Antibiotika-Empfindlichkeitstests: Epsilometertests zur Bestimmung der MHK-Werte von zwei Antibiotika und zur Bewertung der Antibiotika-Synergie

1. Epsilometer-Tests (E-Tests)

1. gliederung
   1. Handschuhe und laborator
   2. Bereiten Sie den Arbeitsplatz bereit, indem Sie ihn mit 70% Ethanol sterilisieren
   3. Sammeln Mueller-Hinton Agar Platten (MHA Platten)
2. Vorbereitung eines McFarland Trübungsstandards Nr. 0,5
   1. Bereiten Sie eine 1%ige Lösung von Bariumchlorid (BaCl₂) vor:
      1 Gramm wasserfreies Bariumchlorid (BaCl₂) in 100 ml destilliertes Wasser geben. Wirbel gut.
   2. Bereiten Sie eine 1% Lösung von Schwefelsäure (H₂SO₄):
      1 ml konzentriertes_H2SO₄ in 99 ml destilliertem Wasser hinzufügen. Wirbel gut.
   3. Vorbereiten eines McFarland Trübungsstandards Nr. 0.5:
      50 l BaCl₂ Lösung in 5 ml 1%_H2SO₄ Lösung. Wirbel die Lösung gut, um eine trübe Suspension zu erhalten.
   4. Halten Sie McFarland Trübungsstandard Nr. 0.5 in einem folienbedeckten Rohr. Bei 25°C maximal 6 Monate lagern. Vortex gut zu einer homogenen Lösung vor dem Gebrauch.
3. Vorbereitung von MHA-Platten
   1. Scrape Streptococcus Gruppe G Bakterien aus Blut Agar Platte mit einer sterilen Schleife. Mischen Sie in 1ml von Saline, und Wirbel zu einer Suspension der Bakterien.
   2. Vergleichen Sie die Suspension mit einem McFarland-Standard Nr. 0.5, um die gleiche Trübung zu erreichen, um während der Experimente die gleiche Inokulumgröße zu haben. Passen Sie die Konzentration entweder mit zusätzlicher Saline oder Bakterien an.
   3. Impfen Sie die MHA-Platten mit einem sterilen Baumwoll-Kippapplikator. Wischen Sie die Platte sanft, um die Oberfläche zu bedecken. Fahren Sie mit einer der drei unten beschriebenen Methoden fort (1.4-1.6).
4. Einzelantibiotika-Resistenztest. Streptokokken Gruppe G, Widerstand gegen Penicillin G oder Gentamicin 
   1. Legen Sie einen E-Teststreifen (entweder Penicillin G oder Gentamicin) in die Mitte der MHA-Platte (Abbildung 1 A,B).
   2. 18-20 Stunden, 37°C inkubieren.
   3. Lesen Sie die Ergebnisse. MIC wird als Hemmungszone gemessen, die den abgestuften Antibiotika-Teststreifen schneidet (Abbildung 1 C,D).

Abbildung 1: Einzel-E-Test. Platzierung eines E-Teststreifens von A) Penicillin G und B) Gentamicin auf einer Mueller Hinton Agarplatte, die mit Bakterienkolonien einer Gruppe G Streptokokken vor (A und B) und nach (C und D) über Nacht bedeckt ist Inkubation bei 37°C 5%_CO2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Synergie-Test-Cross-Ansatz. Streptococcus Gruppe G, Widerstand gegen Penicillin G und Gentamicin.
   1. Legen Sie zwei E-Teststreifen mit verschiedenen Antibiotika (z.B. Penicillin G und Gentamicin) in einer Kreuzformation auf die geimpfte MHA-Platte.
      1. Um die genauesten Ergebnisse zu erzielen, zielen Sie darauf ab, das Kreuz in einem Winkel von etwa 90° am Schnittpunkt zwischen den Skalen bei ihren MIC-Werten zu platzieren, der zuvor auf einem einzigen Antibiotikaresistenztest ermittelt wurde (Abbildung 2 A).
      2. Beachten Sie, dass die Streifen, sobald sie auf die Agarplatte gelegt wurden, nicht bewegt werden sollten, da einige Antibiotika möglicherweise bereits von der Platte absorbiert wurden. Daher ist es besser, die Streifen in einem leicht falschen Winkel (z.B. 85°) und bis zu 1-2 mm vom tatsächlichen MIC-Wert zu halten. Es wird empfohlen, das Experiment in Dreifacharbeit durchzuführen, um dieses Problem zu reduzieren.
   2. 18-20 Stunden, 37°C inkubieren.
   3. Lesen Sie die Ergebnisse. MIC wird als Hemmungszone gemessen, die den abgestuften Antibiotika-Teststreifen auf jedem e-Teststreifen schneidet (Abbildung 2 B).
   4. Verwenden Sie die Formel für die fraktionelle hemmende Konzentration (FIC) (Gleichung 1), um Synergien zu bestimmen.

