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Quelle: Susannah C. Shissler1, Tonya J. Webb1
1 Institut für Mikrobiologie und Immunologie, University of Maryland, Baltimore, MD 21201
Immunpräzipitation (IP, auch bekannt als "Pull-down"-Assay) ist eine weit verbreitete Technik, die Anwendungen in einer Vielzahl von Bereichen hat. Erstmals 1984 konzipiert, wurde es 1988 verfeinert (1, 2). Das grundlegende Ziel der IP ist die Reinigung und Isolierung eines bestimmten Proteins mit einem Antikörper gegen dieses Protein. Das Wort "Immuno" bezieht sich auf die Verwendung eines Antikörpers, während das Wort "Ausfällung" sich auf das Abziehen einer bestimmten Substanz aus einer Lösung bezieht. Das Zielprotein kann endogene oder rekombinant ewanant sein. Die meisten rekombinanten Proteine haben ein Epitop-Tag (d. h. myc oder Flag), das an ihnen angebracht ist, um die nachfolgende Reinigung zu vereinfachen. In der Regel ist es einfacher, rekombinante Protein-IP zu optimieren, da die Antikörper gegen rekombinante Epitop-Tags sehr stark und wirksam sind. Antikörper gegen endogene Proteine haben eine extrem variable Wirksamkeit , was es viel schwieriger macht, diese IPs zu optimieren. Ein notwendiger Schritt nach der Immunpräzipitation ist die Überprüfung der Reinigung. Das isolierte Protein wird mit SDS-PAGE aufgelöst und anschließend durch westliche Flecken auf Reinheit untersucht (Abbildung 1). Eine wichtige Kontrolle ist die Verwendung eines anderen Antikörpers während des Western Blot, um den Abziehdes des richtigen Proteins zu überprüfen. Die Kombination von IP mit nachfolgenden Techniken ist ein leistungsstarkes Analysetool. Das Ziel nach der Reinigung kann die Charakterisierung des Proteins selbst durch NMR, Massenspektrometrie und In-vitro-Assays oder die Analyse der interagierenden Partner des Proteins (z. B. Protein, DNA, RNA) (3, 4, 5) sein.
Abbildung 1: Überblick über das Immunpräzipitungsverfahren. Immunpräzipitation ist die Isolierung eines bestimmten Proteins mit einem Antikörper. Nach der Produktion von Lysat aus Zellen, gibt es zwei wichtige Schritte - Vor-Clearing und ziehen nach unten. Während des Vorklärungsschritts werden die Zelllysate von Proteinen vorgereinigt, die sich nicht spezifisch mit einem Isotyp-Kontrollantikörper an Antikörper binden. Im Pull-Down-Schritt wird das Zielprotein mit einem proteinspezifischen Antikörper nach unten gezogen. Das isolierte Protein wird dann durch Western Blot analysiert. Isotyp-Antikörper und proteinspezifische Antikörper haben die gleiche konstante Domäne, aber unterschiedliche Antigen-Bindungsdomänen. Ein wichtiger Bestandteil dieses Protokolls sind Protein-A/G-Agarose-Perlen, die die konstante Domäne von Antikörpern binden und eine Immunpräzipation des Zielproteins ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Antikörper sind der Schlüsselbestandteil einer Immunpräzipitation, die sie von anderen Formen der Proteinreinigung (d. h. Nickelaffinitätssäulenreinigung) unterscheidet. Antikörper sind Moleküle von B-Zellen, die bestimmte Proteinepitope erkennen können. Antikörper haben zwei Domänen: Konstante (Fc) und Antigenbindung (Fab) (Abbildung 1). Die konstante Domäne identifiziert den Typ des Antikörpers und diktiert die Funktion in vivo. In der Regel sind die konstanten Domänen von Antikörpern, die für IP verwendet werden, Maus, Ratte oder Kaninchen IgG. Der Antigenbindungsanteil des Antikörpers erkennt ein spezifisches Epitop eines bestimmten Proteins. Antikörper können Epitope an gefalteten Proteinen erkennen, die möglicherweise nicht existieren, wenn das Protein denaturiert ist und umgekehrt. Daher hängt die Verfügbarkeit des Epitops von der Proteinfaltung ab - die Identifizierung eines wichtigen Faktors, der bei der Wahl von Antikörpern und Bedingungen für IP zu berücksichtigen ist.
Sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Systeme haben Antikörper-bindende Proteine. In eukaryotischen Systemen, der Zweck ist Immunschutz vor Bakterien, während in prokaryotischen Systemen, der Zweck ist der Schutz vor dem Immunsystem. Antikörperbindende Proteine beeinflussen die IP-Methodik auf zwei Arten. Erstens gibt es einen notwendigen Vorklärungsschritt (Abbildung 1), um das Lysat von Proteinen zu befreien, die Antikörper binden - wodurch die unspezifische Bindung im Endprodukt reduziert wird. In diesem Schritt wird ein Isotyp-Antikörper verwendet, der die gleiche konstante Domäne wie eine andere Antikörperbindungsdomäne als Ihr proteinspezifischer Antikörper hat. Bakterielle Antikörper-bindende Proteine sind die zweite Schlüsselkomponente dieser Methode. Nachdem der proteinspezifische Antikörper das Zielprotein bindet, muss der Antikörper: Proteinkomplex heruntergezogen werden (Abbildung 1). Proteine A, G und L sind bakterielle Proteine, die die konstante Domäne von Antikörpern binden. Während Bakterien dies verwenden, um das Immunsystem zu untergraben, Forscher haben dieses System für eine einfache Antikörperreinigung kooptiert, und es wird sowohl während der Vor-Clearing-und Pull-down-Schritte verwendet. Diese Proteine haben unterschiedliche Bindungsaffinitäten für verschiedene Arten und verschiedene konstante Domänensubtypen - ein weiterer Faktor, der bei der Auswahl der Bedingungen für IP zu berücksichtigen ist. Viele Unternehmen verkaufen Protein A/G-markierte Agaroseperlen (Abbildung 1), vorgefertigte Spinsäulen oder Harze, um Säulen herzustellen. Im Allgemeinen werden Perlen und Spinsäulen für kleinere Probengrößen verwendet, während Harze für die Massenreinigung verwendet werden.
In dieser Übungsübung zeigen wir, wie das endogene Protein c-myc aus primären murinen Thymosyten mit Protein A/G Plus Agaroseperlen auf basisiger Immunpräzipitationstechnik gereinigt werden kann. Das Protokoll beginnt mit der Zelllysatzubereitung und endet mit der Überprüfung des erfolgreichen Protein-Pull-Downs mittels Western-Blot-Analyse.
1. Immunpräzipitation mit Protein A/G PLUS Agarose Perlen
Zelllysat-Vorbereitung
Pre-Clearing
Proteinkonzentrationsbestimmung
| Rohrnummer | BSA-Volumen (l) (2 mg/ml) | Proteinkonzentration (g/l) |
| 1 | 0 | 0 |
| 2 | 1 | 2 |
| 3 | 2 | 4 |
| 4 | 3 | 6 |
| 5 | 4 | 8 |
| 6 | 5 | 10 |
Tabelle 1: BSA-Proteinstandardmengen
herunterziehen
2. IP-Verifizierung durch Western Blot-Analyse
SDS-PAGE Elektrophorese:
Western Blot Analyse:
Immunpräzipitation, oder IP, ist eine weit verbreitete Technik, um ein Protein von Interesse aus einer Zelle oder Gewebelysat oder einer Körperflüssigkeit zur Proteincharakterisierung zu isolieren oder Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen.
Der Prozess beginnt mit einem Antikörper, der eine hohe Affinität und Spezifität für das Zielprotein hat. Dieser Antikörper wird mit der Probe gemischt, so dass sich Antikörper-Ziel-Komplexe bilden können. Jedes Protein, das an das Zielprotein gebunden ist, wird dabei auch indirekt an den Antikörper gebunden. Als nächstes wird die Lösung mit Agaroseperlen inkubiert, die zu einem bakteriellen Protein konjugiert sind, das eine starke Affinität zur konstanten Region der Antikörper hat. Das bakterielle Protein bindet an den Antikörper und verbindet die Antikörper-Ziel-Komplexe mit den Perlen. Dann wird die Lösung zentrifugiert, um die Perlen auszufällen, wodurch der gesamte Komplex extrahiert wird, der den bindungden Antikörper, das Zielprotein und alle interagierenden Proteine enthält. Schließlich werden die gebundenen Proteine aus den Perlen extrahiert und voneinander freigesetzt und für die weitere Analyse durch Techniken wie Western Blotting verwendet.
