, der indirekt, Sandwich oder wettbewerbsfähig ist, hängt von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich der Komplexität der zu testenden Proben und der antigenspezifischen Antikörper, die zur Verwendung zur Verfügung stehen. Der indirekte ELISA wird häufig verwendet, um das Ergebnis einer immunologischen Reaktion zu bestimmen, wie z. B. die Messung der Konzentration eines Antikörpers in einer Probe. Der Sandwich-ELISA eignet sich am besten zur Analyse komplexer Proben, wie Gewebekulturüberstand oder Gewebelysate, bei denen der Analyt oder Antigen von Interesse Teil einer gemischten Probe ist. Schließlich wird der wettbewerbsfähige ELISA am häufigsten verwendet, wenn nur ein Antikörper zur Verfügung steht, um das Antigen von Interesse zu erkennen. Wettbewerbsfähige ELISAs sind auch nützlich, um ein kleines Antigen mit nur einem einzigen Antikörper-Epitop zu erkennen, das aufgrund von sterischer Behinderung zwei verschiedene Antikörper nicht aufnehmen kann. Das Protokoll wird die grundlegenden Verfahren für die indirekten, Sandwich- und wettbewerbsfähigen ELISA-Assays beschreiben.
Der indirekte ELISA-Assay wird häufig verwendet, um die Menge an Antikörpern im Serum oder im Überstand einer Hybridomkultur zu messen. Das allgemeine Verfahren für den indirekten ELISA-Test ist:
Der Sandwich-ELISA-Assay unterscheidet sich vom indirekten ELISA-Assay dadurch, dass das Verfahren keine Beschichtung der Platten mit einem gereinigten Antigen beinhaltet. Stattdessen wird ein "Capture"-Antikörper verwendet, um die Brunnen der Platte zu beschichten. Das Antigen wird zwischen dem Capture-Antikörper und einem zweiten "detektions"-Enzymkonjugatierten Antikörper "sandwiched" - wobei beide Antikörper spezifisch für das gleiche Antigen sind, jedoch an unterschiedlichen Epitopen (3). Durch Bindung an den Capture-Antikörper/Antigen-Komplex verbleibt der Detektionsantikörper in der Platte. Als Aufnahme- und Nachweisantikörper können entweder monoklonale Antikörper oder polyklonale Antisera verwendet werden. Der Hauptvorteil des Sandwich-ELISA besteht darin, dass die Probe nicht vor der Analyse gereinigt werden muss. Darüber hinaus kann der Test sehr empfindlich sein (4). Viele handelsübliche ELISA-Kits sind von der Sandwich-Vielfalt und verwenden getestete, abgestimmte Paare von Antikörpern. Das allgemeine Verfahren für den Sandwich ELISA Assay ist:
Die meisten handelsüblichen Sandwich-ELISA-Kits sind mit enzymkonjugierten Nachweisantikörpern ausgestattet. In Fällen, in denen kein enzymkonjugierter Detektionsantikörper verfügbar ist, kann ein sekundärer enzymkonjugierter Antikörper verwendet werden, der speziell für den Nachweisantikörper ist. Das Enzym auf dem sekundären Antikörper erfüllt die gleiche Rolle, d.h. das farblose Substrat in ein chromogenes oder fluoreszierendes Produkt umzuwandeln. Der oben erwähnte sekundäre enzymkonjugierte Antikörper würde eher in einem "hausgemachten" Sandwich-ELISA verwendet werden, das von einem Forscher entwickelt wurde, der beispielsweise eigene monoklonale Antikörper erzeugt hat. Ein Nachteil bei der Verwendung eines sekundären enzymkonjugierten Antikörpers besteht darin, sicher zu sein, dass er nur an den Nachweisantikörper bindet und nicht an den an die Platte gebundenen Capture-Antikörper. Dies würde zu einem messbaren Produkt in allen Brunnen führen, unabhängig vom Vorhandensein oder Fehlen von Antigen oder Detektionsantikörper.
Schließlich wird der wettbewerbsfähige ELISA-Test verwendet, um lösliche Antigene zu erkennen. Es ist einfach durchzuführen, aber es ist nur geeignet, wenn das gereinigte Antigen in einer relativ großen Menge verfügbar ist. Das allgemeine Verfahren für den wettbewerbsfähigen ELISA-Test ist:
Der "Wettbewerb" in diesem Test kommt aus der Tatsache, dass mehr Antigen in der Testprobe in Schritt 3 verwendet wird in weniger Antikörper zur Verfügung, um an die Antigenbeschichtung des Brunnens zu binden führen. Somit hängt die Intensität des chromogenen/fluorogenen Produkts im Brunnen am Ende des Tests umgekehrt mit der in der Testprobe vorhandenen Antigenmenge zusammen.
