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Quelle: Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Institut für Klinische Wissenschaften Lund, Abteilung für Infektionsmedizin, Biomedical Center, Universität Lund, 221 00 Lund, Schweden
Die mikrobielle Biodiversität scheint unmöglich zu bestimmen, und die mikrobielle Artenvielfalt ist mit schätzungsweise einer Billion koexistierender Arten (1,2) wirklich erstaunlich. Obwohl besonders raue Klimazonen, wie die saure Umgebung des menschlichen Magens (3) oder die subglazialen Seen der Antarktis (4), von einer bestimmten Art dominiert werden können, sind Bakterien typischerweise in Mischkulturen zu finden. Da jede Sorte das Wachstum einer anderen (5) beeinflussen kann, ist die Fähigkeit, "reine" (nur aus einem Typ bestehende) Kolonien zu trennen und zu kultivieren, sowohl im klinischen als auch im akademischen Umfeld unerlässlich geworden. Reine Kulturen ermöglichen weitere genetische (6) und proteomische Untersuchungen (7), die Analyse der Probenreinheit und, vielleicht bemerkenswerter, die Identifizierung und Charakterisierung von Infektionserregern aus klinischen Proben.
Bakterien haben eine breite Palette von Wachstumsanforderungen und es gibt zahlreiche Arten von Nährstoffmedien, die entwickelt wurden, um sowohl die unanspruchsvollen als auch die anspruchsvollen Arten zu erhalten (8). Wachstumsmedien können entweder in flüssiger Form (als Brühe) oder in einer typisch engarbasierten (einem gelierenden Mittel aus Rotalgen) feste Form hergestellt werden. Während die direkte Impfung in die Brühe das Risiko birgt, eine genetisch vielfältige oder sogar gemischte Bakterienpopulation zu erzeugen, schafft die Beschichtung und Neuung eine reinere Kultur, in der jede Zelle ein sehr ähnliches genetisches Make-up hat. Die Streifenplattentechnik basiert auf der progressiven Verdünnung einer Probe (Abbildung 1), mit dem Ziel, einzelne Zellen voneinander zu trennen. Jede lebensfähige Zelle (im Folgenden als koloniebildende Einheit, KBE bezeichnet), die von den Medien und der bezeichneten Umgebung getragen wird, kann anschließend eine isolierte Kolonie von Tochterzellen durch binäre Spaltung finden. Trotz der schnellen Mutationsraten innerhalb bakterieller Gemeinschaften wird diese Zellgruppe allgemein als klonal betrachtet. Die Ernte und Erneute Verwesung dieser Population stellt somit sicher, dass die nachfolgende Arbeit nur einen einzigen bakteriellen Typ umfasst.
Abbildung 1: Eine Streifenplatte basiert auf der progressiven Verdünnung der Originalprobe. I) Das Inokulum wird zunächst mit einer Zick-Zack-Bewegung verteilt, wodurch ein Gebiet mit einer relativ dichten Bakterienpopulation entsteht. II-IV) Streifen werden aus dem vorhergehenden Bereich gezogen, wobei jedes Mal eine sterile Impfschleife verwendet wird, bis der vierte Quadrant erreicht ist. V) Eine letzte Zick-Zack-Bewegung, die auf die Mitte der Platte gerichtet ist, bildet einen Bereich, in dem das Inokulum deutlich verdünnt wurde, so dass Kolonien getrennt voneinander erscheinen können.
Die Streifenplattentechnik kann auch mit dem Einsatz selektiver und/oder differentialer Medien kombiniert werden. Ein selektives Medium hemmt das Wachstum bestimmter Organismen(z. B. durch Zugabe von Antibiotika), während ein Differenzmedium nur dazu beiträgt, sich voneinander zu unterscheiden(z. B. durch Hämolyse auf Blutagarplatten).
