16S rRNA-Sequenzierung: Eine PCR-basierte Technik zur Identifizierung bakterieller Arten

1. Einrichten

1. Beim Umgang mit Mikroorganismen ist es erforderlich, eine gute mikrobiologische Praxis zu befolgen. Alle Mikroorganismen, insbesondere unbekannte Proben, sollten als potenzielle Krankheitserreger behandelt werden. Folgen Sie der aseptischen Technik, um eine Kontamination der Proben, der Forscher oder des Labors zu vermeiden. Waschen Sie die Hände vor und nach dem Umgang mit Bakterien, verwenden Sie Handschuhe und tragen Sie Schutzkleidung.
2. Durchführung einer Risikobewertung für das Versuchsprotokoll zur genomischen DNA-Isolierung und PCR-Produktreinigung. Einige Reagenzien können schädlich sein!
3. Reine Kultur ist für die 16S rRNA Sequenzierung unerlässlich. Bevor Sie zur Isolierung der genomischen DNA übergehen, stellen Sie sicher, dass das Ausgangsmaterial vollständig rein ist. Dies kann durch Streifenbeschichtung erfolgen, um einzelne Kolonien zu isolieren. Diese können auf Tellern einzeln oder bei Bedarf in Brühe weiter angebaut werden.
4. Erforderliche Laborausrüstung:
   1. Thermischer Cycler für PCR. Die Funktion des Thermischen Cyclers besteht darin, die Temperatur entsprechend einem eingestellten Programm anzuheben und zu senken. Während der Erstellung des Programms werden Sie aufgefordert, die Temperatur- und Zeitwerte für jeden PCR-Schritt sowie die Gesamtzahl der Zyklen einzugeben.
   2. Agarose-Gel-Elektrophorese-System. Es wird verwendet, um DNA-Fragmente basierend auf ihrer Größe und Ladung zu trennen. In diesem Protokoll wird die Agarose-Gelelektrophorese verwendet, um die Qualität isolierter genomischer DNA- und PCR-Produkte zu visualisieren.

2. Protokoll

Hinweis: Das gezeigte Protokoll gilt für die 16S rRNA-Gensequenzierung aus einer reinen Bakterienkultur. Sie gilt nicht für metagenomische Studien.