Mehrere Variationen verschiedener Teile dieser Technik werden häufig verwendet, wie Z. B. Pre-Clearing, mit Peptid-Tags oder magnetischen Perlen oder die Analyse anderer Nicht-Protein-Bindungspartner. IP kann durch einen Pre-Clearing-Schritt vorangegeben werden, um unspezifische Antikörper-bindende Proteine in der Probe zu entfernen und den Hintergrund zu minimieren. Dabei wird die Probe zunächst mit Isotypkontrollantikörpern inkubiert, so dass sie sich an diese Proteine binden können, und dann mit Agaroseperlen die Komplexe ausgefällt. Das Beispiel ist dann bereit, mit der tatsächlichen IP fortzufahren.
Peptid-Tags sind nützlich, wenn ein bestimmter Antikörper für IP nicht verfügbar ist. Hier kann das Zielprotein genetisch verändert werden, um ein Peptid-Epitop-Tag zu enthalten, und ein Antikörper gegen das Tag ist in der Lage, das Protein von Interesse herauszuziehen. Magnetperlen werden oft anstelle von Agarose verwendet, um das Ziel zu fällen. Nach der Bindung an den Antikörper-Ziel-Komplex wird das Probenröhrchen in ein starkes Magnetfeld gelegt, das die Perlen aus der Lösung extrahiert. Dies eliminiert die Notwendigkeit der Zentrifugation und verbessert Geschwindigkeit und Komfort.
Immunpräzipitation wird auch zur Untersuchung von DNA- oder RNA-bindenden Proteinen verwendet und sind als Chromatin-Immunpräzipitation bzw. RNA-Immunpräzipitation bekannt. Diese Variationen sind nützlich für die Fehlerbehebung und Anpassung der Methode für verschiedene experimentelle Anwendungen. In diesem Video werden Sie beobachten, wie man eine Zelle lysiert und Immunpräzipitation durchführt, um ein Protein von Interesse zu extrahieren, gefolgt von einer Western-Blot-Analyse, um das Experiment zu validieren.
Um zu beginnen, legen Sie die vorgesammelten Zellen in eine Mikrozentrifuge und drehen Sie bei 13 Tausend U/min für drei Minuten. Entfernen Sie nach dem Spin den Überstand und setzen Sie die Zellen in 500 MikroliterLysis-Puffer RIPA mit PMSF wieder aus. Nun, stören Sie die Zellen mit ein paar schnellen Impulsen mit einem Wirbel und dann das Lysat ein paar Mal mit einer 25-Meter-Nadel an einer Spritze befestigt, wobei darauf zu achten, dass Blasen zu vermeiden. Legen Sie die Zellen für 15 Minuten auf Eis. Nach dem Inkubieren der Proben auf Eis zentrieren Sie das Lysat für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.
Beschriften Sie ein neues 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Nach der Drehung den Überstand auf das frisch beschriftete Rohr übertragen und das Pellet entsorgen. Als nächstes vorab das Lysat von Verunreinigungen, die nicht spezifisch an die Agaroseperlen oder den primärantikörper binden, durch Zugabe von 20 Mikrolitern der Protein A/G PLUS-Agarose-Perlen und ein Mikrogramm eines Isotyp-Kontrollantikörpers an das Lysat, das in diesem Beispiel ist eine Maus-IgG1-Isotypsteuerung. Inkubieren Sie das Rohr auf einem Rotator in einem kalten Raum für 30 Minuten. Nachdem Sie das Lysat im Kalten Raum 30 Minuten lang rotiert haben, zentrieren Sie die Probe 30 Sekunden lang bei 4 Grad Celsius bei 3200 U/min. Entfernen Sie das Rohr aus der Zentrifuge und übertragen Sie den vorgereinigten Überstand in ein frisch beschriftetes 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Entsorgen Sie das Pellet.
Bestimmen Sie nun die Proteinkonzentration der Zelle lysieren, indem Sie einen Bradford-Assay durchführen. Etikett sieben 1. 5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen eins bis sechs und Proben und Aliquot 1000 Mikroliter des Bradford-Reagenzes in jede Röhre. Sechs der Rohre werden verwendet, um eine Standardkurve zu machen, indem verschiedene Mengen bekannter Mengen von BSA zu jedem Rohr hinzugefügt werden. Die hinzuzufügenden Beträge sind in dieser Tabelle aufgeführt. Im siebten Probenröhrchen einen Mikroliter des vorgereinigten Lysats hinzufügen. Legen Sie 200 Mikroliter aus jedem der sieben Röhren in einzelne Brunnen einer flachen 96-Well-Platte und wiederholen Sie jede Probe in Dreifacharbeit, so dass es drei Spalten mit sieben Proben gibt. Lesen Sie die Platte auf einem Plattenleser mit einer Wellenlänge von 595 Nanometern. Nach dem Erstellen einer Standardkurve in Excel berechnen Sie die Proteinkonzentration des vorgereinigten Lysats.