Abbildung 2: Synergismus-Erkennung - Kreuztest. Ergebnisse der antimikrobiellen Synergietests von MIC von Penicillin G und Gentamicin auf Streptococcus Gruppe G vor (A) und nach (B) Inkubation über Nacht bei 37°C 5%_CO2. Zwischen den beiden einzelnen MIC-Werten wird ein 90°-Winkel gebildet (Penicillin G: 0,094 g/ml, Gentamicin: 8 g/ml). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Synergy-Test-Non-Cross-Ansatz. Streptococcus Gruppe G, Widerstand gegen Penicillin G und Gentamicin.
   1. Platzieren Sie den E-Teststreifen in der Mitte der MHA-Platte (Abbildung 3 A,D).
   2. Markieren Sie, wo sich der zuvor ermittelte MIC-Wert auf jedem Streifen befand.
   3. 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
   4. Entsorgen Sie den E-Teststreifen für jede MHA-Platte (Abbildung 3 B,E).
   5. Platzieren Sie den zweiten E-Teststreifen (der ein anderes Antibiotikum enthält) auf den Bereich des zuvor entfernten Streifens, so dass ihre MIC-Werte der Marke entsprechen und ausgerichtet sind.
   6. 18-20 Stunden, 37°C inkubieren.
   7. Lesen Sie die Ergebnisse. MIC wird als Hemmungszone gemessen, die den abgestuften Antibiotika-Teststreifen auf jedem e-Teststreifen schneidet (Abbildung 3 C,F).
   8. Zur Bestimmung der Synergie wird die Formel für die fraktionelle hemmende Konzentration (FIC) verwendet (Gleichung 1).

Abbildung 3: Synergismus-Erkennung - Nicht-Kreuztest. Ergebnisse der antimikrobiellen Synergietests von MIC von Penicillin G und Gentamicin auf Streptococcus Gruppe G. A) Gentamicin-Streifen (8 g/ml zentriert) auf der Oberseite der Streptococcus-Gruppe G-Bakterien, B) Entfernung von Gentamicin-Streifen, C ) Kombinierter Gentamicin/ Penicillin-G-Streifen (0,094 g/ml zentriert) auf der Oberseite der Streptococcus-Gruppe G-Bakterien, D) Penicillin-G-Streifen (0,094 g/ml zentriert), E) Entfernung von Penicillin G-Streifen, F) Kombiniertes Penicillin G / Gentamicin-Streifen (8 g/ml zentriert) auf streptococcus Gruppe G Bakterien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Brühenprüfung