Eine Schlüsselkomponente in jeder Art von ELISA sind die titrierten Standards bekannter Konzentrationen, die es dem Benutzer ermöglichen, die antigenische Konzentration in den Testproben zu bestimmen. Typischerweise sind eine Reihe von Brunnen für die Erstellung einer Standardkurve vorgesehen, bei der bekannte Mengen eines gereinigten rekombinanten Proteins in abnehmenden Mengen zu den Brunnen hinzugefügt werden. Wenn diese Brunnen gleichzeitig mit den Testproben verarbeitet werden, kann der Anwender einen Referenzsatz von Absorptionswerten erhalten, die von einem Mikroplattenleser für bekannte Proteinkonzentrationen erhalten werden, um mit den Absorptionswerten für die Testproben zu gehen. Der Anwender kann dann eine Standardkurve berechnen, mit der die Testproben verglichen werden können, um die Menge des vorhandenen Proteins zu bestimmen. Die Standardkurve kann auch den Grad der Präzision der Verdünnungsherstellung des Benutzers bestimmen.
Schließlich erfordert der letzte Schritt in jedem der oben aufgeführten ELISA-Typen die Zugabe eines Substrats. Der Grad der Umwandlung des Substrats in das Produkt steht in direktem Zusammenhang mit der Menge des Enzyms, das im Brunnen vorhanden ist. Meerrettichperoxidase (HRP) und alkalische Phosphatase (AP) sind die häufigsten Enzyme, die konjugiert mit Antikörpern gefunden werden. Wie erwartet, gibt es eine Reihe von Substraten, die spezifisch für Enzyme verfügbar sind, die ein chromogenes oder fluoreszierendes Produkt produzieren. Darüber hinaus sind Substrate in einer Reihe von Empfindlichkeiten erhältlich, die die Gesamtempfindlichkeit des Assays erhöhen können. Der Anwender muss auch die Art der Instrumentierung berücksichtigen, die für das Ablesen der Platte am Ende des Experiments zur Verfügung steht, wenn er den zu verwendenden Substrattyp sowie den entsprechenden enzymkonjugierten Antikörper wählt.
Häufig verwendete chromogene Substrate für HRP umfassen 2,2'-Azinobis [3-Ethylbenzothiazolin-6-Sulfonsäure]-Diammoniumsalz (ABTS) und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), während p-Nitrophenylphosphat (PNPP) für AP verwendet wird. ABTS und TMB wasserlösliche grüne bzw. blau gefärbte Reaktionsprodukte herstellen. Das grüne ABTS-Produkt hat zwei Hauptabsorptionsspitzen, 410 und 650 nm, während das blaue TMB-Produkt am besten bei 370 und 652 nm nachgewiesen wird. Die Farben von ABTS und TMB ändern sich nach Zugabe einer sauren Stop-Lösung in Gelb, die am besten bei 450 nm gelesen wird. Die Farbentwicklung für ABTS ist langsam, während sie für TMB schnell ist. TMB ist empfindlicher als ABTS und kann ein höheres Hintergrundsignal erzeugen, wenn die enzymatische Reaktion zu lange dauert. PNPP produziert ein gelbes wasserlösliches Produkt nach DER AP-Umwandlung, das Licht bei 405 nm absorbiert.
1. Indirekter ELISA
Ein indirekter ELISA ist einer, bei dem der primäre antigenspezifische Antikörper von einem sekundären konjugierten Antikörper erkannt wird. Das folgende Protokoll ist ein Beispiel für eine indirekte ELISA-Methode, bei der die Serumproben von Mit infizierten Mäusen des Influenza-A-Virus (IAV) auf das Vorhandensein von IAV-spezifischen IgG-Antikörpern getestet werden. Eine Stärke dieses Beispiels besteht darin, dass verschiedene sekundäre Antikörper verwendet werden können, die alle Antikörper-Isotypen oder bestimmte Isotypen (z. B. IgG) erkennen.
Beschichtungsantigen auf die Mikroplatte
Blockieren
Inkubation mit dem primären Antikörper
Inkubation mit dem sekundären Antikörper
entdeckung
2. Sandwich ELISA
In dieser ELISA-Version wird die Versuchsprobe zwischen einem unkonjugierten Capture-Antikörper und einem konjugierten Detektionsantikörper "sandwichiert", die beide spezifisch für dasselbe Protein, aber an unterschiedlichen Epitopen sind. Im folgenden Sandwich-ELISA-Beispiel wurde die Konzentration von humanem TNF in unbekannter Probe anhand einer Standardkurve ermittelt, die aus der 2,5-fachen seriellen Verdünnung eines bekannten, rekombinanten menschlichen TNFs (mit einer Konzentration von 75 pg/ml) erzeugt wurde.
