Anreicherungskulturen: Kultivieren von aeroben und anaeroben Mikroben auf selektiven und differenziellen Medien

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Enrichment Cultures: Culturing Aerobic and Anaerobic Microbes on Selective and Differential Medias

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09:35 min
April 30, 2023

Übersicht

Quelle: Christopher P. Corbo1, Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1
1 Department of Biological Sciences, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301

Prokaryotische Zellen sind in der Lage, fast jede Umgebung auf diesem Planeten zu bewohnen. Als Königreich besitzen sie eine große metabolische Vielfalt, die es ihnen ermöglicht, eine Vielzahl von Molekülen für die Energieerzeugung zu verwenden (1). Daher müssen bei der Kultivierung dieser Organismen im Labor alle notwendigen und spezifischen Moleküle, die zur Energiegewinnung erforderlich sind, in den Wachstumsmedien bereitgestellt werden. Während einige Organismen metabolisch vielfältig sind, sind andere in der Lage, in extremen Umgebungen wie hohen oder niedrigen Temperaturen, alkalischen und sauren pH-Werten, reduzierten oder sauerstoffarmen Umgebungen oder Umgebungen mit hohem Salzgehalt (2,3,4) zu überleben. Diese Organismen, die als “Extremophile” bezeichnet werden, erfordern oft, dass sich diese intensiven Umgebungen ausbreiten. Wenn Wissenschaftler versuchen, solche Organismen zu züchten, müssen die Medienkomponenten sowie spezifische Umweltbedingungen berücksichtigt werden, um die Voninteresseer erfolgreich zu kultivieren.

Wissenschaftler sind in der Lage, kultivierbare Organismen im Labor anzubauen, weil sie die spezifischen Anforderungen verstehen, die diese Arten brauchen, um zu wachsen. Kultikörnbare Organismen machen jedoch weniger als 1 % der Arten aus, die sich schätzungsweise auf dem Planeten befinden (5). Organismen, die wir durch Gensequenzierung nachgewiesen haben, aber nicht im Labor wachsen können, gelten als unkultibilierbar (6). Zu diesem Zeitpunkt wissen wir nicht genug über den Stoffwechsel und die Wachstumsbedingungen dieser Organismen, um ihre Umgebung im Labor zu replizieren.

Schnelle Organismen liegen irgendwo zwischen den beiden ehemaligen. Diese Organismen sind kultivierbar, erfordern aber sehr spezifische Wachstumsbedingungen, wie z. B. spezifische Wachstumsmedienkomponenten und/oder spezifische Wachstumsbedingungen. Zwei Beispiele für solche Gattungen sind Neisseria sp. und Haemophilus sp., die beide teilweise abgebaute rote Blutkörperchen (auch als Schokoladenagar bekannt) sowie spezifische Wachstumsfaktoren und ein an Kohlendioxid reiches Umfeld erfordern (7). Ohne alle erforderlichen spezifischen Komponenten werden diese Organismen überhaupt nicht wachsen. Oft, selbst mit all ihren Anforderungen, wachsen diese Organismen schlecht.

Im Gegensatz zu eukaryotischen Zellen, die nur in einer aeroben oder sauerstoffhaltigen Umgebung wachsen können, sind prokaryotische Zellen in der Lage, anaerob mit mehreren Fermentationswegen zu wachsen, um reichlich Energie zu erzeugen (8). Andere Prokaryoten bevorzugen eine mikroaerophile oder reduzierte Sauerstoffumgebung oder sogar eine kapnophile oder hohe Kohlendioxidumgebung (9). Diese Organismen sind schwieriger zu bereichern, da die Atmosphäre verändert werden muss. Wissenschaftler, die häufig mit Organismen arbeiten, die empfindlich auf eine sauerstoffhaltige Umgebung reagieren, würden normalerweise in einer anaeroben Kammer und einem Inkubator arbeiten, wo ein schweres, inertes Gas wie Argon eingepumpt wird, um den Sauerstoff zu verdrängen (10). Andere nutzen konventionell verfügbare versiegelte Gaspaketsysteme, die Wasser zur Erzeugung von Wasserstoff und Kohlendioxid verwenden, zusammen mit einem Katalysator wie Palladium, um den gesamten Luftsauerstoff zu entfernen. Diese kommerziell erhältlichen Kits können eine der oben genannten atmosphärischen Bedingungen schaffen (10).