Allen Arbeiten in der Mikrobiologie liegt der Einsatz aseptischer (steriler) Techniken zugrunde. Jede Bakterienkultur sollte als potenziell pathogen betrachtet werden, da die Gefahr eines unbeabsichtigten Wachstums tückischer Stämme, Aerosolbildung und Kontamination von Geräten/Personal besteht. Um diese Risiken zu minimieren, werden alle Medien-, Kunststoff-, Metall- und Glaswaren in der Regel durch Autoklavieren vor und nach dem Gebrauch sterilisiert und mit hochdruckgesättigtem Dampf bei etwa 121°C belastet, der alle verweilenden Zellen effektiv auslöscht. Der Arbeitsbereich wird in der Regel mit Ethanol sowohl vor als auch nach der Verwendung desinfiziert. Labormantel und Handschuhe werden immer bei der Arbeit mit Infektionserregern getragen.
1. Einrichten
2. Protokoll
Auf einer Petrischale, wenn ein einzelnes Bakterium mehrere Runden der asexuellen Fortpflanzung durchläuft, wird es zur Bildung einer Klonkolonie führen. Es kann jedoch schwierig sein, ein einzelnes Bakterium aus einer gemischten Probe, wie z. B. einer Bodensuspension, zu erhalten. Wenn man eine Schleife dieser heterogenen Kultur nimmt, kann sie bis zu einer Billion einzelne Bakterien enthalten. Um diese vielen Bakterien auf die Oberfläche einer Agarplatte zu verteilen und eine einzige Kolonie zu erhalten, selbst mit einem Zick-Zack-Muster, müsste die Schleife kontinuierlich über die Oberfläche von genügend Platten gezogen werden, die nebeneinander gesetzt werden, um die gesamte Liberty Island einzukreisen. Offensichtlich verwenden Wissenschaftler nicht wirklich so viele Platten. Stattdessen verwenden sie eine Technik namens Streak Plating.
Die Streifenplattentechnik basiert auf der progressiven Verdünnung einer bakteriellen Probe und wird über die Volumenmedienoberfläche einer einzelnen Petrischale durchgeführt. Zunächst wird die Medienoberfläche visuell in fünf Abschnitte unterteilt, indem vier Fragmente des Umfangs als die ersten vier Abschnitte und die Mitte der Platte als der fünfte zugewiesen werden. Dadurch werden effektiv fünf Medienplatten aus einer einzigen Petrischale erstellt. Als nächstes wird der erste Abschnitt mit einem Zick-Zack-Muster mit einer Schleife des gewünschten Inokulums gestreift. Dann wird entweder eine neue Einwegschleife verwendet, oder im Falle einer Drahtschlaufe wird sie mit einem Bunsenbrenner sterilisiert, der sie bis zu ihrer roten Hitze entlang der Länge des Drahtes flammt. Diese Verwendung einer neuen Schleife, oder Flammsterilisation Schleife, entfernt alle verbleibenden Bakterienzellen, hilft bei der Verdünnung der Bakterien. Die Hot Loop wird dann für einige Sekunden in der Luft gekühlt, bevor sie durch den ersten Abschnitt gezogen wird, um drei bis vier separate Linien zu erstellen, die jeweils nur einen Bruchteil der Bakterien in den zweiten Abschnitt tragen. Die übrigen Abschnitte werden auf die gleiche Weise gestreift, wobei jedes Mal eine sterile Schleife und ein einzelner Durchgang durch den vorherigen Streifen verwendet wird.
Mit diesem Zyklus des Streichens und Sterilisierens sollte die bakterienkonzentration in jedem nachfolgenden Abschnitt verdünnt werden, so dass der letzte Abschnitt nur wenige diskret lokalisierte Bakterien enthält. Bei der Inkubation vermehren sich diese diskreten Bakterien, um isolierte Klonkolonien von Tochterzellen zu produzieren, die als Koloniebildnereinheiten oder KBE bezeichnet werden. Diese können geerntet und neu gestreift werden, um sicherzustellen, dass die nachfolgende Arbeit nur einen einzigen Bakterientyp umfasst, der als reine Kultur bezeichnet wird. Neben der Isolierung einzelner Kolonien aus einer gemischt-bakteriellen Kultur wird die Streifenbeschichtungstechnik auch verwendet, um medienspezifische Stämme auszuwählen, die bakterielle Koloniemorphologie zu bestimmen oder verschiedene Bakterienarten zu identifizieren. In diesem Video zeigen wir, wie man einzelne bakterielle Kolonien von einer gemischt-bakteriellen Probensuspension mittels Streifenbeschichtungstechnik isoliert.