1. gliederung
   1. Handschuhe und laborator
   2. Bereiten Sie den Arbeitsplatz bereit, indem Sie ihn mit 70% Ethanol sterilisieren
   3. Sammeln Sie 15mL MH Brühe mit 50% lysiertem Pferdeblut und 20 mg/ml n-NAD (MH-F)
2. (Optional) Führen Sie einen E-Test [Protokoll 1] durch, um das MIC auf Festkörpermedium zu bestimmen.
   1. Obwohl optional, ermöglicht ein solches Wissen eine bessere experimentelle Konstruktion (z. B. können die Konzentrationen von Antibiotika, die hinzugefügt werden, so konzipiert werden, dass sie den von der Platte ermittelten MIC-Wert umgeben), wodurch die Chancen für ein erfolgreiches Experiment verbessert werden.
3. Vorbereitung eines bakteriellen Inokulums. Wie bereits erwähnt, kann die Bakterielle Konzentration durch OD nm-Messungen oder McFarland-Trübungsstandards geschätzt werden.
   1. OD600 nm Methode
      1. Erhalten Sie eine bakterielle Suspension mit einer etablierten bakteriellen Konzentration
      2. Verdünnen Sie die Kultur in MH-F Brühe, um eine OD600 von 0.003 zu erreichen
   2. McFarland Trübungsmethode
      1. 15 ml MH-F Brühe in ein steriles Rohr geben.
      2. Impfen Sie die MH-F-Brühe mit Bakterien (von einer Platte) auf eine McFarland-Ebene. Wirbel die Lösung kräftig. Gießen Sie die Lösung in eine sterile Petrischale.
4. Zubereitung von Antibiotika
   1. Bestimmen Sie die gewünschte Antibiotikakonzentration
      1. Identifizieren Sie den MIC-Wert aus dem E-Test (z.B. 0,125 g/ml für Penicillin G und 8 g/ml für Gentamicin)
      2. Multiplizieren Sie den Agarplatten-MIC-Wert mit 2⁴-2⁷, was vier-sieben 2x seriellen Verdünnungen entspricht. Dies wird die Anfangskonzentration von Antibiotika sein. (z.B. für Penicillin G, sieben 2x serielle Verdünnungen: 0,125 g/ml x 2⁷ = 16 g/ml; für Gentamicin vier 2x serielle Verdünnungen 8 g/mL x 2⁴ = 128 g/ml
      3. Multiplizieren Sie den gewünschten Startwert 100x, um eine Lagerkonzentration der Antibiotika zu ermitteln (z. B. Bestände von 1,6 mg/ml Penicillin G und 12,8 mg/ml Gentamicin)
   2. Bereiten Sie eine 100-fache Antibiotika-Lagerkonzentration entsprechend vor
      1. Lösen Sie die Antibiotika in 10ml autoklaviertem Wasser, und Wirbel, um eine Stammlösung zu erzeugen (z. B. 16 mg Penicillin G und 128 mg Gentamicin, um die oben genannten Bestände zu schaffen)
5. Hinzufügen von Bakterien zu Mikroplattenbrunnen
   1. Aliquot 200 'l MH-F Brühe mit Bakterien inoculum zu den Brunnen in den ersten 3 Reihen einer 96-Well-Mikrotiterplatte für ein Experiment in Triplicate.
6. Hinzufügen von Antibiotika zu Mikroplattenbrunnen
   1. Fügen Sie der ersten Bohrsäule (A1, B1, C1) 200 L zusätzliche MH-F-Brühe mit Bakterien hinzu, um das Gesamtvolumen auf 400 l zu erhöhen.
   2. Fügen Sie der ersten Bohrsäule 4 L der Antibiotikakonzentration hinzu. Da die Probe 400 l enthält, führt dies zu einer 100-fachen Verdünnung der Antibiotika.
   3. Generieren Sie eine 2x serielle Verdünnung, indem Sie 200 L Bakterien/Antibiotika von A1 auf A2 bis hin zu A11 übertragen. Pipetten Sie kräftig zwischen den Verdünnungen. Wiederholen Sie den Schritt für zusätzliche Zeilen.
   4. Entfernen Sie 200 l aus der Spalte 11, so dass das Endvolumen in allen Brunnen 200 l beträgt.
   5. Lassen Sie die letzte Spalte (A12, B12, C12) ohne Antibiotika als Kontrollen.
7. Bestimmen von MIC-Werten
   1. Die 96-Well-Mikrotiterplatte 24 Stunden lang bei 37°C ohne Schütteln inkubieren.
   2. Der MIC-Wert ist definiert als der letzte Brunnen in der Verdünnungsreihe, der kein sichtbares Wachstum von Bakterien aufweist (Abbildung 4). Diesem Wert kann jedoch nur vertraut werden, wenn die ursprüngliche Inokulumgröße korrekt war.

