Adoptivzelltransfer: Spendermaus-Splenozyten einer Host-Maus einführen und Erfolg über FACS bewerten

1. Vorbereitung

1. Vor Beginn Laborhandschuhe und die entsprechende Schutzkleidung anziehen.
2. Sterilisieren Sie alle Sezierwerkzeuge, zuerst mit einem Waschmittel und dann mit 70% Ethanol und dann gründlich trocknen.
3. Bereiten Sie 50 ml von Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) vor, die 2% fetales Kalbsserum (FCS) enthält.

2. Dissektion

1. Mit einem Kohlendioxid-Zufuhrsystem, euthanisieren Sie die Maus durch Hypoxie. Sichern Sie die eingeschläferte Maus auf einer Sezierplatte in der Supine-Position und führen Sie eine Längs-Laparotomie mit Schere und Zange durch.
2. Mit Zangen bewegen Sie den Darm und Magen auf der rechten Seite des Bauches, um den Magen und milden zu belichten. Die Milz ist am Magen befestigt.
3. Mit Zangen die Milz vorsichtig vom Magen lösen und auf die Petrischale legen, die 5 ml HBSS 2% FCS enthält.

3. Immunzellisolierung

1. Legen Sie die Milz auf ein 40 m Zellsieb über die Petrischale. Crush die Milz mit einem Kolben, um es zu dissoziieren.
2. Stellen Sie die haftenden Zellen wieder her, indem Sie den Kolben und das Sieb mit 1 ml HBSS 2% FCS spülen.
3. Übertragen Sie die dissoziierte Milz und die Flüssigkeit in ein 15 ml Zentrifugenrohr.
4. Waschen Sie die Petrischale mit 5 MilliliterHBS 2% FCS und übertragen Sie die Flüssigkeit in das 15 ml Rohr.
5. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 x g für 7 min bei 10°C und entsorgen Sie den Überstand, um das Pellet zu vermeiden.
6. Das Pellet in 2 ml Kaliumammoniumchloridpipet nach oben und unten wieder aufundstellen, um das Pellet wieder aufzuhängen und die Erythrozyten zu lysen.
7. Warten Sie 2 min und fügen Sie HBSS 2% FCS zum resuspendierten Pellet hinzu, um das Volumen bis zu 14 ml zu erhalten.
8. Zentrifugieren Sie das Rohr wieder bei 370 x g für 7 min bei 10°C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 5 ml HBSS 2% FCS wieder auf, indem Sie nach oben und unten pfeifen.
9. Zählen Sie die Zellen mit Trypan-Blau-Färbung-Assay und passen Sie die endgültige Zellkonzentration auf 10⁷ Zellen/ml mit einem entsprechenden Volumen von HBSS 2% FCS an.

4. Adoptivtransfer

1. Transfer 2 ml Zellsuspension in einem 5 ml Sammelrohr erhalten.
2. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 x g für 7 min bei 10°C und entsorgen Sie dann den Überstand.
3. Das Pellet in 2 ml PBS wieder aufsetzen und das Rohr bei 370 x g für 7 min bei 10°C zentrieren.
4. Überstand entsorgen und Pellet in 200 l PBS resuspendieren.
5. Mit einer 0,5 ml Spritze mit einer 29G-Nadel injizieren Sie 200 l Zellsuspension in die experimentelle Maus intravenös in die retroorbitale Blutsinsinus.
6. Als Kontrolle, injizieren Sie eine zweite Maus in die gleiche Blutsinsinus mit 200 L Phosphat gepufferte Saline.

5. Zellen Ernte und Färbung

1. Vier Tage nach dem Adoptivtransfer, einschläfern Mäuse und entfernen Sie die Milz.
2. Ernten Sie die Splenozyten wie in Abschnitt 3 beschrieben.
3. Übertragen Sie 100 l Zellsuspensionen von jeder Maus in zwei FACS-Röhren, die mit "Steuerung" und "Übertragen" gekennzeichnet sind.
4. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 x g für 7 min bei 10°C und entsorgen Sie dann die Überräube.
5. Bereiten Sie eine Mischung vor, die die vier Antikörper an den in Tabelle 1aufgeführten Verdünnungen enthält.

Antikörper	Fluorochrom	verdünnung
CD45.1	BV711	1/200
CD45.2	APCCy7	1/400
CD4	BV786	1/1600
CD3	BV421	1/200

Tabelle 1: Antikörper mischen Zusammensetzung. Vier Antikörper Cocktails Zubereitung mit konzentrierten Antikörper-fluoreszierenden Konjugaten und HBSS.

6. Fügen Sie 100 l der Mischung zu jeder Röhre hinzu, und brüten Sie dann für 20 min auf Eis im Dunkeln.
7. 1 ml HBSS 2%FCS hinzufügen und dann die Rohre bei 370 x g für 3 min bei 10°C zentrieren.
8. Entsorgen Sie die Überräube und setzen Sie die Pellets in 200 l HBSS 2% FCS wieder aus.
9. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in neue, markierte FACS-Röhren.
10. Mit Flusszytometrie, wie im FACS-Protokoll gezeigt, bewerten Sie das Vorhandensein von CD45.2-positiven Lymphozyten.

6. Datenanalyse

1. Öffnen Sie die "FlowJo" Software und ziehen Sie die Dateien für jede Röhre im Fenster "Alle Beispiele".
2. Doppelklicken Sie auf die "übertragene" Datei, um die zellen zu zeigen, die von dieser Probe aufgezeichnet wurden, auf einem Punktdiagramm, das die Vorwärtsstreuung "SSC-A" auf der Y-Achse und die Seitenstreuung "FSC-A" auf der X-Achse anzeigt.
3. Klicken Sie auf"Polygon" und erstellen Sie eine Gating-Strategie, um Lymphozyten auszuwählen, dann Spender- und Wirtszellen anhand von Zelloberflächenmarkern (CD45.1, CD45.2) zu unterscheiden und dann CD45.2⁺ Zellpopulation (CD3, CD4) zu charakterisieren.
4. Wiederholen Sie die Analyseschritte mit der Datei"Steuermaus".
5. Um eine Zellpopulation zu visualisieren, klicken Sie auf "Layout-Editor".
6. Ziehen Sie die "übertragenen Zellen" und die "übertragenen CD4-Zellen" Population aus "übertragenen" und "Control" Dateien in die RegisterkarteLayout-Editor.
7. Es wird ein Punktdiagramm angezeigt, das CD45.2⁺ Zellen und CD4-Lymphozyten darstellt.
8. CD45.2 übertragene Zellen sollten nur im Punktdiagramm "übertragene Maus"angezeigt werden.