Zunächst einmal Laborhandschuhe und einen Labormantel anziehen. Als nächstes sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. Als nächstes wählen Sie ein geeignetes Medium, das die genutzten Bakterienarten oder Stämme aufrechterhält, und beginnen Sie mit der Vorbereitung der Medien. Hier wird der gewöhnliche LB-Agar hergestellt, indem zehn Gramm vorformulierte, pulverisierte Medien und 7,5 Gramm Agar gewogen werden. Fügen Sie die gewogenen, getrockneten Komponenten in eine Glasflasche, die in der Lage ist, das Doppelte des endigen Volumens zu halten, um überlaufen zu vermeiden. Dann 500 Milliliter Wasser in die Flasche geben und halbfest verschließen. Sterilisieren Sie die Medien, indem Sie die Flasche in einem Autoklaven auf 121 Grad Celsius für zwanzig Minuten. Verwenden Sie nach Abschluss hitzebeständige Handschuhe oder ein Hotpad, um das Medium aus der Maschine zu entfernen, und drehen Sie dann sofort den Flaschenverschluss, um ihn fest zu schließen.
Lassen Sie die Medien für den gleichen Tag abkühlen, indem Sie die Flasche in ein auf ca. 45 Grad Celsius erhitztes Wasserbad legen, um die Medien in einem flüssigen Zustand zu erhalten. Alternativ können die Medien bei Raumtemperatur gelassen werden, um sie bei festem Zustand zu speichern. Bei Bedarf Mikrowelle die Flasche mit dem Deckel leicht geöffnet, um die Medien zu schmelzen, und lassen Sie die Medien mit einem 45 Grad Celsius Wasserbad abkühlen.
Als nächstes nehmen Sie eine Hülse mit sterilen Petri-Gerichten und mit einem permanenten Marker, kennzeichnen Sie sie mit dem Ermittler und Mediennamen sowie dem Datum. Übertragen Sie dann das benötigte Medienvolumen in ein steriles Gefäß und fügen Sie bei Bedarf Antibiotika oder andere empfindliche Komponenten hinzu. Hier werden 50 Milliliter Medien mit 100 Mikroliter Kanamycin für eine Endkonzentration von 25 Mikrogramm pro Milliliter gemischt. Wirbeln Sie das Rohr, um eine gleichmäßige Verteilung der hinzugefügten Komponenten über die Medien zu gewährleisten. Langsam, um Blasenbildung zu vermeiden, gießen Sie 20 bis 25 Milliliter von etwa 45 Grad Celsius Kulturmedium in jede der Platten. Wenn Blasen oder Schaum auftreten, schnell mit einer normalen Pipette und einer sterilen Spitze entfernen. Dann sofort alle Deckel austauschen, um eine Kontamination zu verhindern. Lassen Sie den Agar bei Raumtemperatur für mindestens zwei Stunden oder über Nacht erstarren. Nach der Erstarrung die Kulturplatten bei vier Grad Celsius auf den Kopf stellen, um die Kondensation auf der Oberfläche des Mediums zu minimieren.
Um die Kultur der Wahl zu streifen, nehmen Sie zuerst eine saubere Kulturplatte und entfernen Sie den Deckel. Schnell arbeiten, eine Einweg-, sterile Schleife in das gewünschte Inokulum tauchen und dann sofort die Schleife mit einer Zick-Zack-Bewegung über den ersten Quadranten der Platte wischen. Ersetzen Sie den Deckel der Schale, entsorgen Sie die verwendete Impfschleife, und wählen Sie dann eine neue sterile Schleife aus. Mit der neuen Schleife, machen drei bis vier Striche, die die ursprüngliche Tupferlinie aus dem ersten Quadranten, die eine relativ dichte Bakterienpopulation in den zweiten Quadranten enthalten sollte. Schließen Sie den Deckel noch einmal, und entsorgen Sie die Schleife. Mit einer neuen Schleife wiederholen Sie diese Aktion erneut, aber dieses Mal streifen von der zweiten in den dritten Quadranten. Dann, mit einer neuen Schleife wieder, machen sie einen weiteren Streifen vom dritten in den vierten Teil der Platte. Schließlich, mit einer frischen Schleife, machen Sie einen letzten Schlag in einem Zick-Zack-Muster vom vierten Quadranten in Richtung der Mitte der Platte. Die bakterielle Prävalenz wird in diesem Bereich geringer sein, idealerweise können einzelne Kolonien aus einer einzigen lebensfähigen Mutterzelle gebildet werden.
