Serielle Verdünnungen und Ausplattieren: Auszählung von Mikrobiom

1. Einrichtung

1. Ein Flussdiagramm mit allen Materialien, einem schrittweisen Versuchsprotokoll und einer Methode zum Entsorgen von Verbrauchsmaterialien sollte in ein Labornotizbuch geschrieben und in der Nähe des experimentellen Arbeitsbereichs aufbewahrt werden.
2. Arbeitsbereiche sollten mit einem geeigneten Antiseptikum (70% Ethanol) sterilisiert werden, und der Experimentator sollte das Kontaminationsrisiko durch das Tragen sauberer Laborkleidung verringern, die sie auch vor Expositionsanomalien schützt. Geeignete Kleidungsstücke umfassen, sind aber nicht beschränkt auf laborkleidung, Latex- oder Nitrilhandschuhe, Googles, Atemschutzgeräte und geschlossene Schuhe. Es ist wichtig, die aseptische Technik jederzeit aufrechtzuerhalten.
3. Bereiten Sie 90 ml mit 0,45% Saline vor. Mit einem sauberen abgestuften Zylinder 90 ml steriles Wasser messen und in einen sauberen Erlenmeyerkolben mit der Bezeichnung 0,45% Salzwassergeben. Wiegen Sie .405 g Natriumchlorid (Sigma-Aldrich NaCl S9888) und fügen Sie es dem Kolben mit der Bezeichnung 0,45% Saline hinzu. Immer wieder wirbeln, bis keine Lösung sichtbar bleibt.
4. Nach Abschluss sollte der Experimentator alle Oberflächen neu sterilisieren und unerwünschte Organismen, Verdünnungsvorräte, Petrischalen oder Einweg-Impfschleifen gemäß den OSHA-Richtlinien entsorgen. Laborkleidung kann vor dem Händewaschen entfernt werden.

2. Medienvorbereitung

1. Wählen Sie Medien aus, die für die Kultivierung eines gewünschten Organismus geeignet sind. In den meisten Szenarien würde eine Brühe ein ausreichendes Bakterienwachstum ermöglichen. Da hier Organismen aus einem Winogradsky-Protokoll gewünscht werden, wurde eine Kolonne aus Calciumcarbonat, Schwefel, Zellulose und Schlamm zusammengebaut und 7 Tage lang ungestört gelassen. Die vorgenannte Säule ist in aerobe, mikroaerophile und anaerobe Abschnitte unterteilt.
2. Wählen Sie ein Medium, das für die Beschichtung des Organismus von Interesse geeignet ist. Die Supplementierung von flüssigen Medien mit mikrobiologischen Agar wird in der Regel als Erstarrungsmittel verwendet. LB Medium/Agar ist ausreichend, wenn Proben aus aeroben, mikroaerophilen und anaeroben Regionen der vorgenannten Säule geerntet werden. Hinweis: Proben aus der mikroaerophilen Region wurden für dieses Verfahren nicht geerntet. Diese Organismen sollten jedoch in Kerzengläsern angebaut werden. Die Einführung einer Kerze in diese Kultivierungskammer vor dem Versiegeln schafft eine sauerstoffarme Umgebung, die für die mikroaerophile Proliferation geeignet ist.
3. Da wir 250 ml vorbereiten möchten, verwenden Sie 500 ml (oder größere) Erlenmeyerkolben, um ein Überkochen beim Autoklavieren zu verhindern. Beschriften Sie eine "Broth" und die andere "Agar".
4. Bestimmen Sie die Menge an Medien, die zum Erstellen jeder Lösung erforderlich sind, indem Sie den Konzentrationsempfehlungen des Herstellers folgen. LB Agar, hier verwendet, wird durch die Kombination von 25g/L mit Reinstwasser hergestellt. Unser Volumen von 250 ml erfordert eine Lösung von 6,25 LB Agar/250 ml Wasser. In ähnlicher Weise wird LB Broth durch die Kombination des gleichen Verhältnisses von LB Broth und Wasser hergestellt. Da es nicht mit einem Erstarrungsmittel ergänzt wird, wird es nicht verhärten, wenn es gekühlt wird.
5. Wiegen Sie die Medien und mischen Sie es mit Wasser in Proportionen, die den Herstellerempfehlungen entsprechen. Fügen Sie 6,25 g LB Agar zu einem Kolben mit der Bezeichnung "Agar" und 6,25 g LB Broth zu einem Kolben mit der Bezeichnung "Broth" hinzu. Fügen Sie 250 ml Reinstwasser in jeden Kolben.
6. Aluminiumfolie über jeden Kolben wickeln und mit einem Autoklaven Medien mindestens 15 Minuten bei 121°C, 15 psi sterilisieren.
7. Mit einem hitzebeständigen Handschuh oder Pad entfernen Sie die Kolben aus dem Autoklaven, wenn der Zyklus abgeschlossen ist, und legen Sie sie in ein 40-50°C Wasserbad.
8. Sobald die entsprechende Temperatur erreicht ist, gießen Sie den Inhalt des Kolbens mit der Aufschrift "Broth" in einen 250 ml Erlenmeyer oder Rundbodenkolben. Beschriften Sie den 250 ml Kolben als "Lösung₀".
9. Erhalten Sie 10, 100mm x 15 mm sterile Petrischalen und kennzeichnen Sie sie mit dem Datum, dem Namen, der Art der verwendeten Medien und der Winogradsky-Säulenzone, aus der Organismen geerntet werden.
10. Entfernen Sie den Kolben mit der Aufschrift "Agar" aus dem Wasserbad und beginnen Sie, in jede der 10 Petrischalen zu gießen. Jedes Gericht sollte nicht mehr als 15 ml zugesetzt werden. Dies kann auch mit einem Pipettentor und einer 25 ml serologischen Pipette durchgeführt werden, um die Genauigkeit zu verbessern. Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze, um vorhandene Blasen zu entfernen, und decken Sie dann mit den Plattendeckeln ab und lassen Sie sie über Nacht erstarren.

