Reinkulturen und Streak-Plating: Isolierung einzelner Bakterienkolonien aus einer gemischten Probe

1. Einrichten

1. Alle Mikroben sollten so behandelt werden, als wären sie gefährlich. Tragen Sie immer einen Labormantel und Handschuhe, binden Sie lange Haare zurück und sorgen Sie dafür, dass alle Wunden besonders gut geschützt sind.
2. Bereiten Sie den Arbeitsbereich bereit, indem Sie ihn mit 70% Ethanol sterilisieren.
3. Stellen Sie sicher, dass Agarplatten, Probenlösung(en) und entweder eine Schachtel mit vorsterilisierten Kunststoff-Impfschlaufen oder eine Metallschlaufe plus eine Bunsenflamme in der Nähe sind. Einweg-Kunststoffschlaufen sind in der Regel vorsterilisiert. Metallschlaufen sollten in 70% Ethanol getaucht und dann in der Nähe des blauen Bereichs einer Bunsenflamme gehalten und erhitzt werden, bis es heiß ist. Lassen Sie den Draht abkühlen, indem Sie den Deckel der Platte anheben (nur leicht, um eine Kontamination zu verhindern) und ihn gegen das erstarrte Medium anzapfen.
4. Beenden Sie jedes Verfahren mit einer wiederholten Sterilisation des Arbeitsbereichs und einer gründlichen Waschen/Sterilisation von Händen und Handgelenken.

2. Protokoll

1. Vorbereitung von Medien
   1. Identifizieren und vorbereiten Sie ein festes Medium (in der Regel 1,5% (w/v) Agar), das die genutzte Bakterienart/-sorte aufrechterhält. Mischen Sie das Medium in einer Flasche in der Lage, das Doppelte der endgültigen Lautstärke zu halten, um Überlauf beim Autoklavieren zu vermeiden.
   2. Sterilisieren Sie die Medien, indem Sie die Flasche mit einer halbangezogenen Kappe in einem Autoklaven auf 121°C für 20 min setzen.
   3. Schließen Sie die Kappe richtig, sobald die Flasche aus dem Autoklaven entfernt wird. Wenn das Medium in Kürze verwendet werden soll, legen Sie die Flasche in ein Wasserbad, das auf 45°C eingestellt ist, um sie in einem flüssigen Zustand zu erhalten. Der Agar erstarrt sonst bei weniger als 32-40°C und kann später (typischerweise mit einer Mikrowelle) zu einem Schmelzpunkt bei 85°C wieder erhitzt werden.
2. Zubereitung von Kulturplatten
   1. Markieren Sie die Basis steriler Petrischalen (in der Regel 100 x 15 mm) auf der Seite oder am Boden mit dem Namen des Experimentators, dem Datum und dem Medientyp.
   2. 20-25 ml 45°C Agarkulturmedium (zuvor zubereitet) in jede der beschrifteten Platten gießen. Sollte Schaum an den Rändern auftreten, sollte dieser mit einer normalen Pipette und einer sterilen Spitze schnell entfernt werden.
   3. Legen Sie sofort alle Deckel wieder auf das Geschirr, um eine Kontamination zu verhindern.
   4. Lassen Sie den Agar ca. 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C erstarren. Einmal gesetzt, sollten Bakterienkulturplatten anschließend kopfüber bei 4°C gelagert werden, um die Kondensation auf der mittleren Oberfläche zu minimieren.
3. Streak-Beschichtung
   1. Eine sterile Schleife in das gewünschte Inokulum untertauchen und die gesammelte Probe sofort mit einer Zick-Zack-Bewegung auf den ersten Quadranten der Platte verteilen (Abbildung 1, I).
   2. Schließen Sie den Deckel und sterilisieren Sie die Impfschleife neu oder sammeln Sie eine neue sterile Einwegschleife.
   3. Machen Sie 3-4 Striche, die vom ersten Quadranten (der eine relativ dichte Bakterienpopulation enthält) in Richtung des zweiten Quadranten der Platte ausstrahlen(Abbildung 1, II).
   4. Schließen Sie den Deckel und sterilisieren Sie die Impfschleife neu oder entsorgen Sie die Einwegschleife und sammeln Sie eine neue sterile Schleife.
   5. Wiederholen Sie diese Streifzüge von 3-4 Schlägen vom zweiten in den dritten Quadranten und dann vom dritten zum vierten Quadranten, wobei sie jedes Mal eine sterile Schleife verwenden(Abbildung 1, III - IV).
   6. Mit einer sterilen Schleife, machen Sie einen letzten Schlag in einem Zick-Zack-Muster vom vierten Quadranten in Richtung der Mitte der Platte (Abbildung 1, V). Die bakterielle Prävalenz wird in diesem Bereich geringer sein, was idealerweise die Einrichtung einzelner Kolonien aus einer einzigen, lebensfähigen Mutterzelle ermöglicht.
   7. Schließen Sie den Deckel und (falls von der Bakterienart benötigt) Versiegelung mit Parafilm, um Luftstrom zu verhindern.
   8. Je nach Bakterienart/Stamm die Kulturplatte nach oben in eine geeignete Umgebung stellen und brüten, bis Bakterienkolonien sichtbar sind (getrennte Kolonien können in beiden Bereichen der Platte erscheinen, da die Anfangskonzentration variieren kann).
   9. Um eine klonale Bakterienpopulation zu erzeugen, streichen Sie eine weitere Platte aus und tauschen Sie das auf die ursprüngliche Platte plattierte Inokulum gegen Zellen aus einer einzigen Kolonie der ursprünglichen Platte.