Ob die Kultivierung eines Krankheitserregers zur Bestimmung einer potenziellen Infektion oder die Suche nach einer bestimmten Bakterienart in einer natürlichen Umgebung, ein Problem besteht. Keine bakterienart bewohnt einen Lebensraum. Bakterien leben als mehrzellige Gemeinschaften überall von der Haut des Menschen bis zu den Ozeanen unseres Planeten (11). Bei dem Versuch, eine Bakterienart zu isolieren, müssen Wissenschaftler daran arbeiten, die zahlreichen anderen Organismen auszuschließen, die ebenfalls das isolierte Gebiet bewohnen. Aus diesem Grund erfüllen angereicherte Wachstumsmedien für Bakterien oft zwei Funktionen. Die erste besteht darin, die Medien selektiv zu machen. Ein selektiver Wirkstoff verhindert das Wachstum einiger Arten, hemmt aber nicht und fördert oft sogar andere zum Wachsen (12). Die zweite Funktion der Medienbestandteile kann sein, als Differentialmittel zu arbeiten. Solche Wirkstoffe ermöglichen die Identifizierung eines bestimmten biochemischen Merkmals eines isolierten Organismus. Durch die Kombination mehrerer verschiedener selektiver und differentialer Medien mit geeigneten Wachstumsbedingungen sind Wissenschaftler und Diagnostiker in der Lage, das Vorhandensein bestimmter Bakterienarten aus einem bestimmten Isolat zu identifizieren.

Ein Beispiel für ein selektives und differenziertes Medium, das bei der Identifizierung hilft, ist im Falle des klinisch signifikanten Organismus Staphylococcus aureus. Dieser Organismus ist in der Regel auf Mannitol Salz Agar kultiviert. Dieses Medium wählt nicht nur für Organismen, die in einer hohen Salzumgebung leben können, die einige Gramm-Positive wie Staphylokokkenenthalten, sondern hemmt auch alle Salzempfindlichen Organismen. Der Mannitolzucker ist die Differentialkomponente dieses Mediums. Von allen klinisch signifikanten Staphylococcus-Arten ist nur S. aureus in der Lage, Mannitol zu fermentieren. Diese Fermentationsreaktion erzeugt Säure als Nebenprodukt, wodurch der rote Methylrotindikator in den Medien gelb wird. Andere Staphylococcus-Arten (wie Staphylococcus epidermidis) können zwar wachsen, lassen die Medien zwar rot.

Diese Laborübung zeigt die richtige aseptische Technik, sowie die richtige Impfung von Wachstumsmedien aus Brühe. Es führt auch das Wachstum von gewöhnlichen Schadstoffen auf Anreicherungsmedien, die Verwendung eines Gaspakets anaerobe Kultursystem für anaerobe Bakterien, und die Verwendung von verschiedenen selektiven und differentialen Medien für die mutmaßliche Identifizierung von Gram positiven und gramnegativen Bakterien.

Verfahren

1. Vorbereitung Vor Beginn die Hände gründlich waschen und handschuhe in entsprechend größe anziehen. Sterilisieren Arbeitsfläche mit 5% Natriumhypochlorit (Bleichmittel) und gründlich trocknen. Legen Sie eine Impfschleife in einen leeren 120 mL Erlenmeyer Kolben, damit er die Bankspitze während der Arbeit nicht berührt. 2. Wachstumsmedien und Kulturen Sammeln Sie vier Platten Mannitol Salt Agar (MSA), Eosin Methylenblau Agar (EMB) und acht Tryptic Soja-Agar (TSA) aus dem Kühlschrank (diese können kommerziell erworben werden). Legen Sie Platten auf den gereinigten Arbeitsbereich. Sammeln Sie die folgenden BrüheKulturen: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, und Proteus vulgaris. Seien Sie vorsichtig: Da es sich um aerobe Organismen handelt, sollten die Kappen der Röhren leicht locker sein. Legen Sie alle Kulturen in einem Reagenzglasregal auf die gereinigte Arbeitsfläche. 3. Übertragung von Kulturen und Inkubation Stehen oder sitzen Sie auf der Bank mit allen Materialien in Reichweite. Um die aseptische Technik zu verwenden, um die Bakterien auf die Platte zu übertragen, zünden Sie zuerst die Schleife, bis sie orange leuchtet – und lassen Sie sie dann in der Luft abkühlen. Während die Schleife abkühlt, nehmen Sie die Brühe Kultur von E. coli, und öffnen Sie dann die Kappe mit Ihrem rosa Finger. Brennen Sie die Öffnung des Rohres schnell. Dies verhindert eine Kontamination. Tauchen Sie die Schleife in die Röhre und streifen Sie den Organismus auf den ersten Quadranten einer EMB-Platte. Nachdem der erste Streifen durchgeführt wird, flammen Sie die Schleife, und führen Sie dann einen zweiten Streifen durch, der den ersten Streifen nur ein- oder zweimal kreuzt. Dies ermöglicht die Isolierung einzelner Kolonien und um festzustellen, ob eine Kontamination vorliegt. Wiederholen Sie dies, bis alle vier Quadranten der Platte gestreift sind. Übertragen Sie nun jeden der übrigen Organismen auf die gleiche Streifenbeschichtungsweise, so dass das Endprodukt eine MSA-Platte, eine EMB-Platte und zwei separate TSA-Platten pro Organismus ist. Sobald alle Organismen übertragen wurden, flammen Sie die Schleife ein letztes Mal und legen Sie sie weg. Legen Sie 1 TSA-Platte mit jedem Organismus in die Gaspackung und schütteln Sie dann einen Gasbeutel, bevor Sie ihn in die Kammer neben den Platten legen. Dicht fest versiegeln. Alle Platten bei 37°C über Nacht inkubieren. Sterilisieren Sie die Arbeitsfläche ein letztes Mal mit 5% Bleichmittel. 4. Lese- und Aufzeichnungsergebnisse Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und legen Sie sie auf eine saubere Laborbank Beachten Sie das Wachstum der Organismen auf jedem Teller in Ihrem Labor-Notebook. Nehmen Sie insbesondere detaillierte Anmerkungen zu: Anzahl und Größe der Kolonien (falls vorhanden) auf jeder Platte, für jeden plattierten Stamm Aussehen des Agars, der alle Kolonien umgibt, die auf den MSA-Platten wachsen Aussehen von Kolonien, die auf den EMB-Platten wachsen Wachstumsunterschiede zwischen den TSA-Platten, die außerhalb des Gaspakets angebaut werden

