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Erstellen einer Winogradsky-Säule: Eine Methode zur Anreicherung der mikrobiellen Spezies in einer Sedimentprobe

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Microbiology

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Creating a Winogradsky Column: A Method to Enrich the Microbial Species in a Sediment Sample

6.2: Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration

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08:08 min

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April 30, 2023

Overview

Quelle: Elizabeth Suter¹, Christopher Corbo¹, Jonathan Blaize¹
¹ Department of Biological Sciences, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301

Die Winogradsky-Säule ist ein miniaturiges, geschlossenes Ökosystem, das zur Anreicherung von mikrobiellen Sedimentgemeinschaften verwendet wird, insbesondere solche, die am Schwefelkreislauf beteiligt sind. Die Säule wurde erstmals von Sergei Winogradsky in den 1880er Jahren verwendet und wurde seitdem in der Untersuchung von vielen verschiedenen Mikroorganismen in der Biogeochemie, wie Photosynthesizer, Schwefeloxidatoren, Sulfat-Reduzierer, Methanogene, Eisenoxidizer, Stickstoff angewendet Cycler und mehr (1,2).

Die Mehrheit der Mikroorganismen auf der Erde gilt als unkultiierbar,was bedeutet, dass sie nicht in einem Reagenzglas oder auf einer Petrischale isoliert werden können (3). Dies ist auf viele Faktoren zurückzuführen, einschließlich, dass Mikroorganismen von anderen für bestimmte Stoffwechselprodukte abhängen. Die Bedingungen in einer Winogradsky-Säule imitieren den natürlichen Lebensraum eines Mikroorganismus, einschließlich ihrer Wechselwirkungen mit anderen Organismen, und ermöglichen es, sie in einem Labor zu wachsen. Daher ermöglicht diese Technik Wissenschaftlern, diese Organismen zu untersuchen und zu verstehen, wie wichtig sie für die biogeochemischen Zyklen der Erde sind, ohne sie isoliert anbauen zu müssen.

Die Umgebungen der Erde sind voll von Mikroorganismen, die in allen Arten von Lebensräumengedeihen, wie Böden, Meerwasser, Wolken und Tiefseesedimente. In allen Lebensräumen sind Mikroorganismen voneinander abhängig. Wenn ein Mikroorganismus wächst, verbraucht er bestimmte Substrate,einschließlich kohlenstoffreicher Brennstoffe wie Zucker sowie Nährstoffe, Vitamine und Atemgase wie Sauerstoff. Wenn diese wichtigen Ressourcen auslaufen, können verschiedene Mikroorganismen mit unterschiedlichen Stoffwechselbedürfnissen blühen und gedeihen. In der Winogradsky-Säule verbrauchen Mikroben beispielsweise zuerst das zugesetzte organische Material, während sie den Sauerstoff in den unteren Schichten der Säule aufbrauchen. Sobald der Sauerstoff verbraucht ist, können anaerobe Organismen dann verschiedene organische Materialien übernehmen und verbrauchen. Diese konsekutive Entwicklung verschiedener mikrobieller Gemeinschaften im Laufe der Zeit wird Als Nachfolge bezeichnet (4). Die mikrobielle Abfolge ist wichtig in einer Winogradsky-Säule, wo die mikrobielle Aktivität die Chemie des Sediments verändert, was dann die Aktivität anderer Mikroben und so weiter beeinflusst. Viele Mikroorganismen in Böden und Sedimenten leben auch entlang Vonsteigen,die Übergangszonen zwischen zwei verschiedenen Arten von Lebensräumen sind, basierend auf den Konzentrationen von Substraten (5). An der richtigen Stelle im Gradienten kann eine Mikrobe optimale Mengen an verschiedenen Substraten erhalten. Mit der Entwicklung einer Winogradsky-Säule beginnt sie, diese natürlichen Gradienten, insbesondere in Sauerstoff und Sulfid, nachzuahmen (Abb. 1).

Abbildung 1: Eine Darstellung der Sauerstoff – O₂) und Sulfid (H₂S) Gradienten, die sich in einer Winogradsky-Säule entwickeln.

In einer Winogradsky-Säule werden Schlamm und Wasser aus einem Teich oder Feuchtgebiet in einer transparenten Säule vermischt und inkubieren, typischerweise im Licht. Zusätzliche Substrate werden der Säule hinzugefügt, um der Gemeinschaft Kohlenstoffquellen zu geben, in der Regel in Form von Zellulose und Schwefel. Photosynthesizer beginnen in der Regel in den oberen Schichten des Sediments zu wachsen. Diese photosynthetischen Mikroorganismen bestehen größtenteils aus Cyanobakterien,die Sauerstoff produzieren und als grüne oder rotbraune Schicht erscheinen (Abb. 2, Tabelle 1). Während die Photosynthese Sauerstoff produziert, ist Sauerstoff in Wasser nicht sehr löslich und unter dieser Schicht abnimmt (Abb. 1). Dadurch entsteht ein Sauerstoffgradient, der von hohen Sauerstoffkonzentrationen in den oberen Schichten bis zu Nullsauerstoff in den unteren Schichten reicht. Die sauerstoffhaltige Schicht wird die aerobe Schicht und die Schicht ohne Sauerstoff als anaerobe Schicht bezeichnet.