Beschichtungs-Capture-Antikörper an die Mikroplatte
Blockieren
Hinzufügen von Antigen-haltigen Testproben
Enzymkonjugierte Detektionsantikörper hinzufügen
entdeckung
3. Wettbewerbsfähiger ELISA
Die Schritte eines wettbewerbsfähigen ELISA unterscheiden sich von denen, die in indirekt und Sandwich-ELISA verwendet werden, wobei der Hauptunterschied der wettbewerbsfähige Bindungsschritt zwischen dem Probenantigen und dem "Add-in"-Antigen ist. Das Probenantigen wird mit dem nicht beschrifteten Primärantikörper inkubiert. Diese Antikörper-Antigen-Komplexe werden dann der ELISA-Platte zugesetzt, die mit dem gleichen Antigen vorbeschichtet wurde. Nach einer Inkubationszeit wird jeder ungebundene Antikörper weggespült. Es besteht eine umgekehrte Korrelation zwischen der Menge an freiem Antikörper, die zur Bindung des Antigens im Brunnen zur Verfügung steht, und der Menge an Antigen in der ursprünglichen Probe. Zum Beispiel würde eine Probe mit reichlich Antigen mehr Antigen-Primär-Antikörper-Komplexe haben, so dass wenig ungebundener Antikörper an die ELISA-Platte zu binden. Anschließend wird den Brunnen ein enzymkonjugierter Sekundärantikörper zugesetzt, gefolgt vom Substrat.
Beschichtungsantigen auf die Mikroplatte
Blockieren
Inkubationsprobe (Antigen) mit dem primären Antikörper
Antigen-Antikörper-Mischung in den Brunnen geben
Hinzufügen des sekundären Antikörpers
entdeckung
Enzymgebundener Immunosorbent Assay oder ELISA ist ein hochempfindlicher quantitativer Test, der häufig verwendet wird, um die Konzentration eines Analyten wie Zytokine und Antikörper in einer biologischen Probe zu messen. Das allgemeine Prinzip dieses Assays umfasst drei Schritte: beginnend mit der Erfassung oder Immobilisierung des Zielanalyten auf einer Mikroplatte, gefolgt vom Nachweis des Analyten durch zielspezifische Detektionsproteine und schließlich der Enzymreaktion, bei der ein konjugiertes Enzym wandelt sein Substrat in ein farbiges Produkt um. Basierend auf verschiedenen Methoden der Erfassung und Detektion kann ELISA von vier Typen sein: direkt, indirekt, Sandwich und wettbewerbsfähig.
Bei direktem ELISA wird das Zielantigen zunächst an die Platte gebunden und dann durch einen bestimmten Detektionsantikörper nachgewiesen. Diese Methode wird häufig zum Screening von Antikörpern für ein bestimmtes Antigen verwendet. Indirekter ELISA wird zum Nachweis von Antikörpern in einer Probe verwendet, um Immunantworten zu quantifizieren. Die Platte wird zunächst mit einem spezifischen Aufnahmeantigen beschichtet, das den Zielantikörper immobilisiert, und dieser Antigen-Antikörper-Komplex wird dann mit einem zweiten Antikörper nachgewiesen.
Bei Sandwich-ELISA ist das Zielanalyt ein Antigen, das mit einem Capture-Antikörper auf der Platte aufgenommen und dann vom Detektionsantikörper erfasst wird und somit ein Antikörper-Antigen-Antikörper-Sandwich bildet. Diese Methode ist nützlich, um die Konzentration eines Antigens in einer gemischten Probe zu messen.
Competitive ELISA wird verwendet, wenn nur ein Antikörper für ein Zielantidem von Interesse verfügbar ist. Die Platte wird zuerst mit dem gereinigten Antigen beschichtet. In der Zwischenzeit wird die Probe, die das Antigen enthält, mit dem Antikörper vorinkubiert und dann der Platte zugesetzt, damit freie Antikörpermoleküle an das immobilisierte Antigen binden können. Je höher das Signal von der Platte, desto niedriger ist die Antigenkonzentration in der Probe. Bei allen vier Arten von ELISA, direkt, indirekt, Sandwich und wettbewerbsfähig, wird der Nachweisantikörper entweder direkt mit dem Enzym konjugiert oder kann indirekt durch einen anderen Antikörper oder ein anderes Protein mit ihm in Verbindung gebracht werden.
Die für die Reaktion gebräuchlichen Enzyme sind Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase mit ihren jeweiligen Substraten, die beide ein lösliches, farbiges Produkt produzieren, das mit einem Plattenleser gemessen und quantifiziert werden kann. In diesem Video werden Sie beobachten, wie indirekte ELISA, Sandwich-ELISA und wettbewerbsfähiger ELISA ausgeführt werden, gefolgt von Beispielen für die Quantifizierung des Zielanalyten aus den indirekten und Sandwich-ELISA-Methoden.
