Immunprecipitation-basierte Techniken: Reinigung endogener Proteine mit Agarose-Perlen

1. Immunpräzipitation mit Protein A/G PLUS Agarose Perlen

Zelllysat-Vorbereitung

1. Zentrifugieren Sie 10⁸ Thymose in einer Mikrozentrifuge bei 13.000 U/min für 3 min und entfernen Sie den Überstand.
   Hinweis: Die Zellzahl variiert je nach Expressionsniveau des gewünschten Proteins und dem gewählten Zelltyp.
2. Setzen Sie die Zellen in 500 L Lysepuffer RIPA mit PMSF wieder aus.
3. Unterbrechen Sie Zellen mit ein paar schnellen Impulsen mit einem Wirbel und dann das Lysat ein paar Mal mit einer 25 G Nadel an einer Spritze befestigt aspirieren.
   Hinweis: Vermeiden Sie blasen. Verwenden Sie eine größere Nadel, z. B. eine 21G-Nadel für größere Zelltypen.
4. Die Zelle 10 min auf Eis lysieren.
5. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 13.000 U/min für 15 min bei 4°C.
6. Übertragen Sie den Überstand in ein frisches, beschriftetes Mikrozentrifugenrohr.

Pre-Clearing

7. Fügen Sie dem Lysat 20 L Protein A/G PLUS Agarose-Perlen und 1 g eines Isotyp-Kontrollantikörpers (hier verwendet der IgG1-Isotyp-Kontrollantikörper der Maus) hinzu.
   Hinweis: Die Wahl des verwendeten Isotyp-Antikörpers hängt von dem proteinspezifischen Antikörper ab, der später im Pull-Down-Schritt verwendet wird.
8. Die Lysatmischung auf einem Zentrifugenrotator im Kühlraum (4°C) 30 min inkubieren.
9. Zentrifugieren Sie die Probe bei 3200 U/min für 30 s bei 4°C.
10. Übertragen Sie den vorgereinigten Überstand in ein frisches, beschriftetes, 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Entsorgen Sie das Pellet.

Proteinkonzentrationsbestimmung

11. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der Zelle lysiert, indem Sie einen Bradford Assay durchführen.
12. Aliquot 1000 L Bradford Reagenz in 7 Mikrozentrifugenröhren.
13. Fügen Sie die folgenden Mengen des BSA-Proteinstandards (2 mg/ml) in 6 der Röhrchen ein (Tabelle 1).

Rohrnummer	BSA-Volumen (l) (2 mg/ml)	Proteinkonzentration (g/l)
1	0	0
2	1	2
3	2	4
4	3	6
5	4	8
6	5	10

Tabelle 1: BSA-Proteinstandardmengen

14. In der^7. Röhre 1 l des vorgereinigten Lysats hinzufügen.
    Hinweis: Um sicherzustellen, dass die Probenkonzentration im Assay-Detektionsbereich liegt, bereiten und analysieren Sie auch eine 1:2- oder 1:5-Lysatverdünnung.
15. Legen Sie 200 l aus jedem der 7 Rohre in einzelne Brunnen einer flachen, 96-Well-Platte, die jede Probe in dreifacher Ausfertigung wiederholt.
16. Leseplatte auf einem Plattenleser bei 595 nm.
17. Generieren Sie die Standardkurve in Excel und berechnen Sie die Proteinkonzentration des vorgereinigten Lysats.

herunterziehen

18. Beschriften Sie zwei frische 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre - eine als "Kontrolle" und andere als "Test", die in diesem Beispiel c-myc ist.
19. Legen Sie 500 g vorgereinigtes Lysat in jedes dieser Rohre.
    Hinweis: Die hier verwendete Proteinmenge hängt von der Menge des zu reinigenden Proteins ab.
20. Erhöhen Sie das Gesamtvolumen für jedes Rohr mit einem Lysepuffer bis zu 500 l.
21. Fügen Sie dem Testgruppenröhrchen 2 g Anti-C-Myk-Antikörper und dem IgG1-Isotyp-Kontrollantikörper mit 2 g der Maus einen Antikörper zur Kontrollgruppe hinzu.
    Hinweis: Die Menge des Antikörpers hängt von der Wirksamkeit des Antikörpers und der Menge des Zielproteins ab.
22. Inkubieren Sie die Rohre auf einem Rotator im Kühlraum (4°C) für 2 h.
23. Fügen Sie 20 L Protein A/G PLUS Agarose Perlen zu jeder Tube hinzu.
    Hinweis: Es ist ratsam, Pipettenspitzen mit abgeschnittenem Ende zu verwenden, um Schäden an den Perlen zu vermeiden.
24. Über Nacht auf einem Rotator im Kühlraum (4°C) inkubieren.
    Hinweis: Je nach Zielprotein und Antikörperwirksamkeit kann dieser Schritt von 1 h bis über Nacht variieren.
25. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 3200 U/min, damit bei 30 s 4°C die Perlen heruntergezogen werden.
26. Aspirieren Sie den Überstand aus jeder Röhre.
    Hinweis: Das Zielprotein ist nun an die Perlen gebunden.
27. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 500 l 1X Dulbecco s PBS.
28. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 3200 U/min für bei 30 s 4°C.
    Hinweis: Für strengeres Waschen verwenden Sie strengere Puffer wie RIPA.
29. Aspirieren Sie den Puffer aus jedem Rohr. Entfernen Sie mit Gel-Ladespitzen den Restpuffer von den Perlen und halten Sie die Perlen auf Eis, um das Protein zu entschärfen.
    Hinweis: In diesem Beispiel wird das Protein in SDS-PAGE-Laufpuffer eluiert, indem die Perlen für die Western-Blot-Analyse gekocht werden. Dieser Ansatz eignet sich zur Überprüfung von IP-Ergebnissen oder zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Für andere nachgelagerte Anwendungen, wie die Reinigung von Proteinen für die strukturelle oder enzymatische Analyse, werden anspruchsvollere Systeme wie Epitop-Tags (Flag-Tag oder myc-tag) verwendet, um die Elution des Antikörpers mit dem Protein von Interesse zu vermeiden.

