Wachstumskurven: Erzeugen von Wachstumskurven mit Hilfe von koloniebildenden Einheiten und Messungen der optischen Dichte

Bakterien vermehren sich durch einen Prozess, der als Zellteilung bezeichnet wird und zu zwei identischen Tochterzellen führt. Wenn die Wachstumsbedingungen günstig sind, wachsen die Bakterienpopulationen exponentiell.

Bakterienwachstumskurven stellen die Menge der Bakterien in einer Kultur als Funktion der Zeit dar. Eine typische Wachstumskurve verläuft in vier Phasen: Verzögerungsphase, Exponentialphase, stationäre Phase und Todesphase. Die Verzögerungsphase ist die Zeit, die Bakterien benötigen, um einen Zustand zu erreichen, in dem sie schnell wachsen und sich teilen können. Danach gehen die Bakterien in die exponentielle Phase über, die durch schnelles Zellwachstum und -teilung gekennzeichnet ist. Die Rate des exponentiellen Wachstums der Bakterienkultur während dieser Phase kann als Verdopplungszeit ausgedrückt werden, die schnellste Rate, mit der sich Bakterien unter bestimmten Bedingungen vermehren können. Es folgt die stationäre Phase, in der das Wachstum der bakteriellen Zellen ein Plateau erreicht und sich die Wachstums- und Sterberaten aufgrund des Nährstoffmangels in der Umwelt ausgleichen. Schließlich gehen die Bakterien in die Todesphase über. Hier geht das Bakterienwachstum stark zurück und ein starker Nährstoffmangel führt zur Lyse der Zellen.

Es können zwei Techniken verwendet werden, um die Menge der in einer Kultur vorhandenen Bakterien zu quantifizieren und eine Wachstumskurve zu erstellen. Die erste davon erfolgt über koloniebildende Einheiten oder KBEs. Um KBE zu erhalten, wird eine Ein- bis Zehnerreihe von neun Verdünnungen zu regelmäßigen Zeitpunkten durchgeführt. Die erste dieser Verdünnungen, in diesem Beispiel negativ, enthält 9 ml PBS und 1 ml der Bakterienkultur. Daraus ergibt sich ein Verdünnungsfaktor von 1:10. Dann wird 1 ml dieser Lösung in das nächste Röhrchen übertragen, minus zwei, was zu einem Verdünnungsfaktor von 1:100 führt. Dieser Prozess setzt sich durch das letzte Rohr fort, minus neun, was zu einem endgültigen Verdünnungsfaktor von 1:1 Milliarden führt. Danach werden 100 Mikroliter jeder Verdünnung plattiert. Anschließend werden die Platten inkubiert und die klonalen Kolonien gezählt. Die Verdünnungsplatte für einen bestimmten Zeitpunkt, der zwischen 30 und 300 Kolonien wächst, wird verwendet, um die KBE pro Milliliter für diesen Zeitpunkt zu berechnen.

Die zweite gängige Methode zur Messung der Bakterienkonzentration ist die optische Dichte. Die optische Dichte einer Kultur kann sofort in Bezug auf einen Medienrohling mit einem Spektralphotometer gemessen werden. Typischerweise wird für diese Messungen eine Wellenlänge von 600 Nanometern, auch OD600 genannt, verwendet, die mit zunehmender Zelldichte zunimmt. Die optische Dichte ist zwar weniger präzise als bei KBEs, aber praktisch, da sie sofort erhalten werden kann und relativ wenige Reagenzien benötigt. Beide Techniken können zusammen verwendet werden, um eine Standardkurve zu erstellen, die die Bakterienzellzahl einer Kultur genauer annähert. In diesem Video erfahren Sie, wie Sie KBEs und OD600-Messungen aus zeitgesteuerten seriellen Verdünnungen von E. coli erhalten. Anschließend werden zwei Wachstumskurven unter Verwendung der CFU- bzw. OD600-Messungen aufgetragen, bevor sie durch eine Standardkurve in Beziehung gesetzt werden.

Bei der Arbeit mit Bakterien ist es wichtig, die geeignete persönliche Schutzausrüstung wie einen Laborkittel und Handschuhe zu verwenden und die richtige aseptische Technik zu beachten.