1. Culturing Bakterien für die Isolierung der genomischen DNA (gDNA).
   1. Wachsen Sie Ihren Mikroorganismus auf einem geeigneten Medium. In diesem Schritt können sowohl flüssige als auch feste Medien verwendet werden. Wählen Sie Bedingungen, die das beste Wachstum erzielen. Beachten Sie bei der Planung des Experiments, dass langsam wachsende Bakterien mehrere Tage benötigen, um die späte Log/stationäre Wachstumsphase zu erreichen. In diesem Protokoll wurde Bacillus subtilis 168 in Lysogeny-Brühe (LB) über Nacht in einem Schüttel-Inkubator mit 200 Rpm, 37°C angebaut.
2. Isolierung von gDNA.
   1. Wenn Bakterien auf festem Medium angebaut wurden, kratzen Sie einige Zellen mit einer sterilen Schleife und setzen Sie sie in 1 ml destilliertem Wasser wieder auf
   2. Wenn Bakterien in flüssigem Medium angebaut wurden, verwenden Sie etwa 1,5 ml einer Nachtkultur.
   3. Pellet die Zellen durch Zentrifugation (1 Minute, 12.000 - 16.000 g), entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie die Zellen für die gDNA-Isolierung mit einem kommerziellen Kit oder Standardprotokollen[z. B. CTAB-Gesamt-DNA-Präparat (13) oder Phenol-Chloroform-Extraktion (14)]. Hier wurde ein kommerzielles Kit verwendet, um gDNA aus 1,5 ml b. subtilis 168 Übernachtungskultur, OD₆₀₀ = 1,5 zu isolieren.
      Anmerkung 1: Für einige Gram-negative Bakterien kann dieser Schritt weggelassen und durch einfache Freisetzung von DNA aus Zellen durch Kochen ersetzt werden. Bakterielles Pellet in destilliertem Wasser aufbewahren und in einem Heizblock auf 100 °C für 10 Minuten inkubieren.
      Anmerkung 2: Gram-positive Bakterienzellen sind schwer zu stören. Es wird daher empfohlen, eine gDNA-Isolationsmethode oder ein Kit zu wählen, das der Isolierung von dieser Gruppe von Bakterien gewidmet ist.
3. gDNA-Qualitätsprüfung.
   1. Überprüfen Sie die Qualität der isolierten gDNA durch Agarose-Gel-Elektrophorese. Mischen Sie zunächst 5 l der isolierten gDNA mit 1 l des Ladefarbstoffs (6x), und laden Sie die Probe auf ein 0,8% Agarose-Gel, das ein DNA-Färbereagenz enthält.
   2. Laden Sie einen molekularen Massenstandard und führen Sie die Elektrophorese aus, bis die Farbfront den Boden des Gels erreicht.
   3. Sobald die Elektrophorese abgeschlossen ist, visualisieren Sie das Gel auf einem geeigneten Transilluminator (entweder UV oder blaues Licht). gDNA erscheint als dickes hochmolekulares Band (über 10 kb). Ein Beispiel für die gDNA-Qualitätsprüfung ist in Abbildung 3dargestellt.
   4. Wenn die gDNA die Qualitätskontrolle besteht(d.h.das hochmolekulare Band vorhanden ist und es wenig bis gar keine Verschmierung der gDNA gibt), verdünnen Sie Ihre gDNA seriell, indem Sie zuerst 3 Mikrozentrifugenrohre wie folgt etikettieren: "10x", "100x" und "1000x".
   5. Pipette 90 l steriles destilliertes Wasser in jede der 3 Rohre.
   6. Nehmen Sie 10 l der gDNA-Lösung und fügen Sie sie dem Mitrohr mit der Aufschrift "10x" hinzu.
   7. Pipet das gesamte Volumen(d.h. 100 l) gründlich nach oben und unten, um sicherzustellen, dass die Lösung gleichmäßig gemischt wird. Nehmen Sie dann 10 l der Lösung aus diesem Rohr und übertragen Sie sie in das Rohr mit der Aufschrift "100x".
   8. Mischen Sie wie zuvor beschrieben und wiederholen Sie das gleiche Verfahren, indem Sie 10 l der Lösung von Rohr "100x" auf das Rohr "1000x" übertragen. Diese Verdünnungen werden als Vorlage in der PCR-Reaktion verwendet.