Als nächstes beschriften Sie zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugen-Röhren - eine als Kontrolle und die andere als Test, die in diesem Beispiel der c-myc-Antikörper sein wird. Legen Sie 500 Mikrogramm des vorgereinigten Lysats in jedes dieser Rohre und bringen Sie dann das Gesamtvolumen für jedes Rohr mit Lysepuffer auf bis zu 500 Mikroliter. Als nächstes fügen Sie dem Testgruppenröhrchen zwei Mikrogramm des Anti-C-Myc-Antikörpers hinzu. Fügen Sie für die Steuerung zwei Mikrogramm des IgG1-Isotyp-Kontrollantikörpers der Maus hinzu. Sobald die Antikörper in die Rohre gegeben sind, legen Sie die Proben auf einen Rotator in einem kalten Raum und inkubieren Sie für zwei Stunden. Nun fügen Sie die Agarose Perlen. Dazu wird empfohlen, das Ende einer Pipettenspitze abzuschneiden und dann mit dieser modifizierten Spitze 200 Mikroliter der Protein A/G PLUS-Agarose-Perlen in jedes Rohr einzutragen. Inkubieren Sie die Rohre auf einem Rotator im Kühlraum über Nacht.
Nach der Inkubation entfernen Sie die Rohre aus dem Rotator und drehen Sie die Lysate in der Mikrozentrifuge, um die Perlen herunterzuziehen. Nachdem die Drehung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Rohre aus der Zentrifuge und aspirieren Sie den Überstand aus jedem Rohr. Als nächstes waschen Sie die Perlen mit 500 Mikrolitern von 1X Dulbecco PBS. Die Rohre in eine Mikrozentrifuge geben und 30 Sekunden bei vier Grad Celsius nach unten drehen. Entfernen Sie anschließend den Überstand. Wiederholen Sie die Wasch- und Zentrifugenschritte noch einmal für insgesamt zwei Mal. Entfernen Sie die Rohre aus der Mikrozentrifuge und aspirieren Sie den Puffer aus jedem Rohr. Entfernen Sie mit Gel-Ladespitzen den restverlassenen Puffer von den Perlen und halten Sie die Perlen auf Eis, um das gebundene Protein zu vereitten.
In diesem Beispiel wird das Protein in SDS-PAGE-Laufpuffer eluiert, indem es für die Western Blot-Analyse kocht. Um dies zu tun, setzen Sie die Perlen in 20 Mikroliter SDS-PAGE Ladefarbstoff mit Beta-Mercaptoethanol, oder BME. Kochen Sie die Proben bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten, um die Immunokomplexe von den Perlen zu trennen. Dann zentrifugieren Sie die Perlen mit maximaler Geschwindigkeit für 10 Sekunden bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Rohre aus der Mikrozentrifuge und halten Sie sie bei Raumtemperatur in einem Rack. Mit Gel-Ladespitzen die Proben sorgfältig aus den Perlen pipetten und in Brunnen eines 4 bis 15% Gradienten SDS-PAGE Gel sladen. Laden Sie zusätzlich zu den Proben eine Fahrspur mit einer Proteinleiter sowie eine Fahrspur mit dem vorgereinigten Lysat als Ladekontrolle. Sobald das Gel geladen ist, führen Sie das Gel bei 100 Volt aus.
Nachdem die Färbefront den Boden des Gels erreicht hat, was etwa eine Stunde dauern sollte, stoppen Sie das Gel und machen Sie ein Western Blot Sandwich, um sicherzustellen, dass die PVDF-Membran zwischen dem Gel und der Kathode liegt. Legen Sie das Western Blot Sandwich in das Transfergerät und übertragen Sie die Proteine auf dem Gel für eine Stunde bei 100 Volt auf die Membran. Nachdem die Übertragung abgeschlossen ist, legen Sie die Membran in fünf Milliliter Block, um zu verhindern, dass die Antikörper nicht spezifisch an die Membran binden. Gestein bei niedriger Einstellung für eine Stunde bei Raumtemperatur. Wenn der Timer ertönt, entfernen Sie den Blockierenden Puffer. Fügen Sie fünf Milliliter des Sperrpuffers mit dem Detektionsantikörper in die Membran ein. Hier wird ein Anti-c-Myk-Antikörper verwendet, der sich von dem für den Pull down verwendeten unterscheidet.