In der anaeroben Schicht können sich viele verschiedene mikrobielle Gemeinschaften vermehren, abhängig von der Art und Menge der verfügbaren Substrate, der Quelle der ersten Mikroben und der Porosität des Sediments. Am unteren Rand der Säule können Organismen gedeihen, die anaerobe organische Materie abbauen. Die mikrobielle Fermentation produziert organische Säuren aus dem Abbau von Zellulose. Diese organischen Säuren können dann von Sulfat-Reduzierernverwendet werden, die diese organischen Stoffe mit Sulfat oxidieren und Sulfid als Nebenprodukt produzieren. Die Aktivität von Sulfat-Reduzierern wird angezeigt, wenn das Sediment schwarz wird, da Eisen und Sulfid auf schwarze Eisen-Sulfid-Mineralien reagieren (Abb. 2, Tabelle 1). Der Sulfid diffundiert auch nach oben, wodurch ein weiterer Gradient entsteht, bei dem die Sulfidkonzentrationen im unteren Rand der Säule hoch und oben in der Säule niedrig sind (Abb. 1).

In der Mitte der Säule nutzen Schwefeloxidatoren die Sauerstoffzufuhr von oben und Sulfid von unten. Mit der richtigen Lichtmenge können sich in diesen Schichten photosynthetische Schwefeloxidatoren entwickeln. Diese Organismen sind als grüne und violette Schwefelbakterienbekannt und erscheinen oft als grüne, lila oder lila-rote Filamente und Flecken (Abb. 2, Tabelle 1). Grüne Schwefelbakterien haben eine höhere Toleranz für Sulfid und entwickeln sich in der Regel in der Schicht direkt unter violetten Schwefelbakterien. Oberhalb der violetten Schwefelbakterien können sich auch violette Nicht-Schwefelbakterien entwickeln. Diese Organismen photosynthetisieren mit organischen Säuren als Elektronenspender anstelle von Sulfid und erscheinen oft als rote, lila, orange oder braune Schicht. Nichtphotosynthetische Schwefeloxidatoren können sich oberhalb der violetten Nichtschwefelbakterien entwickeln, die in der Regel als weiße Filamente erscheinen (Abb. 2, Tabelle 1). Darüber hinaus können sich auch Blasen in der Winogradsky-Spalte bilden. Blasen in den aeroben Schichten zeigen die Produktion von Sauerstoff durch die Cyanobakterien an. Blasen in den anaeroben Schichten sind wahrscheinlich auf die Aktivität von Methanogenenzurückzuführen, Organismen, die organische Stoffe anaeroben zerlegen und Methan als Nebenprodukt bilden.

Position in Spalte	Funktionsgruppe	Organismus Beispiele	Visueller Indikator
Nach oben	Photosynthesizer	Cyanobakterien	Grüne oder rötlich-braune Schicht. Manchmal Blasen von Sauerstoff.
	Nichtphotosynthetische Schwefeloxidatoren	Beggiatoa	Weiße Schicht.
	Violette Nicht-Schwefelbakterien	Rhodomicrobium, Rhodospirilum, Rhodopseuodmonas	Rote, lila, orange oder braune Schicht.
	Violettschwefelbakterien	Chromatium	Lila oder lila-rote Schicht.
	Grüne Schwefelbakterien	Chlorobium	Grüne Schicht.
	Sulfat reduzierende Bakterien	Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfobacter, Desulfuromonas	Schwarze Schicht.
Unteres	Methanogens	Methanococcus	Manchmal Blasen von Methan.

Tabelle 1: Die wichtigsten Gruppen von Bakterien, die in einer klassischen Winogradsky-Säule erscheinen können, von oben nach unten. Es werden Beispiele für Organismen aus jeder Gruppe gegeben, und die visuellen Indikatoren jeder Schicht von Organismen werden aufgelistet. Basierend auf Perry et al. (2002) und Rogan et al. (2005).

Procedure

1. Einrichtung

Um eine Winogradsky-Spalte einzurichten, benötigen Sie einige Grundversorgungen:
- Schaufel, Eimer und Flasche, um die Proben im Feld zu sammeln
- Ein vertikales, transparentes Gefäß, z. B. ein abgestufter Zylinder oder eine Kunststoff-Wasserflasche von ca. 1L
- Kunststoffwickel und Gummibänder
- große Mischschüsseln und großer Löffel zum Rühren
- Eine Schwefelquelle (Eigelb oder Calciumsulfat)
- Eine Quelle von organischem Kohlenstoff (Zellulose, in Form einer geschredderten Zeitung)
- Eine Lichtquelle (sonniges Fenster oder Schreibtischlampe)
- Boden oder Schlamm aus einem Sumpf, Feuchtgebiet, Teich oder Bach gesammelt
- Wasser aus demselben Lebensraum
- OPTIONAL Für einige der in diesem Protokoll beschriebenen optionalen Experimente ist Folgendes erforderlich:
  - Speisesalz
  - Anders gefärbtes Zellophan
  - Eine Eisenquelle (z. B. Nagel- oder Stahlwolle)
  - Ein Kühlschrank mit Lichtquelle
  - Ein Heizkörper in der Nähe einer Lichtquelle
Wenn Sie eine Kunststoff-Wasserflasche verwenden, schneiden Sie den Halsbereich ab, so dass die Säule zylindrisch geformt ist. Entfernen Sie alle Wrapper, damit Licht durch den Kunststoff eindringen kann.
Rohe Eier können Salmonellen enthalten und sollten mit Vorsicht behandelt werden. Richtige Handwaschtechniken sollten befolgt werden. Alternativ kann gekochtes Ei verwendet werden. Darüber hinaus gibt es keine Möglichkeit, sicher zu wissen, ob Schlamm oder Sediment mit Abwasser oder anderen schädlichen Substanzen kontaminiert ist. Beim Mischen des Schlamms und beim Aufstellen der Säule sollten Handschuhe verwendet werden.