Danach sterilisieren Sie den Arbeitsplatz mit 70%igem Ethanol. Bereiten Sie zunächst die LB-Brühe und das LB-Festagarmedium in separaten autoklavierbaren Flaschen vor. Nachdem Sie die Verschlüsse der Flaschen teilweise verschlossen haben, sterilisieren Sie das Medium in einem Autoklaven bei 121 Grad Celsius für 35 Minuten. Lassen Sie anschließend das Agarmedium in einem auf 50 Grad Celsius eingestellten Wasserbad 30 Minuten lang abkühlen. Nach dem Abkühlen 20 bis 25 ml in jede Petrischale geben. Lassen Sie die Platten danach 24 Stunden bei Raumtemperatur aushärten.

Um die Einzelkolonie-Isolate vorzubereiten, die später zur Herstellung einer flüssigen Bakterienkultur verwendet werden, verwenden Sie zuvor gefrorenen Brühe und die richtige Streifenplattierungstechnik, um E. coli für die Isolierung auf LB-Agar zu streifen. Inkubieren Sie das Gericht über Nacht bei 37 Grad Celsius. Kühlen Sie danach eine flammsterilisierte Impfschlaufe auf dem Agar ab, bevor Sie eine einzelne Kolonie aus der gestreiften Platte auswählen. Beimpfen Sie 4 mL flüssiges Medium in einem 15 mL Reagenzglas. Dann züchten Sie die E. coli über Nacht bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 210 U/min.

Um das 1:1000-Volumen der Bakterienkultur einzurichten, das in der Wachstumskurve verwendet wird, besorgen Sie sich zunächst einen autoklavierten 500-ml-Erlenmeyerkolben. Verwenden Sie dann eine serologische 50-ml-Pipette, um 100 mL steriles Medium in den Kolben zu übertragen. Beschriften Sie anschließend neun 15-ml-Reagenzgläser nacheinander als eins bis neun. Diese Zahlen entsprechen dem Verdünnungsfaktor, der zur Berechnung der koloniebildenden Einheit (KBE) verwendet wird. Geben Sie dann 9 ml 1X PBS in jedes Röhrchen. Danach beschriften Sie die vorbereiteten Agarplatten mit den entsprechenden Zeitpunkten und Verdünnungsfaktoren, die gezüchtet werden. In diesem Beispiel mit E. coli werden nach dem Startzeitpunkt einmal pro Stunde Zeitpunkte genommen. Unter Verwendung der zuvor über Nacht vorbereiteten flüssigen E. coli-Kultur wird das Medium im 500-ml-Erlenmeyerkolben des Autoklaven mit einem Kulturvolumen von 1:1000 beimpft. Schwenken Sie das Medium, um die Bakterien gleichmäßig zu verteilen.

Reinigen Sie die Küvette nach dem Ausblenden eines Spektralphotometers mit einem fusselfreien Tuch. Geben Sie anschließend 1 ml der Kultur in die Küvette und legen Sie sie in das Spektralphotometer, um die optische Dichte der Kultur zum Zeitpunkt Null zu erhalten. Dann züchten Sie die E. coli bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 210 U/min. Zu jedem Zeitpunkt nach dem Nullpunkt wird weitere 1 ml Bakterienkultur aus dem Kolben entnommen und die Messung der optischen Dichte wiederholt. Wenn die optische Dichte größer als 1,0 ist, verdünnen Sie 100 Mikroliter Bakterienkultur mit 900 Mikrolitern frischem Medium und messen Sie dann die optische Dichte erneut. Dieser Wert kann für die OD 600-Messung mit 10 multipliziert werden.

Um die Messung der koloniebildenden Einheit für jeden Zeitpunkt zu erhalten, entnehmen Sie zu jedem Zeitpunkt zusätzlich 1 ml Bakterienkultur aus dem Kolben. Geben Sie die Bakterienkultur in das negative Reagenzglas und wirbeln Sie sie zum Mischen. Führen Sie dann die Verdünnungsreihe durch, indem Sie zuerst 1 ml aus dem negativen einen Röhrchen in das negative Röhrchen mit zwei Röhrchen überführen und zum Mischen vortexen. Übertragen Sie 1 ml von den negativen zwei Röhrchen in die negativen drei Röhrchen und wirbeln Sie sie zum Mischen auf. Setzen Sie diese serielle Übertragung über alle Verdünnungsröhren bis zur Minusröhre mit neun Röhren fort. Für jede Verdünnung werden 100 Mikroliter Zellsuspension auf die entsprechend beschriftete Platte gegeben. Für jede Verdünnung sterilisieren Sie einen Zellspreizer in Ethanol, führen Sie ihn durch eine Bunsenbrennerflamme und kühlen Sie ihn ab, indem Sie die Oberfläche des Agars vom Impfstoff weg berühren. Verwenden Sie dann den Zellspreizer, um die Zellsuspension zu verteilen, bis die Oberfläche der Agarplatte trocken wird. Inkubieren Sie die Platten kopfüber bei 37 Grad Celsius. Sobald sichtbare Kolonien entstehen, zähle die Anzahl der Bakterienkolonien auf jeder Platte. Notieren Sie diese Werte und die zugehörigen Verdünnungsfaktoren für jede Platte zu jedem Zeitpunkt.