2. IP-Verifizierung durch Western Blot-Analyse

SDS-PAGE Elektrophorese:

1. Re-suspend Perlen in 20 L SDS-PAGE-Ladefarbstoff mit dem -Mercapto-Ethonol.
2. Die Proben bei 95 °C 5 min kochen.
3. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 13.000 U/min für 10 s bei Raumtemperatur.
4. Mit Gel-Ladespitzen die aus den Perlen gewonnenen Proben sorgfältig pfeifen und in Brunnen mit 4-15% Gradienten-SDS-PAGE-Gel laden.
5. Laden Sie zusätzlich zu den Proben eine Fahrspur mit einer Proteinleiter sowie eine Fahrspur mit dem vorgereinigten Lysat als Ladekontrolle.
6. Laufen Sie bei 100 V, bis die Farbe vorne den Boden des Gels erreicht (ca. 1h).

Western Blot Analyse:

7. Machen Sie Western Blot Sandwich, um sicherzustellen, dass PVDF Membran zwischen Gel und roter Kathode ist.
8. Transfer für 1 h bei 100 V.
9. Legen Sie die Membran in 5 ml Sperrpuffer bei Raumtemperatur für 1 h auf eine Wippe bei niedriger Einstellung, um die unspezifischen Proteinbindungsstellen zu blockieren.
   Hinweis: Die Mengen an Blockierpuffern, primärer Antikörper, sekundärer Antikörper und Waschungen müssen möglicherweise für größere Blots erhöht werden.
10. Inkubieren Sie den Blot mit 5 ml Anti-C-Myc-Antikörper im Sperrpuffer über Nacht bei 4°C auf Rocker bei niedriger Einstellung.
    Hinweis: Der hier verwendete Antikörper sollte sich von dem im Pull-Down-Schritt verwendeten unterscheiden.
11. Waschen Sie den Fleck 3-6 mal mit 5 ml TBST mit jeder Wäsche von 5 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe bei niedriger Einstellung.
12. Inkubieren Sie den Blot mit HRP-getaggten Anti-Kaninchen-Lichtketten-Sekundärantikörper im Sperrpuffer, für 1 h bei Raumtemperatur auf Derawippe bei niedriger Einstellung.
    Hinweis: Die Wahl des sekundären Antikörpers hängt von primären Antikörpern ab, die für den Western Blot verwendet werden. Zusätzlich wird im Protokoll eine leichte Kettenspezifische Sekundäre verwendet, da das Zielprotein im Molekulargewicht nahe an der schweren Kette des Antikörpers liegt. Wenn das Zielprotein nahe 50kDa ist, verwenden Sie eine leichte Kette spezifische sekundäre. Wenn das Zielprotein nahe 25kDa ist, verwenden und schwere Kette spezifische sekundäre.
13. Waschen Sie den Fleck 3-6 mal mit 5 ml TBST mit jeder Wäsche von 5 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe bei niedriger Einstellung.
14. Entfernen Sie Flüssigkeit aus Fleck und Tupfer Rand von Fleck auf Labortücher, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
15. Bedecken Sie Blot mit 1x chemiluminescent Detektionreagenz' und inkubieren für 1 min.
    Hinweis: Die folgenden Schritte sollten in schneller Folge durchgeführt werden, da das Detektionsreagenz leicht und zeitempfindlich ist.
16. Dab Rand des Flecks auf Labortücher, um überschüssige detektionreagenz zu entfernen.
17. Platzieren Sie den Fleck auf der Bildfläche des Imager-Fachs.
    Hinweis: Chemilumineszierende Flecken können auch mit Film visualisiert werden.
18. Bild mit dem 'Chemiluminescent Program', um mehrere Zeitpunkte von 10 s bis 5 min zu erfassen.
    Hinweis: Die optimale Zeit kann sich je nach Proteinmenge und Der Qualität des Antikörpers ändern.
19. Wählen Sie ein Bild mit optimaler Bandsichtbarkeit aus, und exportieren Sie es dann.
20. Bevor Sie den Fleck bewegen, machen Sie ein Bild des Flecks mit dem Imager, um die Position der Leiter zu erfassen. Exportieren Sie dann auch dieses Bild.
21. Mit einer Folienvorbereitungssoftware (z. B. PowerPoint) richten Sie die Bänder und Leiterbilder so aus, dass sie ein einzelnes Bild bilden.