Das erste Experiment wird zeigen, wie indirektes ELISA verwendet wird, um das Vorhandensein von Anti-Influenza-Virus-Antikörpern in Serum zu bestimmen, die von influenzainfizierten Mäusen gewonnen werden.
Zunächst 50 Mikroliter gereinigtes Antigen - in diesem Fall 2 Milligramm pro Milliliter gereinigtes A/PR/8 Influenza-A-Virus - zu jedem Brunnen einer 96-Well-ELISA-Platte hinzufügen. Als nächstes bedecken Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius, damit sich das Antigen an die Platte bindet. Entfernen Sie am nächsten Tag die Beschichtungslösung, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben. Als nächstes blockieren Sie die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den beschichteten Brunnen, indem Sie 200 Mikroliter eines Sperrpuffers - hier 5% Eselserum in 1X PBS- zu jedem Brunnen hinzufügen. Lassen Sie die Platte mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation den Sperrpuffer und waschen Sie die Platte, indem Sie 200 Mikroliter 1X PBS hinzufügen, die 1% Tween-20 enthalten. Streichen Sie die Platte noch einmal über das Waschbecken, um die Wäsche zu entfernen.
Bereiten Sie dann die Testproben vor, indem Sie 460 Mikroliter PBS in ein frisches Rohr geben und dann 40 Mikroliter Serum hinzufügen, um eine Verdünnung von 1 bis 12,5 zu erzielen. Dann fügen Sie 300 Mikroliter PBS zu einem zweiten Rohr hinzu, und fügen Sie dann 100 Mikroliter der ersten Verdünnung hinzu. Setzen Sie diesen seriellen Verdünnungsbereich fort, bis sie eine endgültige Probe mit einer Verdünnung von 1 bis 204.800 erhalten. Fügen Sie die seriell verdünnten Serumproben in dreifacher Auslage zu den Brunnen hinzu. Bedecken Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung und brüten Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Als nächstes entfernen Sie die Proben, indem Sie die Platte in die Spüle streichen und dann die Platte waschen, indem Sie 200 Mikroliter 1X PBS hinzufügen, die 1% Tween-20 enthalten. Streichen Sie erneut die Platte, um die Wäsche zu entfernen.
Fügen Sie nun 100 Mikroliter eines enzymkonjugierten Sekundärantikörpers hinzu, der in diesem Experiment eine Meerrettichperoxidase oder HRP, konjugierte Esel-Anti-Maus-Sekundär, zu jedem Brunnen ist. Inkubieren Sie die Platte für eine Stunde bei Raumtemperatur, und flicken Sie die Platte, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Waschen Sie die Platte mit 1X PBS mit 1% Tween-20 und wenden Sie dann 100 Mikroliter des Indikatorsubstrats mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter auf jeden Brunnen auf. Inkubieren Sie die Platte mit dem Substrat für 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur. In diesem Beispiel wird das farblose Substrat 3,3', 5,5' - Tetramethylbenzidin oder TMB, Substrat, eine blaue Farbe, wenn HRP vorhanden ist. Nach 10 Minuten die enzymatische Reaktion beenden, indem Sie 100 Mikroliter 2N Schwefelsäure hinzufügen. Die Proben werden eine gelbe Farbe.
Innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stop-Lösung, legen Sie die Platte in einen Mikroplattenleser und lesen Sie die Platte bei der entsprechenden Wellenlänge für das Substrat, um die Absorption der Brunnen zu bestimmen.
Um mit dem Sandwich-ELISA zu beginnen, muss die Platte mit gereinigtem Capture-Antikörper beschichtet werden. Dazu fügen Sie 100 Mikroliter des Capture-Antikörpers in einer Konzentration im Bereich von 1-10 Mikrogramm pro Milliliter zu jedem Brunnen einer 96-Well-ELISA-Platte hinzu. Als nächstes bedecken Sie die Platte mit einer Klebeplattenabdeckung und bebrüten die Platte dann über Nacht bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation die Beschichtungslösung, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben.
Blockieren Sie nun die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den beschichteten Brunnen, indem Sie 200 Mikroliter 5% fettfreie Trockenmilch in die Brunnen geben. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für mindestens 2 Stunden. Entfernen Sie anschließend den Sperrpuffer, und waschen Sie dann die Brunnen mit 1X PBS, die 1% Tween-20 enthalten. Entfernen Sie die Wäsche, indem Sie die Platte über das Waschbecken streichen. Fügen Sie nun 100 Mikroliter der Probe in die Brunnen, versiegeln Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung und inkubieren Sie sie dann bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Nach der Inkubation entfernen Sie die Proben, indem Sie die Platte über das Waschbecken streichen und dann die Brunnen mit 200 Mikrolitern 1X PBS mit 1% Tween-20 waschen. Streichen Sie die Platte über das Waschbecken, um die Wäsche zu entfernen und fügen Sie dann 100 Mikroliter enzymkonjugierten Detektionsantikörper in die Brunnen.