Abbildung 3: Agarose Gel Elektrophorese von gDNA isoliert aus Bacillus subtilis. Spur 1: M - Molekularmassenmarker (von oben nach unten: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000 bp). Lane 2: gDNA - genomische DNA isoliert von Bacillus subtilis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Verstärkung des 16S rRNA-Gens durch PCR.
   Hinweis: Das nachstehende PCR-Protokoll ist für ein bestimmtes DNA-Polymerase- und Primerpaar 8F - 1492R optimiert (siehe Tabelle 1). Für jedes Polymerase- und Primerpaar ist eine Optimierung des Protokolls erforderlich.
   1. Alle Reagenzien auf Eis auftauen.
   2. Bereiten Sie den PCR-Mastermix vor, wie in Tabelle 2 dargestellt. Da die DNA-Polymerase bei Raumtemperatur aktiv ist, muss die Reaktionseinrichtung auf Eis durchgeführt werden, d.h. die PCR-Röhren und die Reaktionskomponenten sollten ständig auf Eis gehalten werden. Bereiten Sie eine Reaktion pro gDNA-Probe und eine Reaktion für negative Kontrolle vor. Negativsteuerung ist ein PCR-Mix ohne gDNA-Vorlage und wird verwendet, um sicherzustellen, dass die anderen Komponenten der Reaktion nicht kontaminiert sind.
      Hinweis: Bei mehreren Proben wird üblicherweise ein Master-Mix vorbereitet. Master Mix ist eine Lösung, die alle Reaktionskomponenten außer der Vorlage enthält. Es hilft, wiederholte Pipetten zu vermeiden, Pipettierfehler zu vermeiden und sorgt für eine hohe Konsistenz zwischen den Proben. Um den Master-Mix vorzubereiten, multiplizieren Sie das Volumen der einzelnen Komponenten (mit Ausnahme der DNA-Vorlage) mit der Anzahl der getesteten Proben. Mischen Sie alle Komponenten in Mikrozentrifugenrohr und Pipetten Sie das gesamte Volumen nach oben und unten mehrmals.
   3. Aliquot 49 l des Master-Mixes in die einzelnen PCR-Röhren.
   4. Fügen Sie 1 L-Vorlage in Rohre mit Master-Mix. Für die negative Kontrolle fügen Sie 1 l steriles Wasser hinzu. Um sicherzustellen, dass die Komponenten gut gemischt sind, leiten Sie die Mischung vorsichtig auf und ab, 10 Mal mit einer Pipette, die auf 30-50 l eingestellt ist.
   5. Stellen Sie die PCR-Maschine mit dem in Tabelle 3 gezeigten Programm ein.
   6. Legen Sie die Rohre in die PCR-Maschine und starten Sie das Programm.
   7. Sobald das Programm abgeschlossen ist, untersuchen Sie die Qualität Ihres PCR-Produkts durch Agarose-Gel-Elektrophorese.
   8. Eine erfolgreiche PCR-Reaktion mit dem 8F-1492R Primer-Paar ergibt ein einzelnes Band von ca. 1,5 kb (Abbildung 4). Wenn andere Bänder (d. h. unspezifische Produkte) vorhanden sind, optimieren Sie das PCR-Programm, indem Sie die Glühtemperatur anpassen. Wenn ein einzelnes Band mit der erwarteten Größe vorhanden ist, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Hier ergab die PCR-Reaktion mit 100-fach verdünnter gDNA-Schablone das beste Produkt, da sie ein scharfes Band von erwarteter Größe hatte und unspezifische Produkte fehlte. Daher wurde es gewählt, gereinigt und zur Sequenzierung geschickt zu werden.
   9. Vor der Sequenzierung muss das Produkt von Restgrundierungen, Desoxyribonukleotiden, Polymerase und Puffer gereinigt werden, die in der PCR-Reaktion vorhanden waren. Die PCR-Produkte können mit einem kommerziellen PCR-Reinigungskit isoliert werden. Die PCR-Reaktion wird auf eine Säule geladen, die eine DNA-bindende Matrix enthält. Das PCR-Produkt bindet an die Spalte, während andere Komponenten durch die Spalte fließen. Die Säule wird dann mit Waschpuffer gewaschen, und schließlich wird die DNA im Puffer der Wahl eluiert. Vergewissern Sie sich, dass der mit dem Kit ergänzte Elutionspuffer mit der Sequenzierung kompatibel ist.
   10. Senden Sie das gereinigte PCR-Produkt zur DNA-Sequenzierung. Befolgen Sie die Richtlinien für die Einreichung von Sequenzierungsmustern in der gewählten Sequenzierungseinrichtung. Für die beste Sequenzabdeckung verwenden Sie die PCR-Verstärkungsprimer (die gleichen wie in Abschnitt 2.4.1) als Sequenzierungsprimer. Hier wurden die Primer 8F und 1492R zur Sequenzierung des PCR-Produkts verwendet.

teil	Endgültige Konzentration	Volumen pro Reaktion	Volumen pro x-Reaktionen (Master-Mix)
5x Reaktionspuffer	1x	10 l	10 l x
10 mM dNTPs	200 m	1 L	1 l x
10 M Primer 8F	0,5 m	2,5 l	2,5 x x
10 M Primer 1492R	0,5 m	2,5 l	2,5 x x
Phusion-Polymerase	1 Einheit	0,5 l	0,5 x x
Vorlagen-DNA *	-	1 L	-
ddH2O	-	32,5 l	32,5 x x
Gesamtvolumen		50 l	49 x x

Tabelle 2: PCR-Reaktionskomponenten. * Verwenden Sie die 10x, 100x oder 1000x verdünnte gDNA ab Schritt 2.3.

schritt	temperatur	zeit	Zyklen
Anfängliche Denaturierung	98°C	30 Sek.
Denaturierung	98°C	10 Sek.	25-30
Glühen	60°C	30 Sek.
anbau	72°C	45 Sek.
Endgültige Verlängerung	72°C	7 Min.
halten	4°C	∞

Tabelle 3: PCR-Programm zur Amplifikation des 16S rRNA-Gens.