2. Montage einer Winogradsky-Säule

Mit der Schaufel graben und Schlamm in den Eimer sammeln. Die Sedimente sollten in der Nähe des Wasserrandes sein und vollständig mit Wasser gesättigt sein. Sie benötigen genug Schlamm, um jede Winogradsky-Säule zu füllen. Sammeln Sie etwas Wasser aus der gleichen Quelle in die Probenflasche (ca. 3000 ml pro Kolonne wird benötigt).
Übertragen Sie im Labor genügend Schlamm in die erste Mischschüssel, um 75 % Ihrer 1-Liter-Volumensäule zu füllen. Als nächstes durchsieben, um große Felsen, Zweige oder Blätter zu entfernen, während Sie den Löffel verwenden, um Klumpen auseinander zu brechen.
Fügen Sie etwas von dem Wasser, das Sie gesammelt haben, unter Rühren in die Rührschüssel. Hinzufügen, bis die Konsistenz der Wasser-Schlamm-Mischung wie ein Milchshake ist. Fahren Sie fort, um sicherzustellen, dass es keine Klumpen gibt.
Etwa 1/3 des Wasserschlammmilchshakes in die zweite Schüssel geben. Fügen Sie das Eigelb und eine Handvoll geschredderte Zeitung und mischen.
Fügen Sie die Mischung aus Schlamm, Eigelb und Zeitung in die Spalte, bis die Spalte etwa 1/4 voll ist.
Fügen Sie das normale Wasser-Schlamm-Gemisch in die Säule ein, bis die Säule etwa 3/4 voll ist.
Fügen Sie das zusätzliche Wasser in die Säule ein, sodass nur ein kleiner Raum (ca. 1,2 Zoll) Luft oben bleibt.
Bedecken Sie die Säule mit Plastikfolie und sichern Sie sie mit einem Gummiband.
Inkubieren Sie die Säule im Licht bei Raumtemperatur.
Überwachen Sie in den nächsten 4 bis 8 Wochen Die Veränderungen in der Winogradsky-Säule für die Entwicklung unterschiedlicher farbiger Schichten und die Bildung von Blasen, wie in Tabelle 1 beschrieben. Darüber hinaus sollten Sie die Zeit aufzeichnen, die für die Entwicklung verschiedener Layer benötigt wird.

3. Optionale Änderungen an der klassischen Winogradsky-Säule

Vor dem Hinzufügen von Wasser und Rühren 25-50g Salz pro 1L Winogradsky-Säule in den gesammelten Schlamm geben (Schritt 2.3). Die Zugabe von Salz wählt für halophile (salzliebende) Bakterien.
Alternative Substrate, wie Eisen, in Form eines Nagels oder einer Stahlwolle, können der Säule zusammen mit dem Eigelb und der geschredderten Zeitung hinzugefügt werden (Schritt 2.4). Dies wird eisenoxidierende Bakterien, wie Gallionella,anreichern und als rostfarbene Schicht erscheinen.
Anstelle der Raumtemperatur (Schritt 2.9) kann die Säule in der Nähe eines Heizkörpers zur Auswahl für thermophile (wärmeliebende) Bakterien oder in einem Kühlschrank mit einer Lichtquelle zur Auswahl für psychophile (kaltliebende) Bakterien inkubiert werden.
Die Lichtmenge, die eine Säule beim Inkubieren erhält (Schritt 2.9), kann auch variiert werden, indem verschiedene Säulen in hohes Licht, schwaches Licht oder Dunkelheit platziert werden.
Die Wellenlänge des einfallenden Lichts kann begrenzt werden, indem die Säule mit unterschiedlich schattierten Zellophanen bedeckt wird, während sie inkubiert (Schritt 2.9), um zu bestimmen, welche Farben für verschiedene Bakteriengruppen ausgewählt werden.

4. Datenanalyse

Nach 1-3 Wochen sollte eine grüne Färbung auf der Oberseite der Schlammschicht der klassischen Winogradsky-Säule sichtbar sein (Abb. 2A). Dies sind die ersten Anzeichen für das Wachstum der cyanobakteriellen Schicht.
Im Laufe der Zeit, weiterhin das Aussehen und die Entwicklung der verschiedenen Schichten zu überwachen, jede Indiz für die verschiedenen Bakterientypen. HINWEIS: Lesen Sie die Konzepte und Tabelle 1, um zu verstehen, welche Bakterien zu den verschiedenen Schichten beitragen.