Inkubieren Sie den Fleck über Nacht, bei vier Grad Celsius auf einer Wippe in einer niedrigen Umgebung. Entfernen Sie nach der Inkubation den Antikörper und den Blockierpuffer. Waschen Sie den Fleck, mit fünf Milliliter TBST für fünf Minuten bei Raumtemperatur, auf einer Wippe bei einer niedrigen Einstellung. Dieser Waschschritt sollte zwei- bis fünfmal für insgesamt drei bis sechs Waschungen wiederholt werden, wobei für jede Wäsche frisches TBST verwendet wird. Fügen Sie dem Blot fünf Milliliter eines bis 1000 sekundären Antikörpers und einen Blockierpuffer hinzu. In diesem Fall ist der sekundäre Antikörper HRP-markierte Anti-Kaninchen-Lichtkette. Inkubieren Sie den Fleck auf einer Wippe in einer niedrigen Einstellung für eine unsere bei Raumtemperatur. Als nächstes entfernen Sie den Puffer und waschen Sie den Fleck mit fünf Millilitern TBST. Inkubieren Sie diese Wäsche auf einer Wippe bei niedriger Einstellung für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diese Wäsche für insgesamt sechs bis zwölf Wäschen, jede mit frischen fünf Millilitern TBST. Entfernen Sie die endende Wäsche, indem Sie zuerst die Flüssigkeit aus dem Fleck gießen. Dann, mit Pinzette, tab die Kante des Flecks auf einem Labortuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und dann legen Sie den Fleck in einem frischen Behälter. Als nächstes den Fleck mit 1X Chemiluminescent Detection Reagenz bedecken und eine Minute lang inkubieren.
Arbeiten Sie schnell, tupmpfen Sie den Rand des Flecks auf einem Labortuch, um überschüssiges Detektionsreagenz zu entfernen, und legen Sie den Fleck dann auf die bildgebende Oberfläche des Imager-Trays. Bild mit dem Chemiluminescent-Programm, um mehrere Zeitpunkte von 10 bis 30 Sekunden zu erfassen. Nachdem der Blot abgebildet wurde, wählen Sie ein Bild mit optimaler Bandsichtbarkeit aus, und exportieren Sie dann dieses Bild. Verwenden Sie vor dem Verschieben des Blots den Imager, um ein Bild des Blots zu machen, um die Position der Leiter zu erfassen. Exportieren Sie dann auch dieses Bild. Schließlich richten Sie mithilfe einer Folienvorbereitungssoftware, z. B. PowerPoint, die Bänder und Leiterbilder zu einem Bild aus.
Dieses Bild zeigt das Western Blot-Ergebnis für die Immunpräzipitation des Proteins c-myc aus Thymosexzellen. Von links nach rechts stellen die Fahrspuren die Isotype-Steuerung, die c-myc IP und die vorgeräumte Lysat-Eingabe dar. Die Spur auf der extremen Rechten ist ein zusammengeführtes Bild der Molekulargewichtsleiter. Das starke Band, bei etwa 25 Kilodaltonen, stammt aus der Leichten Kette und das bei 50 Kilodaltonen aus der schweren Kette des Bindungsantikörpers und ist unspezifisch für die IP oder die Proben. C-myc läuft um 67 Kilodalton auf Western Blots und ist in der Regel knapp unterhalb des 75 Kilodalton Leiterbandes sichtbar. In diesem Blot ist das c-myc-Band in der zweiten Spur sichtbar, fehlt aber in der ersten Spur, was darauf hinweist, dass der IP-Antikörper c-myc erfolgreich heruntergezogen hat. Es gibt kein sichtbares Band in der vorgereinigten Lysat-Spur, was darauf hindeutet, dass dieses Protein niedrige endogene Expressionswerte hat.
Immunpräzipitation (Immunoprecipitation, IP) ist eine weit verbreitete Technik zur Isolierung eines Proteins von Interesse aus einem Zell- oder Gewebelysat oder einer Körperflüssigkeit zur Proteincharakterisierung oder zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen.
Der Prozess beginnt mit einem Antikörper, der eine hohe Affinität und Spezifität für das Zielprotein aufweist. Dieser Antikörper wird mit der Probe vermischt, so dass sich Antikörper-Ziel-Komplexe bilden können. Jedes Protein, das an das Zielprotein gebunden ist, wird dabei auch indirekt an den Antikörper gebunden. Als nächstes wird die Lösung mit Agarosekügelchen inkubiert, die an ein bakterielles Protein konjugiert sind, das eine starke Affinität für die konstante Region der Antikörper aufweist. Das bakterielle Protein bindet an den Antikörper und verbindet die Antikörper-Ziel-Komplexe mit den Kügelchen. Dann wird die Lösung zentrifugiert, um die Kügelchen auszufällen, wodurch der gesamte Komplex extrahiert wird, der den bindenden Antikörper, das Zielprotein und alle interagierenden Proteine enthält. Schließlich werden die gebundenen Proteine aus den Kügelchen extrahiert und voneinander freigesetzt und für die weitere Analyse durch Techniken wie Western Blot verwendet.
