Adoptivzelltransfer: Spendermaus-Splenozyten einer Host-Maus einführen und Erfolg über FACS bewerten
Quelle: Meunier Sylvain1,2,3, Perchet Thibaut1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Einheit für Lymphopoiese, Institut für Immunologie, Pasteur In…
1. Vorbereitung
- Vor Beginn Laborhandschuhe und die entsprechende Schutzkleidung anziehen.
- Sterilisieren Sie alle Sezierwerkzeuge, zuerst mit einem Waschmittel und dann mit 70% Ethanol und dann gründlich trocknen.
- Bereiten Sie 50 ml von Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) vor, die 2% fetales Kalbsserum (FCS) enthält.
2. Dissektion
- Mit einem Kohlendioxid-Zufuhrsystem, euthanisieren Sie die Maus durch Hypoxie. Sichern Sie die eingeschläferte Maus auf einer Sezierplatte in der Supine-Position und führen Sie eine Längs-Laparotomie mit Schere und Zange durch.
- Mit Zangen bewegen Sie den Darm und Magen auf der rechten Seite des Bauches, um den Magen und milden zu belichten. Die Milz ist am Magen befestigt.
- Mit Zangen die Milz vorsichtig vom Magen lösen und auf die Petrischale legen, die 5 ml HBSS 2% FCS enthält.
3. Immunzellisolierung
- Legen Sie die Milz auf ein 40 m Zellsieb über die Petrischale. Crush die Milz mit einem Kolben, um es zu dissoziieren.
- Stellen Sie die haftenden Zellen wieder her, indem Sie den Kolben und das Sieb mit 1 ml HBSS 2% FCS spülen.
- Übertragen Sie die dissoziierte Milz und die Flüssigkeit in ein 15 ml Zentrifugenrohr.
- Waschen Sie die Petrischale mit 5 MilliliterHBS 2% FCS und übertragen Sie die Flüssigkeit in das 15 ml Rohr.
- Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 x g für 7 min bei 10°C und entsorgen Sie den Überstand, um das Pellet zu vermeiden.
- Das Pellet in 2 ml Kaliumammoniumchloridpipet nach oben und unten wieder aufundstellen, um das Pellet wieder aufzuhängen und die Erythrozyten zu lysen.
- Warten Sie 2 min und fügen Sie HBSS 2% FCS zum resuspendierten Pellet hinzu, um das Volumen bis zu 14 ml zu erhalten.
- Zentrifugieren Sie das Rohr wieder bei 370 x g für 7 min bei 10°C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 5 ml HBSS 2% FCS wieder auf, indem Sie nach oben und unten pfeifen.
- Zählen Sie die Zellen mit Trypan-Blau-Färbung-Assay und passen Sie die endgültige Zellkonzentration auf 107 Zellen/ml mit einem entsprechenden Volumen von HBSS 2% FCS an.
4. Adoptivtransfer
- Transfer 2 ml Zellsuspension in einem 5 ml Sammelrohr erhalten.
- Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 x g für 7 min bei 10°C und entsorgen Sie dann den Überstand.
- Das Pellet in 2 ml PBS wieder aufsetzen und das Rohr bei 370 x g für 7 min bei 10°C zentrieren.
- Überstand entsorgen und Pellet in 200 l PBS resuspendieren.
- Mit einer 0,5 ml Spritze mit einer 29G-Nadel injizieren Sie 200 l Zellsuspension in die experimentelle Maus intravenös in die retroorbitale Blutsinsinus.
- Als Kontrolle, injizieren Sie eine zweite Maus in die gleiche Blutsinsinus mit 200 L Phosphat gepufferte Saline.
5. Zellen Ernte und Färbung
- Vier Tage nach dem Adoptivtransfer, einschläfern Mäuse und entfernen Sie die Milz.
- Ernten Sie die Splenozyten wie in Abschnitt 3 beschrieben.
- Übertragen Sie 100 l Zellsuspensionen von jeder Maus in zwei FACS-Röhren, die mit "Steuerung" und "Übertragen" gekennzeichnet sind.
- Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 x g für 7 min bei 10°C und entsorgen Sie dann die Überräube.