Abbildung 2A: Ein Foto einer klassischen Winogradsky-Säule, die 21 Tage lang bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Beachten Sie das grüne Sediment, das auf Cyanobakterien hinweist, im oberen Teil der Säule.

Wenn auch Änderungen an der klassischen Winogradsky-Säule vorbereitet wurden, vergleichen Sie die Ergebnisse der einzelnen Spalten.
1. Beobachten Sie die Layer in jeder der modifizierten Winogradsky-Spalten. Beachten Sie Folgendes:
  - Weisen die Spalten die gleiche Anzahl von Ebenen auf?
  - Sind die Schichten die gleiche Farbe und Dicke?
  - Treten die Schichten in den gleichen Tiefen auf?
  - Wie lange hat die Entwicklung jeder Spalte gedauert?
  - Hat sich eine Spalte langsamer entwickelt als die andere?

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5. Results

In this experiment, water and sediment were collected from a freshwater habitat. Two Winogradsky columns were constructed and allowed to develop: a classical Winogradsky column incubated in the light at room temperature (Fig. 2A) and a Winogradsky column incubated in the dark at room temperature (Fig. 2B).

Figure 2B: A photo of classical Winogradsky column (left), incubated at room temperature in light for 68 days and a Winogradsky column incubated at room temperature in the dark for 68 days (right).

After allowing the columns to develop for 7-9 weeks, the layers in the classical column can be compared to the column incubated in the dark (Fig. 2B). In the classical Winogradsky column, a green cyanobacterial layer can be observed near the top of the tube. Near the center of the tube, a red-purple layer can be observed, indicative of purple nonsulfur bacteria. Under this layer, a purple-red layer is observed, indicative of purple sulfur bacteria. Directly under this layer, black sediment can be observed in the anaerobic region of the column, indicative of sulfate reducing bacteria.
The column grown in the dark (Fig. 2B) developed differently than the classical Winogradsky column. Like the classical column, the dark column yielded black sediment near the bottom of the column, indicative of sulfate reducing bacteria. The dark column did not yield the green cyanobacterial layer, nor the red, purple, or green layers indicative of purple nonsulfur, purple sulfur, and green sulfur bacteria, respectively. These groups are dependent on light for growth, and therefore unable to grow in the dark.
The precise results of each Winogradsky column will vary widely with their incubation conditions and their source habitats.
1. Microbial communities originating from freshwater habitats will not be accustomed to high salt concentrations and the addition of salt may slow down or inhibit growth. Conversely, there may be sufficient halophilic bacteria in brackish and saltwater habitats so that the addition of salts makes no difference or even enhances the growth of particular layers when compared to a column without added salts.
2. Sandy sediments are more porous than muddy sediments. If enough sulfide is produced in such porous sediments, sulfides can diffuse all the way to the top of the column and inhibit growth of aerobic organisms. In this case, the column may only contain layers indicative of anaerobes and may not contain any aerobes, such as the cyanobacteria.
3. Freshwater generally contains less sulfate than saltwater. Sulfate is important for the growth of sulfate-reducing bacteria. Sulfate reducers create sulfide as a byproduct and are indicated by the development of a black layer in the bottom of the column. If sulfate is not supplemented to freshwater communities, sulfate reducers may not produce enough sulfide. The creation of the sulfide byproduct is important for the growth of green and purple sulfur bacteria and the nonphotosynthetic sulfur oxidizers. In these cases, sulfur oxidizers can still grow using the egg yolk as a source of sulfur, even if the sulfate reducers (black layer) never develop.
4. Different wavelengths of light should select for organisms with different absorption pigments. A column kept in the dark will only allow for nonphotosynthetic organisms to grow, including sulfate reducers, iron oxidizers, and methanogens. Photosynthesizers have pigments that absorb light at different wavelengths within the visible range (~400-700nm). By covering a column with, for example, blue cellophane, blue light (~450-490nm) is blocked from entering the column. All of the photosynthesizers in the column have pigments which require the blue wavelengths (6) and their growth should be inhibited. On the other hand, red cellophane will block light of ~635-700nm. These wavelengths are important for the pigments used by cyanobacteria (6), while purple sulfur, green sulfur, and purple nonsulfur bacteria may still be able to grow.
5. Different microbial communities may have vastly different adaptive abilities to cope with changes in temperatures. High temperatures can enhance rates of microbial activity when sufficient thermophiles are present. On the other hand, in the absence of thermophiles, high temperatures may decrease overall microbial activity. Similarly, low temperatures may decrease overall microbial activity unless the microbial community contains sufficient psychrophiles.

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Die meisten Mikroorganismen der Erde können nicht in einem Labor kultiviert werden, oft weil sie sich auf andere Mikroben innerhalb ihrer heimateigenen Gemeinschaften verlassen. Eine Winogradsky-Säule, benannt nach ihrem Erfinder Sergei Winogradsky, ist ein miniaturiges, geschlossenes Ökosystem, das die mikrobiellen Gemeinschaften innerhalb einer Sedimentprobe bereichert und es Wissenschaftlern ermöglicht, viele der Mikroben zu untersuchen, die eine wichtige Rolle in der Erdwelt spielen. biogeochemische Prozesse, ohne sie einzeln isolieren und beleben zu müssen.