Mehrere Variationen verschiedener Teile dieser Technik werden häufig verwendet, wie z. B. das Pre-Clearing, die Verwendung von Peptid-Tags oder magnetischen Kügelchen oder die Analyse anderer Nicht-Protein-Bindungspartner. IP kann ein Pre-Clearing-Schritt vorausgehen, um unspezifische Antikörper-bindende Proteine in der Probe zu entfernen und den Hintergrund zu minimieren. Dabei wird die Probe zunächst mit Antikörpern zur Isotypkontrolle inkubiert, damit sie an diese Proteine binden können, und dann mit Agarosekügelchen die Komplexe ausgefällt. Das Beispiel ist dann bereit, mit der tatsächlichen IP fortzufahren.
Peptid-Tags sind nützlich, wenn ein spezifischer Antikörper für IP nicht verfügbar ist. Hier kann das Zielprotein genetisch so verändert werden, dass es ein Peptid-Epitop-Tag enthält, und ein Antikörper gegen das Tag ist in der Lage, das gewünschte Protein herauszuziehen. Magnetische Kügelchen werden oft anstelle von Agarose verwendet, um das Ziel auszufällen. Nach der Bindung an den Antikörper-Ziel-Komplex wird das Probenröhrchen in ein starkes Magnetfeld gebracht, das die Kügelchen aus der Lösung extrahiert. Dadurch entfällt das Zentrifugieren und die Geschwindigkeit und der Komfort werden verbessert.
Die Immunpräzipitation wird auch zur Untersuchung von DNA- oder RNA-bindenden Proteinen verwendet und ist als Chromatin-Immunpräzipitation bzw. RNA-Immunpräzipitation bekannt. Diese Variationen sind nützlich für die Fehlersuche und die Anpassung der Methode an verschiedene experimentelle Anwendungen. In diesem Video sehen Sie, wie Sie ein Zelllysat vorklären und eine Immunpräzipitation durchführen, um ein Protein von Interesse zu extrahieren, gefolgt von einer Western-Blot-Analyse, um das Experiment zu validieren.
Legen Sie zunächst die vorgesammelten Zellen in eine Mikrozentrifuge und drehen Sie sie drei Minuten lang bei 13 Tausend U/min. Entfernen Sie nach dem Schleudern den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern Lysepuffer RIPA mit PMSF. Unterbrechen Sie nun die Zellen mit ein paar schnellen Impulsen mit einem Wirbel und aspirieren Sie das Lysat dann einige Male mit einer 25-Gauge-Nadel, die an einer Spritze befestigt ist, wobei Sie darauf achten, dass keine Blasen entstehen. Lege die Zellen für 15 Minuten auf Eis. Nachdem Sie die Proben auf Eis inkubiert haben, zentrifugieren Sie das Lysat 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius.
Beschriften Sie ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Nach dem Schleudern den Überstand in das frisch etikettierte Röhrchen geben und das Pellet entsorgen. Als nächstes wird das Lysat von Verunreinigungen befreit, die unspezifisch entweder an die Agarosekügelchen oder den Primärantikörper binden, indem 20 Mikroliter der Protein A/G PLUS-Agarosekügelchen und ein Mikrogramm eines Isotyp-Kontrollantikörpers zum Lysat hinzugefügt werden, bei dem es sich in diesem Beispiel um eine Maus-IgG1-Isotypkontrolle handelt. Inkubieren Sie das Röhrchen auf einem Rotator in einem kalten Raum für 30 Minuten. Nachdem Sie das Lysat 30 Minuten lang im Kühlraum gedreht haben, zentrifugieren Sie die Probe 30 Sekunden lang bei 3200 U/min bei vier Grad Celsius. Nehmen Sie das Röhrchen aus der Zentrifuge und geben Sie den vorgereinigten Überstand in ein frisch beschriftetes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Entsorgen Sie das Pellet.