Abbildung 4: MIC-Bestimmung durch Brüheverdünnung. MIC ist hier definiert als der letzte Brunnen, der Klarheit aufweist (kein Wachstum von Bakterien), bevor er Trübung ändert. Row sind Duplikate des MIC-Werts von Penicillin G und Zeile sind Duplikate des MIC-Werts von Gentamicin, sowohl im Vergleich zu einem Isolat der Streptococcus-Gruppe G. A) tatsächlichen experimentellen Ergebnisse, B) schematische Interpretation der Werte aus A ( grau = kein Wachstum; weiß = Wachstum). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Schematisches Verfahren der Verdünnungsreihen zur Zählung der ursprünglichen Bakterienkonzentration. Die Verdünnungen wurden wie beschrieben durchgeführt (20 l in 180 l für eine 10-fache Verdünnungsserie verdünnt), und dann werden 10 l aus den Reihen A-H auf zwei getrennten Blutagarplatten plattiert, wie angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

8. Bestimmen der ursprünglichen Inokulumgröße
   HINWEIS: Mikrobroth-Assays sind hochempfindlich für die verwendete ursprüngliche Inokulumgröße. Eine übermäßige Inokulumgröße wird ein falsch positives Ergebnis geben, da die hinzugefügten Antibiotika das Wachstum in diesem Verhältnis nicht mehr hemmen können. Daher ist es wichtig zu überprüfen, wie viel Bakterien zu den Mikrobrunnen hinzugefügt wurden. Während die Daten zum Zeitpunkt des Experiments nicht verfügbar sein werden (aufgrund der Notwendigkeit einer 24-stunden-Inkubation), dienen sie als Kontrolle. Liegt die Anzahl der zugesetzten Bakterien innerhalb des angegebenen Konzentrationsbereichs, können die MIC-Werte vertrauenswürdig sein. Wenn das Inokulum zu hoch oder zu niedrig war, muss das Experiment wiederholt werden.
   1. Die Bakterien seriell verdünnen
      1. Bereiten Sie eine 96-Well-Mikrotiterplatte vor, um die ursprüngliche bakterielle Konzentration zu verdünnen, um die Inokulumgröße zu bestimmen. Das Optimum ist ein Volumen von 200 l mit 10^5-6 Bakterien. Um die Verdünnungen durchzuführen, zuerst aliquot 180 l sterile PBS zu jedem Brunnen in B-H (in Dreifach1-3).
      2. Als nächstes fügen Sie A 100 l bakterielle Lösung hinzu (in dreifacher 1-3).
      3. Generieren Sie eine 10-fache serielle Verdünnung (in Dreifacharbeit), indem Sie 20-l-Bakterien von A nach B übertragen, pipet kräftig. Wiederholen Sie die Schritte für C-H.
   2. Platte die bakteriellen Verdünnungen für inokulum Größenbestimmung
      1. Markieren Sie Blut-Agar-Platten nach Abbildung 5.
      2. 10 l von der seriellen Verdünnung auf die Platte nach Abbildung 5übertragen.
      3. Inkubieren Sie die Platte bei 37°C für 20-24 Stunden.
   3. Bestimmen Sie die bakterielle Inokulumgröße
      1. Zählen Sie die Bakterienzahl in Flecken innerhalb von 5-50 Kolonien (Abbildung 6).
      2. Berechnen Sie die anfängliche Inokulumgröße, indem Sie den Mittelwert der Dreifachproben berechnen, multiplizieren Sie mit dem Verdünnungsfaktor (z. B. 10x für B-Proben, 100x für C-Proben, 1000x für D-Proben usw.) und dann mit 100, um das Aufspürvolumen von 10 Inokulumgröße in cfu/mL. Wenn sich das Inokulum innerhalb von 10^5-6 cfu/mL befindet, können die MIC-Daten vertrauenswürdig sein.

Abbildung 6: Bestimmung der Inokulumgröße. Bakterien, die gemäß Abbildung 5 geimpft wurden, wurden 20-24 Stunden bei 37°C inkubiert und dann gezählt. Reihe D hat eine gute Anzahl von Kolonien zu zählen (z.B. 5-50). Die Proben in A sind unverdünnt, B wird 10x verdünnt, C wird 100x verdünnt und D wird 1000x verdünnt, und an jedem Punkt werden nur 10 l plattiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.