Ersetzen Sie den Plattendeckel, und, falls für die Bakterienarten geeignet, versiegeln Sie die Platte mit Parafolie, um Luftstrom zu verhindern. Drehen Sie die Kulturplatte auf den Kopf, um Kondensationstropfen zu verhindern, und platzieren Sie sie dann bei einer geeigneten Temperatur für das Wachstum. Hier wird ein Inkubator auf 37 Grad Celsius eingestellt. Lassen Sie die Platte brüten, bis Bakterienkolonien sichtbar sind. Um eine klonale Bakterienpopulation zu erzeugen, wählen Sie eine diskrete Kolonie aus dieser Platte aus. Berühren Sie nun mit der sterilen Schleife die Zielkolonie und machen Sie wie bisher einen Streifen im ersten Quadranten einer neuen Platte. Weiterhin die Schleife abwechselnd sterilisieren und die verbleibenden Quadranten der Platte, wie zuvor gezeigt, streifen, endend mit dem Zick-Zack zur Mitte. Schließen Sie die Platte, und legen Sie sie zu brüten, bis sich diskrete Kolonien bilden. Sobald diese Kolonien angebaut sind, stellen sie in der Regel reine klonale Stämme dar.
Die anfängliche Streifenplatte kann Kolonien enthalten, die aus Zellen verschiedener Bakterienarten oder Zellen mit unterschiedlicher genetischer Zusammensetzung stammen, abhängig von der Probenreinheit. Durch die nachfolgende Isolierung einer einzelnen Kolonie, bei der alle Einheiten aus einer gemeinsamen Mutterzelle abgeleitet sind, erzeugt das zweite Streifenverfahren eine relativ klonale Bakterienpopulation, die für eine weitere Charakterisierung oder Impfung in Brühe geeignet ist.
Wenn ein einzelnes Bakterium auf einer Petrischale mehrere Runden ungeschlechtlicher Fortpflanzung durchläuft, führt dies zur Bildung einer klonalen Kolonie. Es kann jedoch schwierig sein, ein einzelnes Bakterium aus einer gemischten Probe, wie z. B. einer Bodensuspension, zu gewinnen. Wird eine Schleife voll dieser heterogenen Kultur entnommen, kann sie bis zu einer Billion einzelner Bakterien enthalten. Um so viele Bakterien auf die Oberfläche einer Agarplatte zu verteilen und eine einzige Kolonie zu erhalten, müsste die Schlaufe kontinuierlich über die Oberfläche von genügend nebeneinander angeordneten Platten gezogen werden, um die gesamte Liberty Island zu umschließen. Offensichtlich verwenden Wissenschaftler nicht wirklich so viele Platten. Stattdessen verwenden sie eine Technik namens Streifenbeschichtung.
Die Streak-Plate-Technik basiert auf der progressiven Verdünnung einer Bakterienprobe und wird auf der festen Medienoberfläche einer einzelnen Petrischale durchgeführt. Zu Beginn wird die Medienoberfläche visuell in fünf Abschnitte unterteilt, indem vier Fragmente des Umfangs als die ersten vier Abschnitte und die Mitte der Platte als fünfter Abschnitt zugewiesen werden. Dadurch werden effektiv fünf Medienplatten aus einer einzigen Petrischale hergestellt. Anschließend wird der erste Abschnitt mit einer Schlaufe des gewünschten Inokulums in einem Zick-Zack-Muster gestreift. Dann wird entweder eine neue Einwegschlaufe verwendet, oder im Falle einer Drahtschlaufe wird sie mit einem Bunsenbrenner sterilisiert und entlang der Länge des Drahtes glühend geflammt, bis sie glühend heiß ist. Durch die Verwendung einer neuen Schlaufe oder Flammensterilisationsschlaufe werden alle verbleibenden Bakterienzellen entfernt, was bei der Verdünnung der Bakterien hilft. Der heiße Kreislauf wird dann einige Sekunden lang an der Luft abgekühlt, bevor er durch den ersten Abschnitt gezogen wird, um drei bis vier separate Linien zu erzeugen, die jeweils nur einen Bruchteil der Bakterien in den zweiten Abschnitt transportieren. Die verbleibenden Abschnitte werden auf die gleiche Weise gestreift, wobei jedes Mal eine sterile Schlaufe und ein einziger Durchgang durch den vorherigen Streifen verwendet wird.