- Bereiten Sie eine Mischung vor, die die vier Antikörper an den in Tabelle 1aufgeführten Verdünnungen enthält.
| Antikörper | Fluorochrom | verdünnung |
| CD45.1 | BV711 | 1/200 |
| CD45.2 | APCCy7 | 1/400 |
| CD4 | BV786 | 1/1600 |
| CD3 | BV421 | 1/200 |
Tabelle 1: Antikörper mischen Zusammensetzung. Vier Antikörper Cocktails Zubereitung mit konzentrierten Antikörper-fluoreszierenden Konjugaten und HBSS.
- Fügen Sie 100 l der Mischung zu jeder Röhre hinzu, und brüten Sie dann für 20 min auf Eis im Dunkeln.
- 1 ml HBSS 2%FCS hinzufügen und dann die Rohre bei 370 x g für 3 min bei 10°C zentrieren.
- Entsorgen Sie die Überräube und setzen Sie die Pellets in 200 l HBSS 2% FCS wieder aus.
- Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in neue, markierte FACS-Röhren.
- Mit Flusszytometrie, wie im FACS-Protokoll gezeigt, bewerten Sie das Vorhandensein von CD45.2-positiven Lymphozyten.
6. Datenanalyse
- Öffnen Sie die "FlowJo" Software und ziehen Sie die Dateien für jede Röhre im Fenster "Alle Beispiele".
- Doppelklicken Sie auf die "übertragene" Datei, um die zellen zu zeigen, die von dieser Probe aufgezeichnet wurden, auf einem Punktdiagramm, das die Vorwärtsstreuung "SSC-A" auf der Y-Achse und die Seitenstreuung "FSC-A" auf der X-Achse anzeigt.
- Klicken Sie auf"Polygon" und erstellen Sie eine Gating-Strategie, um Lymphozyten auszuwählen, dann Spender- und Wirtszellen anhand von Zelloberflächenmarkern (CD45.1, CD45.2) zu unterscheiden und dann CD45.2+ Zellpopulation (CD3, CD4) zu charakterisieren.
- Wiederholen Sie die Analyseschritte mit der Datei"Steuermaus".
- Um eine Zellpopulation zu visualisieren, klicken Sie auf "Layout-Editor".
- Ziehen Sie die "übertragenen Zellen" und die "übertragenen CD4-Zellen" Population aus "übertragenen" und "Control" Dateien in die RegisterkarteLayout-Editor.
- Es wird ein Punktdiagramm angezeigt, das CD45.2+ Zellen und CD4-Lymphozyten darstellt.
- CD45.2 übertragene Zellen sollten nur im Punktdiagramm "übertragene Maus"angezeigt werden.
Der adoptive Zelltransfer ist eine Methode, um interessante Zellen in einen Organismus einzuführen. Es ist eine leistungsstarke Technik, um verschiedene biologische Mechanismen zu untersuchen, einschließlich der Wirkung bestimmter Klassen von Immunzellen. Darüber hinaus ist der adoptive Transfer eine vielversprechende neuartige Behandlung für zahlreiche Erkrankungen, wie z. B. solche, die Knochenmarktransplantationen erfordern, oder Krebsbehandlungen, bei denen die eigenen T-Zellen eines Patienten extrahiert, verändert werden können, um die Krebszellen zu erkennen und zu zerstören, und dann in den Körper zurückgeführt werden können, um Tumore zu bekämpfen.
Im Labor werden häufig Tiermodelle verwendet, um den Adoptionstransfer zu untersuchen. Zum Beispiel fehlen CD45.1 Rag gamma-c Knockout-Mäusen grundlegende Rezeptoren für viele Zytokine, die für die normale Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen in Lymphozyten essentiell sind. Infolgedessen haben die Knockout-Mäuse eine beeinträchtigte Lymphozytenentwicklung und keine natürlichen Killer- oder NK-Zellen, T-Zellen oder B-Zellen.