Typischerweise werden Schlamm und Wasser aus einem Ökosystem, wie z. B. einem Teich oder einem Sumpf, vermischt. Als optionales Experiment kann dieser Mischung Salz hinzugefügt werden, um verschiedene halophile Arten anzureichern. Als nächstes wird ein kleiner Teil der Mischung mit Kohlenstoff ergänzt, in der Regel in Form von Zellulose aus der Zeitung, und Schwefel, in der Regel aus einem Eigelb. Für ein weiteres optionales Experiment kann dieser Mischung ein Nagel hinzugefügt werden, um bestimmte Gallionella-Arten zu bereichern. Diese neue Mischung wird dann einer transparenten Spalte hinzugefügt, sodass die Spalte ein Viertel voll ist. Schließlich wird der Rest der Schlammmischung und mehr Wasser der Säule hinzugefügt, bis sie den größten Teil des Weges voll ist.

Die Nachfolge, die sich auf die konsekutive Entwicklung verschiedener mikrobieller Gemeinschaften im Laufe der Zeit bezieht, kann in Echtzeit mit einer Winogradsky-Säule beobachtet werden. Wenn Mikroben innerhalb der Säule wachsen, verbrauchen sie bestimmte Substrate und verändern die Chemie ihrer Umgebung. Wenn ihre Substrate erschöpft sind, sterben die ursprünglichen Mikroben ab und Mikroben mit unterschiedlichen Stoffwechselbedürfnissen können in der veränderten Umgebung gedeihen. Im Laufe der Zeit beginnen sich sichtbar unterschiedliche Schichten zu bilden, die jeweils Teile einer Bakteriengemeinschaft mit unterschiedlichen mikroökologischen Bedürfnissen enthalten.

Zum Beispiel bilden photosynthetische Mikroben, die größtenteils aus Cyanobakterien bestehen, grüne oder rotbraune Schichten in der Nähe der Oberseite der Säule. Da die Photosynthese Sauerstoff produziert, der oft als Blasen im oberen Teil der Säule gesehen wird, wird ein Gradient mit den höchsten Sauerstoffkonzentrationen in der Nähe der Oberseite und dem niedrigsten nach unten gebildet. Je nach verfügbaren Substraten können verschiedene mikrobielle Gemeinschaften in der anaeroben Bodenschicht wachsen. Blasen in dieser Schicht können auf das Vorhandensein von Methanogenen hinweisen, die durch Fermentation Methangas erzeugen. Hier führt die mikrobielle Fermentation von Zellulose zu organischen Säuren. Sulfat-Reduzierer oxidieren diese Säuren, um Sulfid zu produzieren, und ihre Aktivität wird durch schwarze Sedimente angezeigt. Sulfid diffundiert in der Spalte nach oben, wodurch ein weiterer Gradient entsteht, bei dem die Sulfidkonzentrationen am unteren Rand der Säule am höchsten und am niedrigsten in der Nähe der Spitze sind. In der Mitte der Säule nutzen Schwefeloxidatoren den Sauerstoff von oben und Sulfid von unten. Bei ausreichendem Licht entwickeln sich photosynthetische Schwefeloxidatoren wie grüne und violette Schwefelbakterien. Grüne Schwefelbakterien vertragen höhere Sulfidkonzentrationen. So wachsen sie direkt unter den violetten Schwefelbakterien. Direkt über dieser Schicht bilden violette nicht schwefelhaltige Bakterien eine rot-orange Schicht. Nichtphotosynthetische Schwefeloxidatoren werden durch das Vorhandensein von weißen Filamenten angezeigt.

Bedingungen wie Licht und Temperatur können auch variiert werden, um andere Gemeinschaften zu bereichern. In diesem Video erfahren Sie, wie Sie eine Winogradsky-Säule konstruieren und die Wachstumsbedingungen und Substrate variieren, um bestimmte mikrobielle Gemeinschaften zu bereichern.

Suchen Sie zunächst ein geeignetes aquatisches Ökosystem, z. B. einen Teich oder Sumpf. Die Sedimentproben sollten aus dem Bereich in der Nähe des Wasserrandes stammen und vollständig mit Wasser gesättigt sein. Dann verwenden Sie eine Schaufel und einen Eimer, um ein bis zwei Liter des gesättigten Schlamms zu sammeln. Als nächstes erhalten Sie etwa drei Liter Frischwasser aus der gleichen Quelle und kehren mit den Feldproben ins Labor zurück.

Legen Sie im Labor die entsprechende persönliche Schutzausrüstung an, einschließlich Labormantel und Handschuhe. Nun ca. 750 Milliliter Schlamm in eine Mischschüssel geben. Dann durchsieben sie den Schlamm, um große Felsen, Zweige oder Blätter zu entfernen und einen Löffel zu verwenden, um Klumpen auseinander zu brechen. Als nächstes etwas frisches Wasser in die Rührschüssel geben und mit einem großen Löffel umrühren. Fügen Sie Wasser hinzu, bis die Konsistenz der Wasser-Schlamm-Mischung einem Milchshake ähnelt. Fahren Sie fort, um sicherzustellen, dass es keine Klumpen gibt.