Versiegeln Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation den ungebundenen Detektionsantikörper, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben und die Brunnen mit 200 Mikrolitern 1X PBS mit 1% Tween-20 waschen. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter des Indikatorsubstrats bei einer Konzentration von 1 Milligramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie die Platte für 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 10 Minuten stoppen Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 100 Mikroliter 2N Schwefelsäure in die Brunnen geben und dann die Platte innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stop-Lösung in einem Mikroplattenleser lesen.
Um einen wettbewerbsfähigen ELISA durchzuführen, beschichten Sie zunächst die Brunnen einer 96-Well-ELISA-Platte mit 100 Mikroliter gereinigtem Antigen in einer Konzentration von 1-10 Mikrogramm pro Milliliter. Bedecken Sie die Platte mit einer Klebeplattenabdeckung und bebrüten Sie dann über Nacht bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie anschließend die ungebundene Antigenlösung aus den Brunnen, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schieben.
Als nächstes blockieren Sie die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den beschichteten Brunnen, indem Sie jedem Brunnen 200 Mikroliter Sperrpuffer hinzufügen- hier 5% fettfreie Trockenmilch in PBS. Inkubieren Sie die Platte für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur. Während der Blockierung der Brunnen, bereiten Sie die Antigen-Antikörper-Mischung in einem 1. 5 Milliliter Tube durch Zugabe von 150 Mikroliter n. Antigen probe zu 150 Mikroliter Primärantikörper für jeden Brunnen im Test. Inkubieren Sie diese Mischung für 1 Stunde bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nun den Sperrpuffer aus den Brunnen, indem Sie die Platte über eine Spüle schieben. Dann waschen Sie die Brunnen mit 1X PBS enthaltenTween 20 und fügen Sie dann 100 Mikroliter der Probe Antigen-Primär-Antikörper-Mischung.
Lassen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für eine Stunde bebrüten. Als nächstes entfernen Sie die Probenmischung, indem Sie die Platte über ein Waschbecken streichen und dann die Brunnen mit 1X PBS mit 1% Tween-20 waschen, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Fügen Sie 100 Mikroliter eines enzymkonjugierten Sekundärantikörpers zu jedem Brunnen hinzu und bebrüten die Platte für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Danach waschen Sie die Platte mit 1X PBS, die 1% Tween-20 enthält, und fügen Sie dann 100 Mikroliter der Substratlösung zu jedem Brunnen hinzu. Warten Sie 5-10 Minuten. Beenden Sie nach 10 Minuten die enzymatische Reaktion, indem Sie 100 Mikroliter 2N Schwefelsäure hinzufügen und messen Sie dann die Absorption in einem Mikroplattenleser innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stop-Lösung.
Für den semiquantitativen indirekten ELISA-Test wurde das Vorhandensein von Influenza-A-Virus-Antikörpern in seriell verdünnten Serumproben von Influenza-A-infizierten Mäusen bestimmt, indem die Absorption jedes Brunnens bei 405 Nanometern in einem Plattenleser gelesen wurde. Diese Rohdaten werden zu Berechnungszwecken in ein Spreadsheet exportiert. In diesem Experiment wurden die seriell verdünnten Serumproben, die von 1 - 12,5 bis 1 - 204.800 reichen, in Dreifacher Ausführung wiederholt.
Um die Daten zu analysieren, wird der mittlere Absorptionswert für jeden Satz von Triplicaten berechnet, indem alle Werte für jede Verdünnung addiert und die Summe durch 3 dividiert wird. Sobald der Mittelwert für jeden Satz von Triplicaten bestimmt ist, werden die mittleren OD450-Messwerte gegen die seriellen Verdünnungen dargestellt. Die OD-Werte nehmen ab, wenn das Serum verdünnt wird, was darauf hindeutet, dass in den verdünnteren Proben weniger Antikörper gefunden werden. Im quantitativen Sandwich-ELISA wurden Verdünnungen bekannter Standards, in diesem Fall rekombinantes Human TNFalpha, einer 96-Well-Platte zugesetzt und zusammen mit den unbekannten Proben gelesen.
Um die Standardkurve zu erstellen, wurde der mittlere Absorptionswert für jeden Satz von Messwerten der bekannten Konzentrationen berechnet. Anschließend wurde der mittlere Absorptionswert auf der y-Achse gegen die bekannten Proteinkonzentrationen auf der x-Achse dargestellt. Eine optimale Anpassungskurve wird durch die Punkte im Diagramm hinzugefügt.