Um eine Wachstumskurve des BK 600 zu erstellen, wählen Sie nach dem Sicherstellen, dass alle Datenpunkte korrekt in eine Tabelle eingegeben wurden, alle Zeitpunkte und die entsprechenden Daten aus. Um ein Diagramm der Wachstumskurve für koloniebildende Einheiten zu erstellen, wählen Sie die Verdünnungsplatte aus, bei der die Koloniezahlen für jeden Zeitpunkt in den Bereich von 30 bis 300 Bakterien fielen. Multiplizieren Sie die Anzahl der Kolonien mit dem Verdünnungsfaktor und dann mit zehn. Dies liegt daran, dass die Streuung von 100 Mikrolitern bei der Berechnung der koloniebildenden Einheiten pro Milliliter als zusätzliche Verdünnung im Verhältnis 1:10 berücksichtigt wird. Zeichnen Sie anschließend die koloniebildenden Einheiten über der Zeit auf einer Semi-Log-Skala auf.

Diese Plots, die mit OD 600- bzw. CFU-Messungen erstellt wurden, können wertvolle Informationen über die Wachstumskinetik von E. coli liefern. Die optische Dichte und die koloniebildenden Einheiten können in Beziehung gesetzt werden, so dass KBE pro Milliliter aus OD 600-Messungen geschätzt werden können, was bei zukünftigen Experimenten Zeit und Material spart.

Zu diesem Zweck werden die koloniebildenden Einheiten gegen die optische Dichte auf einer linearen Skala für OD 600-Messwerte kleiner oder gleich 1 aufgetragen. 0. Generieren Sie anschließend eine lineare Regressionstrendlinie im Format Y = MX + B, wobei M die Steigung und B der Y-Achsenabschnitt ist. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Datenpunkte und wählen Sie Trendlinie und linear hinzufügen. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen, um die Gleichung im Diagramm anzuzeigen und den R-Quadrat-Wert im Diagramm anzuzeigen. Der R-Quadrat-Wert ist das statistische Maß dafür, wie genau die Daten mit der angepassten Regressionslinie übereinstimmen. In diesem Beispiel werden die ersten 6 Zeitpunkte mit OD 600 auf der x-Achse und KBE pro Milliliter auf der y-Achse aufgetragen. In zukünftigen Experimenten mit den gleichen Wachstumsbedingungen können diese Steigungs- und y-Achsenabschnittswerte in diese Gleichung eingefügt werden, um KBE aus OD 600-Messwerten zu schätzen. Schauen Sie sich als Nächstes das Diagramm der Wachstumskurve der koloniebildenden Einheit an. Identifizieren Sie während der Exponentialphase zwei Zeitpunkte mit der steilsten Steigung dazwischen. Um die Verdopplungszeit zu berechnen, berechnen Sie zunächst die Zeitänderung zwischen den ausgewählten Zeitpunkten. Berechnen Sie dann die Veränderung in den Generationen mit der hier gezeigten Gleichung. Dabei ist der Kleinbuchstabe b die Anzahl der Bakterien zum Zeitpunkt drei und der Großbuchstabe b die Anzahl der Bakterien zum Zeitpunkt zwei. Teilen Sie schließlich die Zeitveränderung durch die Veränderung der Generationen. In diesem Beispiel ist die Verdopplungszeit 0. 26 Stunden oder 15 Minuten und 19 Sekunden. Der Vergleich der Verdopplungszeiten über verschiedene experimentelle Behandlungen hinweg ermöglicht es uns, die besten Wachstumsbedingungen für eine bestimmte Bakterienart zu identifizieren. Daher ist die Behandlung mit der geringsten Verdopplungszeit unter den getesteten Bedingungen am optimalsten.