Als optionales Experiment wählen Sie für halophile Bakterien, indem Sie 25 bis 50 Milligramm Salz in die Schlammmischung geben.

Dann ca. 1/3 der Wasser-Schlamm-Mischung in eine zweite Mischschüssel geben. Fügen Sie ein Eigelb und eine Handvoll geschredderter Zeitung in die Schüssel. Fügen Sie als Nächstes diese Mischung zur Spalte hinzu, bis sie etwa 1/4 voll ist. Als nächstes fügen Sie die Wasser-Schlamm-Mischung ohne Ei und Zeitung in die Spalte, bis sie etwa 3/4 voll ist. Fügen Sie dann mehr Wasser in die Spalte ein, sodass ein 1/2 Zoll Leerraum oben bleibt. Bedecken Sie die Säule mit Plastikfolie und befestigen Sie sie mit einem Gummiband.

Inkubieren Sie die Säule in der Nähe eines Fensters bei Raumtemperatur für die nächsten vier bis acht Wochen. Während der gesamten Inkubationszeit, überwachen Veränderungen in der Winogradsky-Säule mindestens einmal pro Woche für die Entwicklung von verschiedenen farbigen Schichten und die Bildung von Blasen. Zeichnen Sie außerdem die Zeit auf, die für die Entwicklung verschiedener Layer benötigt wird.

Eine weitere Modifikation, die durchgeführt werden kann, ist die Inkubation der Säule in der Nähe eines Heizkörpers, um für thermophile Bakterien zu wählen, oder in einem Kühlschrank für psychophile Bakterien zu wählen. Variieren Sie die Lichtverhältnisse, indem Sie verschiedene Säulen in hohes Licht, schwaches Licht oder Dunkelheit legen, um zu bebrüten. Alternativ können Sie die Wellenlänge des einfallenden Lichts begrenzen, indem Sie die Säule mit verschiedenen Zellophantönen abdecken, um zu bestimmen, welche Farben für verschiedene Bakteriengruppen ausgewählt werden. Für ein weiteres optionales Experiment, eisenoxidierende Bakterien anzureichern, fügen Sie einen Nagel in das Schlamm-Wasser-Gemisch vor dem Zusatz von Zeitung und Eigelb.

Nach ein bis zwei Wochen wird das Wachstum der cyanobakteriellen Schicht durch einen grün-rot-braunen Film auf der Schlammschicht der klassischen Winogradsky-Säule angezeigt. Im Laufe der Zeit wird das Aussehen und die Entwicklung der verschiedenen Schichten überwacht, die jeweils auf die verschiedenen Arten von Bakterien hinweisen. Wenn wir eine im Dunkeln gewachsene Säule mit einer traditionellen Winogradsky-Säule vergleichen, sehen wir, dass die dunkle Behandlung die schwarze Schicht am unteren Rand der Säule ergibt, was auf sulfatreduzierende Bakterien hindeutet.

Die dunkle Säule kann je nach anderen Inkubationsbedingungen auch andere Schichten ergeben. Darüber hinaus ergibt die dunkle Säule weder die grüne cyanobakterielle Schicht noch die roten, violetten oder grünen Schichten, die auf violette Nicht-Schwefel-, violette Schwefel- und grünschwefelbakterien hinweisen. Diese Gruppen sind für das Wachstum auf Licht angewiesen.

Results

In diesem Experiment wurden Wasser und Sedimente aus einem Süßwasserlebensraum gesammelt. Zwei Winogradsky-Säulen wurden konstruiert und konnten sich entwickeln: eine klassische Winogradsky-Säule, die bei Raumtemperatur im Licht inkubiert wurde (Abb. 2A) und eine Winogradsky-Säule, die im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert wurde (Abb. 2B).

Abbildung 2B: Ein Foto der klassischen Winogradsky-Säule (links), die 68 Tage lang bei Raumtemperatur im Licht inkubiert wurde, und eine Winogradsky-Säule, die 68 Tage lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert wurde (rechts).

Nachdem sich die Säulen 7-9 Wochen lang entwickeln konnten, können die Schichten in der klassischen Säule mit der im Dunkeln inkubierten Säule verglichen werden (Abb. 2B). In der klassischen Winogradsky-Säule kann eine grüne cyanobakterielle Schicht in der Nähe der Oberseite des Rohres beobachtet werden. In der Nähe der Mitte der Röhre kann eine rot-violette Schicht beobachtet werden, die auf violette Nicht-Schwefelbakterien hinweist. Unter dieser Schicht wird eine lila-rote Schicht beobachtet, die auf violette Schwefelbakterien hinweist. Direkt unter dieser Schicht kann schwarzes Sediment im anaeroben Bereich der Säule beobachtet werden, was auf sulfatreduzierende Bakterien hindeutet.

Die im Dunkeln gewachsene Säule (Abb. 2B) entwickelte sich anders als die klassische Winogradsky-Säule. Wie die klassische Säule ergab die dunkle Säule schwarzeSedimente in der Nähe des unteren Bodens der Säule, was auf sulfatreduzierende Bakterien hindeutet. Die dunkle Säule ergab weder die grüne cyanobakterielle Schicht noch die roten, violetten oder grünen Schichten, die auf violetten Nichtschwefel, violetten Schwefel und grüne Schwefelbakterien hindeuten. Diese Gruppen sind für das Wachstum auf Licht angewiesen und daher nicht in der Lage, im Dunkeln zu wachsen.