Bestimmen Sie nun die Proteinkonzentration des Zelllysats, indem Sie einen Bradford-Assay durchführen. Etikett sieben 1. 5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen eins bis sechs und Probe und aliquotieren Sie 1000 Mikroliter des Bradford-Reagenzes in jedes Röhrchen. Sechs der Röhren werden verwendet, um eine Standardkurve zu erstellen, indem jeder Röhre verschiedene Mengen bekannter Mengen an BSA zugesetzt werden. Die hinzuzufügenden Beträge sind in dieser Tabelle aufgeführt. In das siebte Probenröhrchen geben Sie einen Mikroliter des vorgeklärten Lysats. Geben Sie 200 Mikroliter aus jedem der sieben Röhrchen in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit flachem Boden und wiederholen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung, so dass drei Säulen mit sieben Proben vorhanden sind. Lesen Sie die Platte auf einem Plattenlesegerät mit einer Wellenlänge von 595 Nanometern ab. Nachdem Sie eine Standardkurve in Excel erstellt haben, berechnen Sie die Proteinkonzentration des vorgeklärten Lysats.
Als nächstes markieren Sie zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen – eines als Kontrolle und das andere als Test, wobei es sich in diesem Beispiel um den c-myc-Antikörper handelt. Geben Sie 500 Mikrogramm des vorgeklärten Lysats in jedes dieser Röhrchen und erhöhen Sie dann das Gesamtvolumen für jedes Röhrchen unter Verwendung von Lysepuffer auf 500 Mikroliter. Geben Sie anschließend zwei Mikrogramm des Anti-c-myc-Antikörpers in das Reagenzgruppenröhrchen. Für die Kontrolle fügen Sie zwei Mikrogramm des IgG1-Isotyp-Kontrollantikörpers der Maus hinzu. Sobald die Antikörper in die Röhrchen gegeben wurden, legen Sie die Proben auf einen Rotator in einem Kühlraum und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang. Nun die Agarose-Kügelchen dazugeben. Zu diesem Zweck empfiehlt es sich, das Ende einer Pipettenspitze abzuschneiden und dann mit dieser modifizierten Spitze 200 Mikroliter der Protein A/G PLUS-Agarosekügelchen in jedes Röhrchen zu geben. Inkubieren Sie die Röhren über Nacht auf einem Rotator im Kühlraum.
Entfernen Sie nach der Inkubation die Röhrchen aus dem Rotator und drehen Sie die Lysate in der Mikrozentrifuge, um die Kügelchen nach unten zu ziehen. Nachdem das Schleudern abgeschlossen ist, nehmen Sie die Röhrchen aus der Zentrifuge und saugen Sie den Überstand aus jedem Röhrchen an. Waschen Sie anschließend die Kügelchen mit 500 Mikrolitern 1X Dulbecco's PBS. Legen Sie die Röhrchen in eine Mikrozentrifuge und schleudern Sie sie 30 Sekunden lang bei vier Grad Celsius herunter. Entfernen Sie anschließend den Überstand. Wiederholen Sie die Wasch- und Zentrifugenschritte noch einmal für insgesamt zwei Mal. Nehmen Sie die Röhrchen aus der Mikrozentrifuge und saugen Sie den Puffer aus jedem Röhrchen ab. Entfernen Sie mit Gelladespitzen alle Pufferreste von den Kügelchen und halten Sie die Kügelchen auf Eis, um das gebundene Protein zu eluieren.
In diesem Beispiel wird das Protein durch Kochen für die Western-Blot-Analyse in einen SDS-PAGE-Laufpuffer eluiert. Zu diesem Zweck resuspendieren Sie die Kügelchen in 20 Mikrolitern SDS-PAGE-Ladefarbstoff, der Beta-Mercaptoethanol oder BME enthält. Kochen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius, um die Immunkomplexe von den Kügelchen zu trennen. Zentrifugieren Sie dann die Kügelchen 10 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur. Nehmen Sie die Röhrchen aus der Mikrozentrifuge und halten Sie sie in einem Gestell bei Raumtemperatur. Pipettieren Sie die Proben vorsichtig mit Gelladespitzen aus den Kügelchen und laden Sie sie in Vertiefungen mit einem SDS-PAGE-Gel mit einem Gefälle von 4 bis 15 %. Zusätzlich zu den Proben wird eine Bahn mit einer Proteinleiter sowie eine Bahn mit dem vorgeklärten Lysat beladen, die als Ladekontrolle dient. Sobald das Gel geladen ist, lassen Sie das Gel mit 100 Volt laufen.