Sobald die Standardkurve erzeugt ist, kann die Menge des TNFalpha-Proteins in der Testprobe durch erste Berechnung des mittleren Absorptionswertes für die Testprobe bestimmt werden. In diesem Beispiel ergaben die Testbeispiele OD450-Werte von 0,636 und 0. 681. Wenn man diese Werte addiert und die Summe durch 2 dividiert, ergibt sich ein Durchschnitt von 0,659. Von der y-Achse im Standardkurvendiagramm eine horizontale Linie von diesem Absorptionswert bis zur Standardkurve ausdehnen. Am Schnittpunkt eine vertikale Linie zur x-Achse ausdehnen und die entsprechende Konzentration ablesen, die in dieser Testprobe einer TNFalpha-Konzentration von 38,72 Piktogrammen pro Milliliter entspricht.
Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ist ein hochempfindlicher quantitativer Assay, der häufig zur Messung der Konzentration eines Analyten wie Zytokine und Antikörper in einer biologischen Probe verwendet wird. Das allgemeine Prinzip dieses Assays umfasst drei Schritte: beginnend mit der Erfassung oder Immobilisierung des Zielanalyten auf einer Mikroplatte, gefolgt von der Detektion des Analyten durch zielspezifische Nachweisproteine und schließlich der Enzymreaktion, bei der ein konjugiertes Enzym sein Substrat in ein farbiges Produkt umwandelt. Basierend auf verschiedenen Erfassungs- und Detektionsmethoden kann es vier Arten von ELISA geben: direkt, indirekt, sandwich und kompetitiv.
Beim direkten ELISA wird das Zielantigen zunächst an die Platte gebunden und dann durch einen spezifischen Nachweisantikörper nachgewiesen. Diese Methode wird häufig zum Screening von Antikörpern auf ein bestimmtes Antigen verwendet. Der indirekte ELISA wird zum Nachweis von Antikörpern in einer Probe verwendet, um Immunantworten zu quantifizieren. Die Platte wird zunächst mit einem spezifischen Fängerantigen beschichtet, das den Zielantikörper immobilisiert, und dieser Antigen-Antikörper-Komplex wird dann mit einem zweiten Antikörper nachgewiesen.
Im Falle des Sandwich-ELISA ist der Zielanalyt ein Antigen, das mit einem Capture-Antikörper auf der Platte eingefangen und dann vom Nachweis-Antikörper detektiert wird, wodurch ein Antikörper-Antigen-Antikörper-Sandwich gebildet wird. Diese Methode ist nützlich, um die Konzentration eines Antigens in einer gemischten Probe zu messen.
Kompetitiver ELISA wird verwendet, wenn nur ein Antikörper für ein Zielantigen von Interesse verfügbar ist. Die Platte wird zunächst mit dem gereinigten Antigen beschichtet. In der Zwischenzeit wird die Probe, die das Antigen enthält, mit dem Antikörper vorinkubiert und dann auf die Platte gegeben, damit alle freien Antikörpermoleküle an das immobilisierte Antigen binden können. Je höher das Signal von der Platte, desto geringer ist die Antigenkonzentration in der Probe. Bei allen vier Arten von ELISA, direkt, indirekt, sandwich und kompetitiv, ist der Nachweisantikörper entweder direkt an das Enzym konjugiert oder kann indirekt über einen anderen Antikörper oder ein anderes Protein an das Enzym gebunden werden.
Die üblicherweise für die Reaktion verwendeten Enzyme sind Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase mit ihren jeweiligen Substraten, die beide ein lösliches, gefärbtes Produkt erzeugen, das mit einem Plattenleser gemessen und quantifiziert werden kann. In diesem Video sehen Sie, wie Sie einen indirekten ELISA, einen Sandwich-ELISA und einen kompetitiven ELISA durchführen, gefolgt von Beispielen für die Quantifizierung des Zielanalyten aus der indirekten und der Sandwich-ELISA-Methode.
Im ersten Experiment wird gezeigt, wie mit indirektem ELISA das Vorhandensein von Anti-Influenzavirus-Antikörpern in Serum von grippeinfizierten Mäusen bestimmt werden kann.
Geben Sie zunächst 50 Mikroliter gereinigtes Antigen - in diesem Fall 2 Milligramm pro Milliliter gereinigtes A/PR/8-Influenza-A-Virus - in jede Vertiefung einer 96-Well-ELISA-Platte. Decken Sie dann die Platte mit einer Klebeabdeckung ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius, damit das Antigen an die Platte binden kann. Entfernen Sie am nächsten Tag die Beschichtungslösung, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schnippen. Blockieren Sie anschließend die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den beschichteten Vertiefungen, indem Sie 200 Mikroliter eines Blockierungspuffers - hier 5% Eselsserum in 1X PBS - in jede Vertiefung geben. Lassen Sie die Platte mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation den Blockierungspuffer und waschen Sie die Platte, indem Sie 200 Mikroliter 1X PBS mit 1% Tween-20 hinzufügen. Schnippen Sie die Platte noch einmal über das Waschbecken, um die Wäsche zu entfernen.