Ergebnisse

Mannitol Salz Agar (MSA): Dieses Medium ist selektiv für grampositive Organismen, die in 6,5% Natriumchlorid überleben können. Die gramnegativen Organismen Escherichia coli und Proteus vulgaris sollten aufgrund der hohen Salzkonzentration auf diesem Medium nicht wachsen können. S. epidermidis und S. aureus sollten wachsen können. Die Medien sind unterschiedlich zwischen den beiden, weil der S. aureus in der Lage ist, das M…

Applications and Summary

Verschiedene Bakterienarten sind in der Lage, in verschiedenen Umgebungen zu wachsen und sind in der Lage, verschiedene Kohlenstoffquellen als eine Möglichkeit zur Erzeugung von Energie zu verwenden. Bei der Arbeit mit diesen als Kulturen im Labor ist es wichtig, die Komponenten der Wachstumsmedien, mit denen gearbeitet wird, zu kennen und die Wachstumsmedien an die Bakterienarten anzugleichen. Wissenschaftler und Diagnostika können die unterschiedlichen biochemischen Reaktionen auch nutzen, um verschiedene Arten von a…

Referenzen

  1. Fernandez, L. A. Exploring prokaryotic diversity: there are other molecular worlds. Molecular Microbiology, 55 (1), 5-15 (2005).
  2. Grattieri, M., Suvira, M., Hasan, K., & Minteer, S. D. Halotolerant extremophile bacteria from the Great Salt Lake for recycling pollutants in microbial fuel cells. Journal of Power Sources, 356, 310-318 (2017).
  3. Wendt-Potthoff K. & Koschorreck, M. Functional Groups and Activities of Bacteria in a Highly Acidic Volcanic Mountain Stream and Lake in Patagonia, Argentina. Microbial Ecology, 1, 92 (2002).
  4. Lee, L. S., Goh, K. M., Chan, C. S., Annie Tan, G. Y., Yin, W.-F., Chong, C. S., & Chan, K.-G. Microbial diversity of thermophiles with biomass deconstruction potential in a foliage-rich hot spring. Microbiology Open, 7 (6), e00615 (2018)
  5. Ito, T., Sekizuka, T., Kishi, N., Yamashita, A., & Kuroda, M. Conventional culture methods with commercially available media unveil the presence of novel culturable bacteria. Gut Microbes, 10 (1), 77-91. (2019)
  6. Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., & Wade, W. G. Strategies for culture of "unculturable" bacteria. FEMS Microbiology Letters, 309 (1), 1-7. (2010)
  7. Harris, T. M., Rumaseb, A., Beissbarth, J., Barzi, F., Leach, A. J., & Smith-Vaughan, H. C. Culture of non-typeable Haemophilus influenzae from the nasopharynx: Not all media are equal. Journal of Microbiological Methods, 137, 3-5. (2017)
  8. Wang, Y.-Y., Ai, P., Hu, C.-X., & Zhang, Y.-L. Effects of various pretreatment methods of anaerobic mixed microflora on biohydrogen production and the fermentation pathway of glucose. International Journal of Hydrogen Energy, 36 (1), 390-396. (2011)
  9. Pascual, A., Basco, L. K., Baret, E., Amalvict, R., Travers, D., Rogier, C., & Pradines, B. Use of the atmospheric generators for capnophilic bacteria Genbag-CO2 for the evaluation of in vitro Plasmodium falciparum susceptibility to standard anti-malarial drugs. Malaria Journal, 10, 8 (2011).
  10. Summanen, P., McTeague, M., Väisänen, M.-L., Strong, C., & Finegold, S. Comparison of Recovery of Anaerobic Bacteria Using the Anoxomat®, Anaerobic Chamber, and GasPak®Jar Systems. Anaerobe, 5, 5-9. (1999)
  11. de la Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., & Hancock, R. E. Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology, 16, 580-589. (2013)
  12. Possé, B., De Zutter, L., Heyndrickx, M., & Herman, L. Novel differential and confirmation plating media for Shiga toxin-producing Escherichia coli serotypes O26, O103, O111, O145 and sorbitol-positive and -negative O157. FEMS Microbiology Letters, 282 (1), 124-131. (2008)