Die genauen Ergebnisse jeder Winogradsky-Säule variieren stark mit ihren Inkubationsbedingungen und ihren Quelllebensräumen.

Mikrobielle Gemeinschaften aus Süßwasserlebensräumen werden nicht an hohe Salzkonzentrationen gewöhnt sein, und die Zugabe von Salz kann das Wachstum verlangsamen oder hemmen. Umgekehrt kann es genügend halophile Bakterien in Brack- und Salzwasser-Lebensräumen geben, so dass die Zugabe von Salzen keinen Unterschied macht oder sogar das Wachstum bestimmter Schichten im Vergleich zu einer Säule ohne zugesetzte Salze verbessert.

Sandige Sedimente sind poröser als schlammige Sedimente. Wenn in solchen porösen Sedimenten genügend Sulfid produziert wird, können Sulfide bis zur Spitze der Säule diffundieren und das Wachstum aeroben Organismen hemmen. In diesem Fall darf die Säule nur Schichten enthalten, die auf Anaerobe hinweisen, und keine Aeroben, wie z. B. die Cyanobakterien, enthalten.

Süßwasser enthält in der Regel weniger Sulfat als Salzwasser. Sulfat ist wichtig für das Wachstum von sulfatreduzierenden Bakterien. Sulfat-Reduzierer erzeugen Sulfid als Nebenprodukt und werden durch die Entwicklung einer schwarzen Schicht im unteren Teil der Säule angezeigt. Wenn Sulfat nicht zu Süßwassergemeinschaften ergänzt wird, sulfatreduzierende möglicherweise nicht genug Sulfid produzieren. Die Herstellung des Sulfid-Nebenprodukts ist wichtig für das Wachstum von grünen und violetten Schwefelbakterien und den nichtphotosynthetischen Schwefeloxidatoren. In diesen Fällen können Schwefeloxidbere immer noch mit dem Eigelb als Schwefelquelle wachsen, auch wenn sich die Sulfat-Reduzierer (schwarze Schicht) nie entwickeln.

Unterschiedliche Wellenlängen des Lichts sollten für Organismen mit unterschiedlichen Absorptionspigmenten ausgewählt werden. Eine im Dunkeln gehaltene Säule lässt nur nichtphotosynthetische Organismen wachsen, einschließlich Sulfat-Reduzierern, Eisenoxidatoren und Methanogenen. Photosynthesizer haben Pigmente, die Licht bei unterschiedlichen Wellenlängen innerhalb des sichtbaren Bereichs absorbieren (ca. 400-700nm). Durch das Bedecken einer Säule mit z. B. blauem Zellophan wird blaues Licht (ca. 450-490nm) am Betreten der Säule gehindert. Alle Photosynthesizer in der Säule haben Pigmente, die die blauen Wellenlängen (6) erfordern und ihr Wachstum sollte gehemmt werden. Auf der anderen Seite blockiert rotes Zellophan Licht von 635-700nm. Diese Wellenlängen sind wichtig für die Pigmente, die von Cyanobakterien (6) verwendet werden, während lila Schwefel, grüner Schwefel und violette Nicht-Schwefelbakterien noch wachsen können.

Verschiedene mikrobielle Gemeinschaften können sehr unterschiedliche Anpassungsfähigkeiten haben, um mit Temperaturschwankungen fertig zu werden. Hohe Temperaturen können die Rate der mikrobiellen Aktivität erhöhen, wenn genügend Thermophile vorhanden sind. Auf der anderen Seite können hohe Temperaturen in Ermangelung von Thermophilen die gesamte mikrobielle Aktivität verringern. In ähnlicher Weise können niedrige Temperaturen die gesamte mikrobielle Aktivität verringern, es sei denn, die mikrobielle Gemeinschaft enthält genügend Psychrophile.

Applications and Summary

Die Winogradsky-Säule ist ein Beispiel für ein interdependentes mikrobielles Ökosystem. Nach dem Mischen von Schlamm, Wasser und zusätzlichen Kohlenstoff- und Schwefelsubstraten in einer vertikalen Säule sollte sich das geschichtete Ökosystem über mehrere Wochen in getrennte, stabile Zonen stabilisieren. Diese Zonen werden von verschiedenen Mikroorganismen besetzt, die an einer bestimmten Stelle entlang des Gradienten zwischen dem sulfidreichen Sediment im Boden und dem sauerstoffreichen Sediment an der Spitze gedeihen. Durch die Manipulation der Bedingungen und Substrate innerhalb der Winogradsky-Säule, das Vorhandensein und die Aktivität von verschiedenen Mikroorganismen wie Halophile, Thermophile, Psychronophile, Schwefeloxidatoren, Schwefel-Reduzierer, Eisenoxidatoren und Photosynthesizer beobachtet werden.