Bei diesem Zyklus des Streifens und Sterilisierens sollte die Bakterienkonzentration in jedem nachfolgenden Abschnitt so verdünnt werden, dass der letzte Abschnitt nur wenige diskret lokalisierte Bakterien enthält. Bei der Inkubation vermehren sich diese diskreten Bakterien, um isolierte klonale Kolonien von Tochterzellen zu produzieren, die als koloniebildende Einheiten oder KBEs bezeichnet werden. Diese können geerntet und erneut gestreift werden, um sicherzustellen, dass bei der nachfolgenden Arbeit nur eine einzige Bakterienart beteiligt ist, die als Reinkultur bezeichnet wird. Neben der Isolierung einzelner Kolonien aus einer gemischten Bakterienkultur wird die Streak-Plattierungstechnik auch zur Auswahl medienspezifischer Stämme, zur Bestimmung der Morphologie der Bakterienkolonie oder zur Identifizierung verschiedener Bakterienarten eingesetzt. In diesem Video zeigen wir, wie einzelne Bakterienkolonien aus einer gemischt-bakteriellen Probensuspension mittels Streak-Plattierungstechnik isoliert werden können.
Ziehen Sie zunächst Laborhandschuhe und einen Laborkittel an. Als nächstes sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol. Wählen Sie als Nächstes ein geeignetes Medium aus, das die verwendete Bakterienspezies oder den verwendeten Bakterienstamm unterstützt, und beginnen Sie mit der Vorbereitung des Mediums. Hier wird gewöhnlicher LB-Agar hergestellt, indem zehn Gramm vorformuliertes, pulverförmiges Medium und 7,5 Gramm Agar abgewogen werden. Geben Sie die gewogenen, getrockneten Komponenten in eine Glasflasche, die das Doppelte des endgültigen Volumens aufnehmen kann, um ein Überlaufen zu vermeiden. Geben Sie dann 500 Milliliter Wasser in die Flasche und verschließen Sie sie halbfest. Sterilisieren Sie das Medium, indem Sie die Flasche zwanzig Minuten lang in einen Autoklaven stellen, der auf 121 Grad Celsius eingestellt ist. Verwenden Sie nach Fertigstellung hitzebeständige Handschuhe oder ein heißes Pad, um das Medium aus der Maschine zu entfernen, und drehen Sie dann sofort den Flaschenverschluss, um ihn fest zu schließen.
Lassen Sie das Medium für die Verwendung am selben Tag abkühlen, indem Sie die Flasche in ein auf ca. 45 Grad Celsius erhitztes Wasserbad stellen, um das Medium in einem flüssigen Zustand zu halten. Alternativ können die Medien bei Raumtemperatur belassen werden, um sie im festen Zustand zu lagern. Stellen Sie die Flasche bei Bedarf bei leicht geöffnetem Deckel in die Mikrowelle, um das Medium zu schmelzen, und lassen Sie das Medium in einem 45 Grad Celsius warmen Wasserbad abkühlen.