Transkript

1. Vorbereitung Vor Beginn die Hände gründlich waschen und handschuhe in entsprechend größe anziehen. Sterilisieren Arbeitsfläche mit 5% Natriumhypochlorit (Bleichmittel) und gründlich trocknen. Legen Sie eine Impfschleife in einen leeren 120 mL Erlenmeyer Kolben, damit er die Bankspitze während der Arbeit nicht berührt. 2. Wachstumsmedien und Kulturen Sammeln Sie vier Platten Mannitol Salt Agar (MSA), Eosin Methylenblau Agar (EMB) und acht Tryptic Soja-Agar (TSA) aus dem Kühlschrank (diese können kommerziell erworben werden). Legen Sie Platten auf den gereinigten Arbeitsbereich. Sammeln Sie die folgenden BrüheKulturen: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, und Proteus vulgaris. Seien Sie vorsichtig: Da es sich um aerobe Organismen handelt, sollten die Kappen der Röhren leicht locker sein. Legen Sie alle Kulturen in einem Reagenzglasregal auf die gereinigte Arbeitsfläche. 3. Übertragung von Kulturen und Inkubation Stehen oder sitzen Sie auf der Bank mit allen Materialien in Reichweite. Um die aseptische Technik zu verwenden, um die Bakterien auf die Platte zu übertragen, zünden Sie zuerst die Schleife, bis sie orange leuchtet – und lassen Sie sie dann in der Luft abkühlen. Während die Schleife abkühlt, nehmen Sie die Brühe Kultur von E. coli, und öffnen Sie dann die Kappe mit Ihrem rosa Finger. Brennen Sie die Öffnung des Rohres schnell. Dies verhindert eine Kontamination. Tauchen Sie die Schleife in die Röhre und streifen Sie den Organismus auf den ersten Quadranten einer EMB-Platte. Nachdem der erste Streifen durchgeführt wird, flammen Sie die Schleife, und führen Sie dann einen zweiten Streifen durch, der den ersten Streifen nur ein- oder zweimal kreuzt. Dies ermöglicht die Isolierung einzelner Kolonien und um festzustellen, ob eine Kontamination vorliegt. Wiederholen Sie dies, bis alle vier Quadranten der Platte gestreift sind. Übertragen Sie nun jeden der übrigen Organismen auf die gleiche Streifenbeschichtungsweise, so dass das Endprodukt eine MSA-Platte, eine EMB-Platte und zwei separate TSA-Platten pro Organismus ist. Sobald alle Organismen übertragen wurden, flammen Sie die Schleife ein letztes Mal und legen Sie sie weg. Legen Sie 1 TSA-Platte mit jedem Organismus in die Gaspackung und schütteln Sie dann einen Gasbeutel, bevor Sie ihn in die Kammer neben den Platten legen. Dicht fest versiegeln. Alle Platten bei 37°C über Nacht inkubieren. Sterilisieren Sie die Arbeitsfläche ein letztes Mal mit 5% Bleichmittel. 4. Lese- und Aufzeichnungsergebnisse Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und legen Sie sie auf eine saubere Laborbank Beachten Sie das Wachstum der Organismen auf jedem Teller in Ihrem Labor-Notebook. Nehmen Sie insbesondere detaillierte Anmerkungen zu: Anzahl und Größe der Kolonien (falls vorhanden) auf jeder Platte, für jeden plattierten Stamm Aussehen des Agars, der alle Kolonien umgibt, die auf den MSA-Platten wachsen Aussehen von Kolonien, die auf den EMB-Platten wachsen Wachstumsunterschiede zwischen den TSA-Platten, die außerhalb des Gaspakets angebaut werden