3. Verdünnende Zubereitung

1. Bereiten Sie zehn Reagenzgläser vor, die 20 ml oder mehr in einem Rack lagern können, und beschriften Sie sie T1-T10. Jede Rohrnummer entspricht dem Verdünnungsfaktor, dem sie entspricht (d. h. T4 = 1x10^-4 oder 0,0001 oder 1/10.000der der Lagerkonzentration).
2. Pipetten 9 ml von 0,45% Saline in jedes der 10 Reagenzgläser.
3. Saline-Rohlinge sind nun bereit, durch Autoklaven sterilisiert zu werden. Verwenden Sie Aluminiumfolie, um jedes der 10 Reagenzgläser zu bedecken und dann in ein autoklavkompatibles Reagenzglasregal zu übertragen. Mindestens 15 Minuten bei 121°C, 15 psi sterilisieren.
4. Entfernen Sie Die Rohlinge mit hitzebeständigen Handschuhen und lassen Sie sie abkühlen. Bedecken und lagern Sie bei 4°C, bis sie benötigt werden, wenn die Rohre Raumtemperatur erreicht haben, oder wenn sie zum Anfassen abkühlen.

4. Kultivierung des Zielorganismus

1. "Lösung₀" mit einer einzigen Kolonie aus einer zuvor gestreiften Platte oder 50 l eines gefrorenen Bestands impfen. Erlauben Sie dem Zielorganismus Zeit, sich zu replizieren, indem Sie geimpfte "Lösung_0"über Nacht mit Schütteln (falls erforderlich) in einen 37°C-Inkubator legen. (Hinweis: Der Kolben sollte abgedeckt werden, um eine Kontamination zu verhindern. Wenn der Zielorganismus aerob ist, verwenden Sie sterile Gaze und Baumwollstecker, um eine Kontamination zu verhindern. Wenn Sie Regionen der Winogradsky-Säule bewerten, entfernen Sie einfach 1 Gramm aus jeder gewünschten Zone (aerobe und anaerobe für die Zwecke dieser Studie) und setzen Sie in T1 erneut ab, bevor Sie mit Schritt 5.3 fortfahren.

5. Serielle Verdünnung

1. Den Kolben mit der Aufschrift "Nährstoffbrühe" aus dem Inkubator beziehen und kräftig schütteln.
2. Pipetten 1 ml "Lösung_0"in das Reagenzglas mit der Bezeichnung T1. Vortex T1. Bei der Bewertung von Winogradsky-Explants 1 Gramm der gewünschten Zone wiegen und vor dem Wirbeln zu T1 hinzufügen. (Hinweis: Hier wird aus Gründen der Einfachheit 1 ml verwendet - es können auch kleinere oder größere Verdünnungsvolumina verwendet werden).
3. Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T1 und fügen Sie es dem Reagenzglas T2 hinzu. Vortex T2.
4. Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T2 und fügen Sie es dem Reagenzglas T3 hinzu. Vortex T3.
5. Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T3 und fügen Sie es dem Reagenzglas T4 hinzu. Vortex T4.
6. Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T4 und fügen Sie es dem Reagenzglas T5 hinzu. Vortex T5.
7. Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T5 und fügen Sie es dem Reagenzglas T6 hinzu. Vortex T6.
8. Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T6 und fügen Sie es dem Reagenzglas T7 hinzu. Vortex T7.
9. Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T7 und fügen Sie es dem Reagenzglas T8 hinzu. Vortex T8.
10. Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T8 und fügen Sie es dem Reagenzglas T9 hinzu. Vortex T9.
11. Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T9 und fügen Sie es dem Reagenzglas T10 hinzu.