Der adoptive Transfer kann verwendet werden, um die fehlenden Immunzellen in diese kompromittierten Mäuse einzuführen, indem zunächst Spendergewebe von Mäusen entnommen wird, das hohe Konzentrationen von Immunzellen enthält, wie z. B. die Milz. Anschließend wird das Gewebe dissoziiert und eine Vielzahl von Milzzellen, darunter auch die Immunzellen, isoliert. Als nächstes können unerwünschte Erythrozyten oder rote Blutkörperchen durch Zugabe von Ammoniumchlorid-Kalium-Lysingpuffer lysiert werden, und die verbleibenden weißen Blutkörperchen oder Splenozyten werden dann durch Zentrifugation von den Zelltrümmern getrennt.
Schließlich werden die gereinigten Splenozyten in die immungeschwächten Mäuse injiziert, was eine detaillierte Untersuchung der Funktionen dieser Zellen ermöglicht. Einige Tage später kann der Erfolg des adoptiven Immunzelltransfers bestätigt werden, indem zunächst die Wirtssplenozyten isoliert und auf die gleiche Weise wie das Spendergewebe präpariert werden. Anschließend werden diese Zellen mit markierten Antikörpern gegen die Immunzellmarker des Spenders gefärbt, damit sie mit FACS verifiziert und sortiert werden können.
Ziehen Sie zunächst Laborhandschuhe und die entsprechende Schutzausrüstung an. Waschen Sie anschließend eine Pinzette und eine Präparierschere zuerst mit einem Reinigungsmittel und dann mit 70 % Ethanol und trocknen Sie sie dann mit einem sauberen Papiertuch ab. Bereiten Sie 50 Milliliter Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) mit 2 % fötalem Kälberserum (FCS) vor, indem Sie einen Milliliter FCS mit 49 Millilitern HBSS in einer 50-Milliliter-Tube kombinieren. Mischen Sie, indem Sie die Lösung etwa 10 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren.
Präparieren Sie die euthanasierte Maus und entfernen Sie ihre Milz, wie in der FACS-Technologie des JoVE-Videoprotokolls für die Trennung von Milz-B-Lymphozyten demonstriert. Um Immunzellen zu isolieren, legen Sie die Milz zunächst auf ein 40-Mikrometer-Zellsieb in einer Petrischale. Zerdrücke die Milz mit einem Kolben, um sie in die Schale zu dissoziieren. Gewinnen Sie die anhaftenden Zellen zurück, indem Sie den Kolben und das Sieb mit 1 Milliliter HBSS 2% FCS spülen. Pipettieren Sie dann die dissoziierte Milz und die Flüssigkeit aus der Petrischale in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Petrischale mit 5 Millilitern HBSS 2% FCS und geben Sie die Flüssigkeit in das 15 Milliliter Röhrchen.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 370 mal g für sieben Minuten bei 10 Grad Celsius und nehmen Sie dann das Röhrchen vorsichtig heraus, um das Pellet nicht zu stören. Entfernen Sie nun den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und entsorgen Sie die Flüssigkeit in einem geeigneten Abfallbehälter. Geben Sie dann zwei Milliliter Ammoniumchlorid-Kalium-Lysingpuffer in das Zentrifugenröhrchen und pipettieren Sie auf und ab, um das Pellet zu resuspendieren und die Erythrozyten zu lysieren. Warten Sie zwei Minuten und fügen Sie dann HBSS 2% FCS zu dem resuspendierten Pellet hinzu, um einen Gesamtwert von 14 Millilitern zu erhalten. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Nehmen Sie das Röhrchen vorsichtig heraus und entsorgen Sie den Überstand. Dann resuspendieren Sie das Pellet in 5 Millilitern HBSS 2% FCS, indem Sie auf und ab pipettieren. Zählen Sie als Nächstes die Zellen in Suspension. Geben Sie fünf Mikroliter Trypanblau zu fünf Mikrolitern Zellsuspension und mischen Sie es durch Pipettieren gut. Geben Sie dann vorsichtig einen fünf Mikroliter Tropfen verdünnter Zellsuspension zwischen das Deckglas und den Malassez-Objektträger. Wenn das Mikroskop auf 40-fache Vergrößerung eingestellt ist, zählen Sie die Anzahl der Zellen. Passen Sie die Zellkonzentration auf 10 bis sieben Zellen pro Milliliter an, indem Sie das entsprechende Volumen HBSS 2% FCS hinzufügen.