Nachdem die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht hat, was etwa eine Stunde dauern sollte, stoppen Sie das Gel und machen Sie ein Western-Blot-Sandwich, wobei Sie sicherstellen, dass sich die PVDF-Membran zwischen dem Gel und der Kathode befindet. Legen Sie das Western-Blot-Sandwich in die Transferapparatur und übertragen Sie die Proteine auf dem Gel für eine Stunde bei 100 Volt auf die Membran. Nachdem der Transfer abgeschlossen ist, legen Sie die Membran in einen Block von fünf Millilitern, um zu verhindern, dass die Antikörper unspezifisch an die Membran binden. Rocken Sie eine Stunde lang bei niedriger Stufe bei Raumtemperatur. Wenn der Timer ertönt, entfernen Sie den Blockierungspuffer. Geben Sie fünf Milliliter des Blockierungspuffers mit dem Nachweisantikörper auf die Membran. Hier wird ein Anti-c-myc-Antikörper verwendet, der sich von dem unterscheidet, der für den Pulldown verwendet wird.
Inkubieren Sie den Blot über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer Wippe bei niedriger Stufe. Entfernen Sie nach der Inkubation den Antikörper und den Blockierungspuffer. Waschen Sie den Klecks mit fünf Millilitern TBST fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer Wippe auf niedriger Stufe. Dieser Waschschritt sollte zwei- bis fünfmal für insgesamt drei bis sechs Wäschen wiederholt werden, wobei bei jeder Wäsche frisches TBST verwendet wird. Geben Sie fünf Milliliter eines bis 1000 Sekundärantikörpers und einen Blockierungspuffer in den Blot. In diesem Fall handelt es sich bei dem Sekundärantikörper um eine HRP-markierte Anti-Kaninchen-Leichtkette. Inkubieren Sie den Blot auf einer Wippe bei niedriger Einstellung für eine oder bei Raumtemperatur. Entfernen Sie anschließend den Puffer und waschen Sie den Klecks mit fünf Millilitern TBST. Inkubieren Sie diese Wäsche auf einer Wippe bei niedriger Einstellung für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diese Wäsche für insgesamt sechs bis 12 Wäschen mit jeweils fünf Millilitern frischem TBST. Entfernen Sie die letzte Wäsche, indem Sie zuerst die Flüssigkeit aus dem Klecks gießen. Tupfen Sie dann mit einer Pinzette den Rand des Kleckses auf ein Labortuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und legen Sie den Klecks dann in einen frischen Behälter. Decken Sie anschließend den Blot mit 1X Chemilumineszenz-Detektionsreagenz ab und inkubieren Sie ihn eine Minute lang.
Tupfen Sie den Rand des Blots schnell auf ein Labortuch, um überschüssiges Detektionsreagenz zu entfernen, und legen Sie den Blot dann auf die Bildgebungsoberfläche des Imager-Fachs. Bild mit dem Chemilumineszenz-Programm, um mehrere Zeitpunkte von 10 bis 30 Sekunden zu erfassen. Nachdem der Blot abgebildet wurde, wählen Sie ein Bild mit optimaler Bandsichtbarkeit aus und exportieren Sie dieses Bild. Bevor Sie den Blot bewegen, verwenden Sie den Imager, um ein Bild des Blots zu machen, um die Position der Leiter zu erfassen. Exportieren Sie dann auch dieses Bild. Richten Sie schließlich mit einer Folienvorbereitungssoftware wie PowerPoint die Bänder und Leiterbilder so aus, dass ein Bild entsteht.
Dieses Bild zeigt das Western-Blot-Ergebnis für die Immunpräzipitation des Proteins c-myc aus Thymozytenzellen. Von links nach rechts repräsentieren die Lanes die Isotypkontrolle, die c-myc-IP und die vorab freigegebene Lysateingabe. Die Spur ganz rechts ist ein zusammengeführtes Bild der Molekulargewichtsleiter. Die starke Bande mit etwa 25 Kilodalton stammt aus der Leichtkette und die mit 50 Kilodalton aus der schweren Kette des bindenden Antikörpers und ist unspezifisch für das IP oder die Proben. C-myc wiegt etwa 67 Kilodalton auf Western Blots und ist normalerweise knapp unterhalb des 75-Kilodalton-Leiterbandes sichtbar. In diesem Blot ist die c-myc-Bande in der zweiten Spur sichtbar, aber in der ersten Spur nicht vorhanden, was darauf hindeutet, dass der IP-Antikörper c-myc erfolgreich abgebaut hat. Es gibt keine sichtbare Bande in der vorgeklärten Lysatspur, was darauf hindeutet, dass dieses Protein niedrige endogene Expressionsniveaus aufweist.
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