Bereiten Sie dann die Testproben vor, indem Sie 460 Mikroliter PBS in ein frisches Röhrchen geben und dann 40 Mikroliter Serum hinzufügen, um eine Verdünnung von 1 bis 12,5 zu erhalten. Geben Sie dann 300 Mikroliter PBS in ein zweites Röhrchen und fügen Sie dann 100 Mikroliter der ersten Verdünnung hinzu. Dieser serielle Verdünnungsbereich wird fortgesetzt, bis eine endgültige Probe mit einer Verdünnung von 1 bis 204.800 entnommen wird. Geben Sie die seriell verdünnten Serumproben in dreifacher Ausfertigung in die Vertiefungen. Decken Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung ab und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie anschließend die Proben, indem Sie die Platte in das Waschbecken schnippen, und waschen Sie die Platte, indem Sie 200 Mikroliter 1X PBS mit 1% Tween-20 hinzufügen. Schnippen Sie erneut mit der Platte, um die Wäsche zu entfernen.
Geben Sie nun 100 Mikroliter eines enzymkonjugierten Sekundärantikörpers, der in diesem Experiment eine Meerrettichperoxidase oder HRP ist, ein konjugierter Esel-Anti-Maus-Sekundärantikörper, in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur und schnippen Sie die Platte, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Waschen Sie die Platte mit 1X PBS mit 1 % Tween-20 und tragen Sie dann 100 Mikroliter des Indikatorsubstrats in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter auf jede Vertiefung auf. Inkubieren Sie die Platte mit dem Substrat 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur. In diesem Beispiel färbt sich das farblose 3,3'-, 5,5'-Tetramethylbenzidin oder TMB-Substrat blau, wenn HRP vorhanden ist. Stoppen Sie nach 10 Minuten die enzymatische Reaktion, indem Sie 100 Mikroliter 2N-Schwefelsäure hinzufügen. Die Proben färben sich gelb.
Legen Sie die Platte innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stopplösung in einen Mikroplatten-Reader ein und lesen Sie die Platte bei der für das Substrat geeigneten Wellenlänge ab, um die Absorption der Wells zu bestimmen.
Um mit dem Sandwich-ELISA zu beginnen, muss die Platte mit einem gereinigten Capture-Antikörper beschichtet werden. Geben Sie dazu 100 Mikroliter des Capture-Antikörpers in einer Konzentration im Bereich von 1 bis 10 Mikrogramm pro Milliliter in jede Vertiefung einer 96-Well-ELISA-Platte. Decken Sie anschließend die Platte mit einer selbstklebenden Plattenabdeckung ab und inkubieren Sie die Platte dann über Nacht bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation die Beschichtungslösung, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schnippen.
Blockieren Sie nun die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den beschichteten Vertiefungen, indem Sie 200 Mikroliter 5 % fettfreie Trockenmilch in die Vertiefungen geben. Inkubieren Sie die Platte mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur. Entfernen Sie anschließend den Blockierungspuffer und waschen Sie die Vertiefungen mit 1X PBS mit 1 % Tween-20. Entfernen Sie die Wäsche, indem Sie die Platte über das Waschbecken schnippen. Geben Sie nun 100 Mikroliter der Testprobe in die Vertiefungen, verschließen Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung und inkubieren Sie sie dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur. Entnehmen Sie nach der Inkubation die Proben, indem Sie die Platte über das Waschbecken schnippen, und waschen Sie dann die Vertiefungen mit 200 Mikrolitern 1X PBS mit 1 % Tween-20. Schieben Sie die Platte über das Waschbecken, um die Wäsche zu entfernen, und geben Sie dann 100 Mikroliter enzymkonjugierten Nachweisantikörper in die Vertiefungen.
Versiegeln Sie die Platte mit einer Klebeabdeckung. Lassen Sie die Platte 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation den ungebundenen Nachweisantikörper, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schnippen und die Vertiefungen mit 200 Mikrolitern 1X PBS mit 1 % Tween-20 waschen. Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter des Indikatorsubstrats in einer Konzentration von 1 Milligramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie die Platte 5 bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Stoppen Sie nach 10 Minuten die enzymatische Reaktion, indem Sie 100 Mikroliter 2N-Schwefelsäure in die Vertiefungen geben und die Platte innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stopplösung in einem Mikroplatten-Reader ablesen.