Um den adoptiven Transfer zu beginnen, überführen Sie zwei Milliliter der Zellsuspension in ein Fünf-Milliliter-Sammelröhrchen. Das Röhrchen wird bei 370 mal g sieben Minuten lang bei 10 Grad Celsius zentrifugiert und dann der Überstand verworfen. Als nächstes resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung und zentrifugieren Sie das Röhrchen sieben Minuten lang bei 10 Grad Celsius bei 370 mal g. Entsorgen Sie den Überstand. Dann resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Injizieren Sie der Versuchsmaus mit einer 0,5-Milliliter-Spritze mit einer 29-Gauge-Nadel 200 Mikroliter Zellsuspension intravenös in den retroorbitalen Blutsinus.
Vier Tage nach dem Adoptivtransfer die Mäuse einschläfern und die Milz entfernen. Ernten Sie dann die Immunzellen, wie in Abschnitt drei beschrieben. Übertragen Sie als Nächstes 100 Mikroliter Zellsuspension von jeder Maus in zwei FACS-Röhrchen mit der Bezeichnung "Kontrolle" und "Transfer". Die Röhrchen werden bei 370 mal g sieben Minuten lang bei 10 Grad Celsius zentrifugiert und dann die Überstände verworfen. Bereiten Sie nun eine Mischung vor, die die vier Antikörper in der in Tabelle eins aufgeführten Verdünnung enthält. Geben Sie 100 Mikroliter der Mischung in jedes Röhrchen und inkubieren Sie dann 20 Minuten lang im Dunkeln auf Eis. Geben Sie anschließend einen Milliliter HBSS 2% FCS in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen dann drei Minuten lang bei 10 Grad Celsius bei 370 mal g. Die Überstände werden verworfen und die Pellets in 200 Mikrolitern HBSS 2 % FCS wieder suspendiert. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in neu markierte FACS-Röhrchen. Verwenden Sie nun die Durchflusszytometrie, wie sie im FACS-Protokoll gezeigt wird, um das Vorhandensein von CD45 zu bewerten. 2 positive Lymphozyten.
Nun werden wir das Vorhandensein von CD45.2-Lymphozyten bestimmen, die aus dem CD45 isoliert wurden. 1 Wirtsmilz. Um zu beginnen, doppelklicken Sie auf das FlowJo-Symbol und ziehen Sie die Dateien für jede Röhre in das Fenster für alle Proben. Doppelklicken Sie dann auf die übertragene Datei, um die aus dieser Stichprobe aufgezeichneten Zellen in einem Punktdiagramm anzuzeigen, das die Vorwärtsstreuung FSCA auf der X-Achse und die Seitenstreuung SSCA auf der Y-Achse anzeigt. Klicken Sie auf das Polygon, um die Lymphozytenpopulationen einzukreisen. Ein neues Fenster zur Identifizierung der Teilpopulation wird angezeigt. Klicken Sie auf OK. Legen Sie nun die y-Achse auf FSC-W und die x-Achse auf FSC-A fest. Wählen Sie die einzelne Zellenpopulation mit dem Polygonwerkzeug aus, wie zuvor gezeigt.
Doppelklicken Sie anschließend auf die eingekreiste Population, um ein neues Fenster für die ausgewählten Zellen zu erstellen. Wählen Sie im neuen Fenster CD45.2 auf dem Y und CD45.1 auf dem X. Klicken Sie auf das T-Symbol und passen Sie die Achse an, um das Diagramm zu vergrößern. Klicken Sie anschließend auf das Polygon, um die CD45.2-positiven Zellen einzukreisen. Benennen Sie im Fenster zur Identifizierung der Teilpopulation die übertragene Zellpopulation und klicken Sie auf OK. Klicken Sie im selben Fenster auf das Rechteck, um die CD45.2-negativen Zellen auszuwählen. Benennen Sie im Fenster zur Identifizierung der Subpopulation die Wirtszellen der Zellpopulation und klicken Sie auf OK. Doppelklicken Sie anschließend auf die CD45.2-eingekreiste Population, übertragene Population, um ein neues Fenster für die ausgewählten Zellen zu erstellen. Wählen Sie im neuen Fenster CD3 auf dem Y und CD4 auf dem X aus.