Nehmen Sie als Nächstes eine Hülle mit sterilen Petrischalen und beschriften Sie sie mit einem Permanentmarker mit den Namen des Prüfarztes und der Medien sowie dem Datum. Füllen Sie dann das erforderliche Medienvolumen in ein steriles Gefäß und fügen Sie bei Bedarf Antibiotika oder andere empfindliche Komponenten hinzu. Hier werden 50 Milliliter Medium mit 100 Mikrolitern Kanamycin gemischt, um eine Endkonzentration von 25 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Schwenken Sie das Rohr, um eine gleichmäßige Verteilung der hinzugefügten Komponenten im Medium zu gewährleisten. Um Blasenbildung zu vermeiden, gießen Sie langsam 20 bis 25 Milliliter etwa 45 Grad Celsius heißes Kulturmedium in jede der Platten. Wenn Blasen oder Schaum auftreten, entfernen Sie sie schnell mit einer normalen Pipette und einer sterilen Spitze. Setzen Sie dann sofort alle Deckel wieder auf, um eine Kontamination zu vermeiden. Lassen Sie den Agar mindestens zwei Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur erstarren. Lagern Sie die Kulturplatten nach dem Erstarren kopfüber bei vier Grad Celsius, um die Kondensation auf der Oberfläche des Mediums zu minimieren.
Um die Kultur der Wahl zu streifen, nehmen Sie zuerst eine saubere Kulturplatte und entfernen Sie den Deckel. Tauchen Sie schnell eine sterile Einwegschlaufe in das gewünschte Inokulum und tupfen Sie die Schlaufe sofort mit einer Zick-Zack-Bewegung über den ersten Quadranten der Platte. Setzen Sie den Deckel der Schale wieder auf, entsorgen Sie die gebrauchte Impfschlaufe und wählen Sie dann eine neue sterile Schlaufe aus. Führen Sie mit der neuen Schlaufe drei bis vier Striche durch, indem Sie die ursprüngliche Tupferlinie kreuzen, die vom ersten Quadranten ausstrahlt und eine relativ dichte Bakterienpopulation in den zweiten Quadranten enthalten sollte. Schließen Sie den Deckel wieder und entsorgen Sie die Schlaufe. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einer neuen Schleife, diesmal jedoch vom zweiten in den dritten Quadranten. Mache dann mit einer neuen Schlaufe einen weiteren Streifen vom dritten in den vierten Abschnitt der Platte. Zum Schluss machst du mit einer frischen Schlaufe einen letzten Strich in einem Zick-Zack-Muster vom vierten Quadranten zur Mitte der Platte. Die bakterielle Prävalenz wird in diesem Bereich geringer sein, so dass im Idealfall einzelne Kolonien aus einer einzigen lebensfähigen Mutterzelle etabliert werden können.
Setzen Sie den Tellerdeckel wieder auf und versiegeln Sie die Platte, falls für die Bakterienart geeignet, mit Para-Folie, um einen Luftstrom zu verhindern. Drehen Sie die Kulturplatte auf den Kopf, um Kondensationstropfen zu vermeiden, und stellen Sie sie dann bei einer geeigneten Temperatur für das Wachstum auf. Hier ist ein Inkubator auf 37 Grad Celsius eingestellt. Lassen Sie die Platte inkubieren, bis Bakterienkolonien sichtbar sind. Um eine klonale Bakterienpopulation zu erzeugen, wählen Sie eine diskrete Kolonie aus dieser Platte aus. Berühren Sie nun mit der sterilen Schlaufe die Zielkolonie und machen Sie wie zuvor einen Streifen im ersten Quadranten einer neuen Platte. Fahren Sie fort, die Schlaufe abwechselnd zu sterilisieren und die verbleibenden Quadranten der Platte wie zuvor gezeigt zu streifen, bis Sie mit dem Zick-Zack zur Mitte enden. Schließen Sie die Platte und stellen Sie sie zum Inkubieren, bis sich diskrete Kolonien bilden. Sobald diese Kolonien gezüchtet sind, stellen sie in der Regel reine klonale Stämme dar.
Die anfängliche Streifenplatte kann Kolonien enthalten, die von Zellen verschiedener Bakterienarten oder Zellen mit unterschiedlicher genetischer Ausstattung stammen, abhängig von der Reinheit der Probe. Durch die anschließende Isolierung einer einzelnen Kolonie, bei der alle Einheiten von einer gemeinsamen Mutterzelle abgeleitet sind, erzeugt das zweite Streifenverfahren eine relativ klonale Bakterienpopulation, die für eine weitere Charakterisierung oder Inokulation in Brühe geeignet ist.
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