Abbildung 4: Agarose-Gel-Elektrophorese von PCR-Produkten verstärkt mit Primer 8F und 1492R und gDNA als Vorlage. Die gDNA-Probe von B. subtilis (siehe Abbildung 3) wurde 10, 100 und 1000 Mal verdünnt, um das beste Ergebnis zu testen. Spur 1: M - Molekularmassenmarker (von oben nach unten: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000 bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp). Spur 2: PCR-Reaktion mit 10x verdünnter Schablone. Spur 3: PCR-Reaktion mit 100-fach verdünnter Schablone. Spur 4: PCR-Reaktion mit 1000x verdünnter Schablone. Spur 5: (C-) - Negativkontrolle (Reaktion ohne DNA-Vorlage). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Datenanalyse und Ergebnisse

Hinweis: Das PCR-Produkt wird mit den Vorwärts-Primern (hier 8F) und den umgekehrten (hier 1492R) Primern sequenziert. Daher werden zwei Sätze von Datensequenzen generiert, einer für den Vorwärts und einer für den umgekehrten Primer. Für jede Sequenz werden mindestens zwei Dateitypen erzeugt: i) eine Textdatei mit der DNA-Sequenz und ii) ein DNA-Chromatogramm, das die Qualität des Sequenzierungslaufs anzeigt.

1. Öffnen Sie für die Vorwärtsgrundierung das Chromatogramm, und untersuchen Sie die Sequenz sorgfältig. Ein ideales Chromatogramm für eine Qualitätssequenz sollte gleichmäßig eimierte Spitzen und wenig oder gar keine Hintergrundsignale haben (Abbildung 5A).
2. Wenn das Chromatogramm nicht hochwertig ist, sollte die Sequenz verworfen oder die Sequenztextdatei entsprechend den folgenden Kriterien überarbeitet werden:
   1. Das Vorhandensein von Doppelspitzen im gesamten Chromatogramm weist auf das Vorhandensein mehrerer DNA-Vorlagen hin. Dies kann der Fall sein, wenn die Bakterienkultur nicht rein war. Eine solche Sequenz sollte verworfen werden (Abbildung 5B).
   2. Ein mehrdeutiges Chromatogramm kann aus dem Vorhandensein unterschiedlicher farbiger Spitzen an der gleichen Stelle entstehen. Einer der häufigsten Fehler ist das Vorhandensein von zwei verschiedenen farbigen Spitzen in der gleichen Position und unsachgemäße Zuweisung der Basen durch die Sequenzierungssoftware (Abbildung 5C). Korrigieren Sie alle falsch zugewiesenen Nukleotide manuell und bearbeiten Sie sie in der Textdatei.
   3. Chromatogramme mit niedriger Auflösung können zu "breiten Spitzen" führen, die in diesen Regionen häufig zu Fehlzählungen der Nukleotide führen (Abbildung 5D). Dieser Fehler ist schwer zu korrigieren, und daher sollten mögliche Inkongruenzen im weiteren Ausrichtungsschritt nicht als zuverlässig behandelt werden.
   4. Schlechte Chromatogramm-Lesequalität und das Vorhandensein mehrerer Spitzen ist häufig an den 5' und 3' Enden der Sequenz zu sehen. Einige Sequenzer-Software entfernt diese minderwertigen Fragmente automatisch(Abbildung 5E), und die Nukleotide sind nicht in der Textdatei enthalten. Wenn Ihre Sequenz nicht automatisch abgeschnitten wurde, bestimmen Sie die minderwertigen Fragmente(z.B. schwaches Signal, überlappende Spitzen, Auflösungsverlust) an den Enden und entfernen Sie die entsprechenden Basen aus der Textdatei.