References

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Transcript

Most of the Earth’s microorganisms cannot be cultured in a lab, often because they rely on other microbes within their native communities. A Winogradsky column, named for its inventor Sergei Winogradsky, is a miniature, enclosed ecosystem which enriches the microbial communities within a sediment sample, enabling scientists to study many of the microbes that play a vital role in Earth’s biogeochemical processes, without needing to isolate and culture them individually.

Typically, mud and water from an ecosystem, such as a pond or a marsh, are mixed. As an optional experiment, salt can be added to this mixture to enrich various halophile species. Next, a small portion of the mixture is supplemented with carbon, usually in the form of cellulose from newspaper, and sulfur, usually from an egg yolk. For another optional experiment, a nail can be added to this mixture to enrich certain Gallionella species. This new mixture is then added to a transparent column, so that the column is one quarter full. Finally, the rest of the mud mixture and more water is added to the column until it is most of the way full.

Succession, which refers to the consecutive development of different microbial communities over time, can be observed in real time with a Winogradsky column. As microbes grow within the column, they consume specific substrates and change the chemistry of their environment. When their substrates are depleted, the original microbes die off and microbes with different metabolic needs can flourish in the altered environment. Over time, visibly distinct layers begin to form, each containing parts of a bacterial community with different microenvironmental needs.

For example, photosynthetic microbes, largely composed of cyanobacteria, form green or red-brown layers near the top of the column. Since photosynthesis produces oxygen, often seen as bubbles in the top portion of the column, a gradient is formed with the highest oxygen concentrations near the top, and the lowest towards the bottom. Depending upon the available substrates, different microbial communities can grow in the anaerobic bottom layer. Bubbles in this layer can indicate the presence of methanogens, which create methane gas via fermentation. Here, the microbial fermentation of cellulose results in organic acids. Sulfate reducers oxidize those acids to produce sulfide, and their activity is indicated by black sediment. Sulfide diffuses upward in the column, creating yet another gradient where sulfide concentrations are highest towards the bottom of the column, and lowest near the top. Towards the middle of the column, sulfur oxidizers utilize the oxygen from above and sulfide from below. With adequate light, photosynthetic sulfur oxidizers, such as green and purple sulfur bacteria, develop. Green sulfur bacteria tolerate higher sulfide concentrations. Thus, they grow directly below the purple sulfur bacteria. Directly above this layer, purple non-sulfur bacteria form a red-orange layer. Nonphotosynthetic sulfur oxidizers are indicated by the presence of white filaments.

Conditions such as light and temperature can also be varied to enrich other communities. In this video, you will learn how to construct a Winogradsky column, and vary the growing conditions and substrates to enrich specific microbial communities.

First, locate an appropriate aquatic ecosystem, such as a pond or marsh. The sediment samples should come from the area near the water’s edge, and be completely saturated with water. Then, use a shovel and a bucket to collect one to two liters of the saturated mud. Next, obtain approximately three liters of fresh water from the same source and return to the lab with the field samples.

In the lab, put on the appropriate personal protective equipment, including a lab coat and gloves. Now, transfer approximately 750 milliliters of mud to a mixing bowl. Then, sift through the mud to remove large rocks, twigs, or leaves and use a spoon to break apart any clumps. Next, add some of the fresh water to the mixing bowl, and stir with a large spoon. Add water until the consistency of the water-mud mixture is similar to a milkshake. Continue to make sure there are no clumps.

As an optional experiment, select for halophilic bacteria by adding 25 to 50 milligrams of salt to the mud mixture.

Then, transfer approximately 1/3 of the water-mud mixture to a second mixing bowl. Add one egg yolk and a handful of shredded newspaper to the bowl. Next, add this mixture to the column, until it is about 1/4 full. Next, add the water-mud mixture without the egg and newspaper to the column, until it is approximately 3/4 full. Then, add more water to the column, leaving a 1/2 inch space on top. Cover the column with plastic wrap and secure it with a rubber band.

Incubate the column in the light near a window at room temperature for the next four to eight weeks. Throughout the incubation period, monitor changes in the Winogradsky column at least once a week for the development of different colored layers and the formation of bubbles. Additionally, record the time it takes for different layers to develop.

Another modification that can be done is incubating the column near a radiator to select for thermophilic bacteria, or in a refrigerator to select for psychrophilic bacteria. Vary the light conditions by placing different columns in high light, low light, or darkness to incubate. Alternatively, limit the wavelength of incoming light by covering the column with different shades of cellophane to determine which colors select for different bacterial groups. For another optional experiment, to enrich iron-oxidizing bacteria, add a nail to the mud-water mixture prior to the addition of newspaper and an egg yolk.

After one to two weeks, growth of the cyanobacterial layer is indicated by a green or red-brown film on top of the mud layer of the classical Winogradsky column. Over time, the appearance and evolution of the different layers is monitored, each indicative of the different types of bacteria present. When comparing a column grown in the dark to a traditional Winogradsky column, we see the dark treatment yields the black layer at the bottom of the column, indicative of sulfate-reducing bacteria.

The dark column may also yield other layers, depending on other incubation conditions. Additionally, the dark column doesn’t yield the green cyanobacterial layer, nor the red, purple, or green layers indicative of purple non-sulfur, purple sulfur, and green sulfur bacteria respectively. These groups are dependent on light for growth.

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