6. Verbreitung Plating

1. 100 l einer verdünnten Probe aus T1 direkt auf eine Petrischale. Dieser Schritt kann, muss aber nicht für jedes Rohr wiederholt werden.
2. Erhalten Sie einen sterilen Einweg-Streustab oder Flamme sterilisieren eine Glasstreustange. Gleiten Sie in einer Bewegung im Uhrzeigersinn/gegen den Uhrzeigersinn den horizontalen Teil der Streustange, um die Probe gleichmäßig innerhalb der Petrischale zu verteilen.
3. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Zone der Winogradsky-Spalte, die ausgewertet werden soll.
4. Inkubieren Sie Platten in einem 37°C Inkubator für 24 Stunden. Verwenden Sie für anaerobe Organismen eine anaerobe Kammer.

7. Streaking

1. Wählen Sie eine geeignete Verdünnung Ihres Zielorganismus aus. Beispielsweise ergibt Lösung₄ eine 1/10.000. Verdünnung Ihrer Anfangskonzentration. Typischerweise werden Verdünnungen von 1/1.000^th (T3/Lösung), 1/1.000.000^th (T6/Lösung₆) und 1/1,000,000,000^th (T9/Lösung₉) ausgewertet, um Mikroben aufzuzählen.
2. Mit einer sterilen Einweg-Impfschleife aus Kunststoff oder einer wiederverwendbaren Metall-Impfschleife, die seit nicht weniger als 10 Sekunden unter Beschuss steht, tauchen Sie ab Schritt 5 in die gewünschte Lösung ein. Kalibrierte Impfschleifen sollten 0,01 ml übertragen. (Achtung: Lassen Sie nicht zulassen, dass geflammte Schleife Bakterien sofort nach dem Entfernen von der Hitze kontaktieren)
3. Die Petrischalenabdeckung auf einer Seite leicht anheben, so dass nur die Impfschlaufe auf den Agar zugreifen kann. Gleiten Sie die Impfschleife über die Oberseite der Medien in einer Zick-Zack-Manier, um darauf zu achten, den Agar nicht zu kompromittieren. Senken Sie den Petrischalendeckel.
4. Verwenden Sie eine neue Einweg-Impfschleife oder sterilisieren Sie Ihre wiederverwendbare Schleife erneut.
5. Drehen Sie die Platte um etwa 1/3^rd (ca. 118°) und reduzieren Sie die Frequenz der Zick-Zack-Bewegung.
6. Verwenden Sie erneut eine neue Einwegschleife oder sterilisieren Sie eine Metallschleife, bevor Sie sich ein letztes Mal drehen, und reduzieren Sie die Zick-Zack-Frequenz erneut. Senken Sie den Petrischalendeckel.
7. Wiederholen Sie die Schritte 7.2 - 7.6, bis mindestens drei Petrischalen für drei verschiedene Verdünnungen gestreift wurden, indem sie eine neue Einwegschleife verwenden oder eine wiederverwendbare Schleife erneut entzünden (Abbildung 2).
8. Die gestreiften Petrischalen über Nacht in einen 37°C-Inkubator geben. Für anaerobe Organismen verwenden Sie eine anerobische Kammer.

8. Datenanalyse und Ergebnisse

1. Kulturen wurden aus den oxischen und anoxischen Zonen einer 7-tägigen Winogradsky-Säule geerntet. Diese Zonen eignen sich für heterotrophe bzw. eisenoxidierende Anaeraare.
2. Säulenexplants wurden vor dem Streichen oder Ausbreiten auf LB Agar-Platten seriell verdünnt.
3. Streaking ergab eine gemischte Population aus jeder der bewerteten Winogradsky-Zonen. Streuplatten führten zu ähnlichen Ergebnissen.
4. Um KBE/ml oder KBE/g zu berechnen, durchschnittlich die Anzahl der gezählten Kolonien aus drei Platten. Multiplizieren Sie die durchschnittliche Anzahl der Kolonien mit dem Verdünnungsfaktor und dividieren Sie durch den Betrag aliquoted. Wenn beispielsweise durchschnittlich 65 Kolonien auf Platten gezählt würden, die mit 0,1 ml Lösung₆ (T6) geimpft wurden, würde die zuvor beschriebene Formel 650.000.000 KBE/ml entsprechen.
5. Isolierte Kolonien können nun aus jeder Platte ausgewählt werden, um sie in Anreicherungstests zu verwenden, um die Artenidentität zu bestimmen.