Um einen kompetitiven ELISA durchzuführen, beschichten Sie zunächst die Vertiefungen einer 96-Well-ELISA-Platte mit 100 Mikrolitern gereinigtem Antigen in einer Konzentration von 1-10 Mikrogramm pro Milliliter. Decken Sie die Platte mit einer selbstklebenden Plattenabdeckung ab und inkubieren Sie sie dann über Nacht bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie anschließend die ungebundene Antigenlösung aus den Vertiefungen, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schnippen.
Blockieren Sie als Nächstes die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den beschichteten Vertiefungen, indem Sie 200 Mikroliter Blockierungspuffer in jede Vertiefung geben – hier 5 % fettfreie Trockenmilch in PBS. Inkubieren Sie die Platte mindestens 2 Stunden lang bei Raumtemperatur. Während Sie die Vertiefungen blockieren, bereiten Sie das Antigen-Antikörper-Gemisch in einer 1 vor. 5 Milliliter Röhrchen durch Zugabe von 150 Mikrolitern Probenantigen zu 150 Mikrolitern Primärantikörper für jede Vertiefung im Assay. Inkubieren Sie diese Mischung 1 Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nun den Blockierungspuffer von den Vertiefungen, indem Sie die Platte über eine Spüle schnippen. Waschen Sie dann die Vertiefungen mit 1X PBS mit Tween 20 und fügen Sie dann 100 Mikroliter des Antigen-Primärantikörper-Gemischs aus der Probe hinzu.
Lassen Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie anschließend die Probenmischung, indem Sie die Platte über ein Waschbecken schnippen und dann die Vertiefungen mit 1X PBS mit 1 % Tween-20 waschen, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Geben Sie 100 Mikroliter eines enzymkonjugierten Sekundärantikörpers in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie anschließend die Platte mit 1X PBS mit 1% Tween-20 und geben Sie dann 100 Mikroliter der Substratlösung in jede Vertiefung. Warten Sie 5-10 Minuten. Stoppen Sie die enzymatische Reaktion nach 10 Minuten, indem Sie 100 Mikroliter 2N-Schwefelsäure hinzufügen und dann die Absorption innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stopplösung in einem Mikroplatten-Reader messen.
Für den semiquantitativen indirekten ELISA-Assay wurde das Vorhandensein von Influenza-A-Virus-Antikörpern in seriell verdünnten Serumproben von Influenza-A-infizierten Mäusen bestimmt, indem die Absorption jeder Vertiefung bei 405 Nanometern in einem Plattenlesegerät abgelesen wurde. Diese Rohdaten werden zu Berechnungszwecken in eine Tabellenkalkulation exportiert. In diesem Experiment wurden die seriell verdünnten Serumproben, die von 1 - 12,5 bis 1 - 204.800 reichen, in dreifacher Ausfertigung wiederholt.
Um die Daten zu analysieren, wird daher der mittlere Absorptionswert für jeden Satz von Triplikaten berechnet, indem alle Werte für jede Verdünnung addiert und die Summe durch 3 dividiert wird. Sobald der Mittelwert für jeden Satz von Triplikaten bestimmt ist, werden die mittleren OD450-Messwerte gegen die seriellen Verdünnungen aufgetragen. Die OD-Messwerte nehmen ab, wenn das Serum verdünnt wird, was darauf hindeutet, dass in den stärker verdünnten Proben weniger Antikörper gefunden werden. Im quantitativen Sandwich-ELISA wurden Verdünnungen von bekannten Standard-, in diesem Fall rekombiniertem humanem TNFalpha, auf eine 96-Well-Platte gegeben und zusammen mit den unbekannten Proben abgelesen.
Um die Standardkurve zu erstellen, wurde der mittlere Absorptionswert für jeden Messsatz der bekannten Konzentrationen berechnet. Dann wurde der mittlere Absorptionswert auf der y-Achse gegen die bekannten Proteinkonzentrationen auf der x-Achse aufgetragen. Eine Best-Fit-Kurve wird durch die Punkte im Diagramm hinzugefügt.
Sobald die Standardkurve erstellt ist, kann die Menge des TNFalpha-Proteins in der Testprobe bestimmt werden, indem zunächst der mittlere Absorptionswert für die Testprobe berechnet wird. In diesem Beispiel ergaben die Testproben OD450-Messwerte von 0,636 und 0. 681. Addiert man diese Werte und dividiert die Summe durch 2, ergibt sich ein Durchschnitt von 0,659. Verlängern Sie von der y-Achse des Standardkurvendiagramms aus eine horizontale Linie von diesem Absorptionswert zur Standardkurve. Verlängern Sie am Schnittpunkt eine vertikale Linie zur x-Achse und lesen Sie die entsprechende Konzentration ab, die in dieser Probe einer TNFalpha-Konzentration von 38,72 Pikogramm pro Milliliter entspricht.
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