Klicken Sie anschließend auf das Polygon, um die CD4 CD3-positiven Zellen einzukreisen. Benennen Sie in diesem Fenster zur Identifizierung der Subpopulation Ihre übertragene Zellpopulation in CD4-Zellen. Wiederholen Sie dann die vorherigen Analyseschritte mit der Steuermausdatei. Um schließlich Ihre Zellpopulationen zu visualisieren, klicken Sie auf Layout-Editor. Ziehen Sie die übertragenen Zellen und die übertragene CD4-Zellbestückung aus den übertragenen Dateien und den Steuerdateien auf die Registerkarte Layouteditor. Es erscheint ein Punktdiagramm, das CD45.2-positive Zellen und CD4-Lymphozyten darstellt. CD45. 2 übertragene Zellen sollten nur im übertragenen Mauspunktdiagramm erscheinen.
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Q1: What is adoptive cell transfer and why is it used in research?
Adoptive cell transfer is a method for introducing cells into an organism to study biological mechanisms or treat disease. It enables researchers to examine specific immune cell functions, study hematopoiesis, and test novel therapies like cancer treatments where patient T-cells are extracted, modified to recognize tumors, and returned to fight cancer. Animal models allow detailed investigation of transferred cell behavior and efficacy.
Q2: Why are CD45.1 Rag gamma-c knockout mice used in adoptive transfer studies?
CD45.1 Rag gamma-c knockout mice lack fundamental cytokine receptors essential for normal lymphocyte development, resulting in compromised immune systems without natural killer cells, T-cells, or B-cells. These immunocompromised mice serve as ideal recipients for adoptive transfer because they allow researchers to study how donor immune cells establish and function in a lymphocyte-deficient host.
Q3: How are splenocytes isolated and purified from donor tissue?
The spleen is dissociated using a cell strainer and plunger to release cells into suspension. Unwanted erythrocytes are lysed using ammonium chloride potassium lysing buffer, and centrifugation separates white blood cells from debris. The resulting purified splenocytes are counted using trypan blue and adjusted to the desired concentration before transfer into recipient mice.
Q4: What is the role of flow cytometry in confirming successful adoptive transfer?
Flow cytometry using fluorescence-activated cell sorting (FACS) confirms transfer success by detecting donor cells in the host spleen. Labeled antibodies against donor markers like CD45.2 distinguish transferred cells from host cells. The technique allows researchers to identify specific lymphocyte populations, such as CD4 T-cells, and verify their presence and distribution in recipient mice.
Q5: How is the cell suspension prepared before intravenous injection into recipient mice?
The cell suspension is centrifuged and resuspended in phosphate buffered saline through two sequential wash steps. The final pellet is resuspended in 200 microliters of phosphate buffered saline. Using a 0.5 milliliter syringe with a 29-gauge needle, 200 microliters of this purified cell suspension is injected intravenously into the retro-orbital blood sinus of the recipient mouse.
Q6: What does the FACS analysis reveal about transferred versus host lymphocytes?
FACS analysis distinguishes CD45.2 positive transferred cells from CD45.1 positive host cells using dot plots. Transferred cells appear only in the transferred mouse sample, not in control mice receiving phosphate buffered saline alone. Further analysis identifies specific transferred lymphocyte subsets, such as CD4 T-cells, demonstrating both successful engraftment and the phenotype of donor cells within the host.
Q7: What compatibility factors must be considered before performing adoptive cell transfer?
Host and donor compatibility is crucial to ensure cell adoption without rejection. In this protocol, CD45.2 donor splenocytes are transferred into CD45.1 Rag gamma-c recipient mice, allowing discrimination between donor and host cells. This genetic distinction enables researchers to track transferred cells and assess their integration, survival, and function within the immunocompromised host environment.