Abbildung 5: Beispiele für die Fehlerbehebung bei der DNA-Sequenzierung. A) Ein Beispiel für eine hochwertige Chromatogrammsequenz (gleichmäßig verteilte, eindeutige Spitzen). B) Schlechte Qualität Sequenz, die in der Regel am Anfang des Chromatogramms auftritt. Der Grauzonenbereich gilt als minderwertig und wird von der Sequenzierungssoftware automatisch entfernt. Weitere Basen können manuell getrimmt werden. C) Vorhandensein von Doppelspitzen (durch Pfeile angezeigt). Ein Nukleotid, das durch den roten Pfeil angezeigt wird, wurde vom Sequenzer als "T" (roter Peak) gelesen, aber der blaue Peak ist stärker, und es kann auch als "C" interpretiert werden. D) Überlappende Spitzen weisen auf eine DNA-Kontamination hin(d. h. mehr als eine Schablone). E) Verlust der Auflösung und so genannte "breite Spitzen" (gekennzeichnet durch Rechteck), die zuverlässige Basisrufe verhindern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Wiederholen Sie 3.1 und 3.2 für die umgekehrte Grundierung.
4. Zusammenstellen Sie schließlich die Vorwärts- und Rückwärtssequenzen in einer zusammenhängenden Sequenz. Ein guter Sequenzierungslauf ergibt eine Sequenz von bis zu 1100 bp. Wenn man bedenkt, dass das PCR-Produkt 1500 bp lang ist, sollten sich die Sequenzen, die mit Vorwärts- und Reverse-Primern erhalten wurden, teilweise überlappen.
   1. Zusammenführen Sie die beiden Sequenzen mit dem DNA-Sequenzbauprogramm, z.B. einem freien Werkzeug wie CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3) (15).
   2. Fügen Sie die beiden Sequenzen im FASTA-Format in das angegebene Feld ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Absenden" und warten Sie, bis die Ergebnisse zurückgegeben werden.
   3. Um die montierte Sequenz anzuzeigen, drücken Sie "Contigs" in der Ergebnis-Registerkarte. Um die Details der Ausrichtung anzuzeigen, drücken Sie "Montagedetails".
      Anmerkung 1: Wenn CAP3-Software für die Contig-Assembly verwendet wird, ist es nicht erforderlich, die umgekehrte Primersequenz in Reverse-Komplementär zu konvertieren. Dieser Schritt kann jedoch erforderlich sein, wenn ein anderes Programm verwendet wird.
      Anmerkung 2: Das FASTA-Format ist ein textbasiertes Format, das die Nukleotidsequenz darstellt. Die erste Zeile (die Beschreibungszeile) in einer FASTA-Datei beginnt mit dem Symbol ">", gefolgt vom Namen oder einem eindeutigen Bezeichner der Sequenz. Der Beschreibungszeile folgt die Nukleotidsequenz. Fügen Sie Ihre Sequenzen im folgenden Format ein:
      
      >sequenz_frw_primer
      Fügen Sie Ihre Sequenz aus der Textdatei hier ein
      >sequence_rvs_primer
      Fügen Sie Ihre Sequenz aus der Textdatei hier ein
5. Führen Sie eine Datenbanksuche durch, indem Sie die Website für das Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) besuchen.
   1. Wählen Sie das Werkzeug "Nukleotid BLAST", um Ihre Sequenz mit der Datenbank zu vergleichen.
   2. Geben Sie Ihre Sequenz (das in 3.5 zusammengebaute Kontus) in das Textfeld "Abfragesequenz" ein und wählen Sie dann im Scroll-Down-Menü die Datenbank "16S rRNA-Sequenzen (Bakterien und Archea)" aus.
   3. Drücken Sie die Taste "BLAST" am unteren Rand der Seite. Die ähnlichsten Sequenzen werden zurückgegeben. Ein BLAST-Beispiel ist in Abbildung 6dargestellt. Im vorgestellten Experiment ist der Top-Hit B. subtilis Stamm 168, der eine 100%ige Identität mit der in der BLAST-Datenbank verfügbaren Sequenz zeigt.
   4. Wenn der obere Treffer keine 100%ige Identität anzeigt, gehen Sie zur Ausrichtung, und überprüfen Sie, ob es nicht stimmt. Wenn Sie auf den Top-Hit klicken, werden Sie zu den Details der Ausrichtung weitergeleitet. Ausgerichtete Nukleotide werden durch kurze vertikale Linien verbunden, während nicht übereinstimmende Nukleotide einen Abstand zwischen ihnen haben. Kehren Sie zum Chromatogramm zurück, das Sie von der Sequenzierungsfirma erhalten haben, und überarbeiten Sie die Sequenz erneut mit dem Fokus auf die nicht übereinstimmende Region. Korrigieren Sie die Reihenfolge, wenn weitere Fehler gefunden werden. Führen Sie BLAST erneut mit der korrigierten Sequenz aus.

Abbildung 6: Beispiel für das Nukleotid BLAST-Ergebnis. 16S rRNA Gensequenz aus rein Kultur von B. subtilis 168 wurde als Abfragesequenz verwendet. Der Top-Hit zeigt wie erwartet 100% Identität (unterstrichen) zum B. subtilis-Stamm 168. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.