Plaque-Assay: Eine Methode zur Bestimmung des Virustiters als Plaque bildende Einheiten (PFU)

1. Einrichtung

1. Bevor Sie mit einer Arbeit mit Mikroben zu tun haben, stellen Sie sicher, dass der Arbeitsraum sterilisiert ist(z. B. mit 70% Ethanol abgewischt). Tragen Sie immer einen Labormantel und Handschuhe, halten Sie lange Haare zurück gebunden, und stellen Sie sicher, dass alle Wunden besonders gut geschützt sind.
2. Nach fertigstellungen Jahren alle Oberflächen sterilisieren und Hände und Handgelenke gründlich waschen/sterilisieren.

2. Protokoll

1. LB Medienvorbereitung
   Hinweis: Je nach dem wirtsbakteriellen Stamm und dem Bakteriophagen kann ein anderes flüssiges Medium für die anfängliche Kultivierung des Wirts-Bakterienstamms besser geeignet sein oder ein anderes festes Medium für das spätere Wachstum besser geeignet sein. Lysogenese Brühe (LB) wird in diesem Protokoll für die Brühe und den Agar verwendet.
   1. Mischen Sie 4 g LB in 200 ml destilliertem Wasser, in Dreifacher Ausführung, für die LB-Brühe, den festen Unteren Agar und den weichen Top-Agar. Alle Lösungen sollten in Containern vorbereitet werden, die das Doppelte des Endvolumens aufnehmen können, um einen Überlauf beim Autoklavieren zu verhindern.
      Hinweis: Wenn Sie den Test in dreifacher Ausfertigung durchführen, bereiten Sie die doppelte Menge an LB-Bodenagar vor.
   2. Stellen Sie den pH-Wert aller drei Lösungen mit NaOH oder HCl entsprechend auf 7,4 ein.
   3. Fügen Sie 3 g Agar-Power auf die untere Agar-Flasche, um eine 1,5% Agar-Lösung für den festen Agar zu machen
   4. Fügen Sie 1,2 g Agar-Power in die obere Agar-Flasche, um eine 0,6% Agar-Lösung für weiche Agar zu machen.
   5. Legen Sie die Flaschen mit halbfestangezogenen Kappen in einen Autoklaven, der auf 121°C für 20 min eingestellt ist, um die Lösungen zu sterilisieren. Schließen Sie die Kappen, sobald der Lauf beendet ist, um eine Kontamination zu verhindern.
   6. Wenn das LB-Medium eine Temperatur von ca. 45-50°C erreicht hat, fügen Sie 450 l sterile 1 M CaCl₂ zu allen drei der 200 ml LB-Lösungen hinzu, um eine Endkonzentration von 2,25 mM zu erreichen.
   7. 15 ml Aliquots des festen Agarmediums in sterile Petrischalen gießen (Schütteln vermeiden, um Schaumbildung zu verhindern) und lassen Sie den Agar für ein paar Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur erstarren (Abbildung 4A). Platten können bei 4°C mehrere Tage auf dem Kopf gelagert werden.
2. Kultivieren von Wirtszellen
   1. Einen Tag vor dem Test 10 L E. coli-Kultur zu 10 ml LB-Brühe hinzufügen.
   2. Inkubieren Sie die Bakterien bei 37°C über Nacht bei 160 Rpm in einem Schüttelbrutzentrum.
   3. Am Morgen des Assays, fügen Sie 0,5 ml der Nachtkultur zu 10 ml frische LB.
      Hinweis: Wenn Sie den Test in dreifacher Ausfertigung durchführen, bereiten Sie die doppelte Menge dieser Kultur vor.
   4. Inkubieren Sie die bei 37°C bei 160 Rpm in einem Schüttelinkubator, bis sich die Bakterienkultur im Wachstum der Logphase befindet. Dies kann spektrophotometrisch durch eine OD600 von 0,5-0,7 bestimmt werden.
   5. Halten Sie die Kultur bei Raumtemperatur, bis die Bakterien dem oberen LB-Agar hinzugefügt werden sollen.
3. 10-fache serielle Verdünnung von Bakteriophagen
   1. 180 L LB-Brühe in sieben Brunnen in der ersten Reihe einer 96-Well-Platte hinzufügen
      Hinweis: Es wird vorgeschlagen, die Verdünnung in Dreifacharbeit durchzuführen, um ihre statistische Zuverlässigkeit zu erhöhen. Bereiten Sie dazu zusätzliche Verdünnungen des Bakteriophagens in der zweiten und dritten Reihe der Platte vor.
   2. Wirbeln Sie vorsichtig die ursprüngliche Bakteriophagenprobe, um homogene Zusicherung zu gewährleisten und übertragen Sie 20 l in den ersten Brunnen.
   3. Mischen Sie die Probe gut durch Pipettieren und nach unten.
   4. Übertragen Sie 20 l der resultierenden Suspension in den zweiten Brunnen.
   5. Setzen Sie die serielle Verdünnung fort, indem Sie 20 l der Lösung im zweiten Brunnen in den dritten Brunnen übertragen, und so weiter, bis zum sechsten Brunnen, so dass der siebte Brunnen sowie eine negative Kontrolle, zu der keine Phagen-Suspension hinzugefügt wird. Dadurch wird ein Verdünnungsbereich von 10^-1-10^-6erstellt.
4. versilberung
   1. Beschriften Sie die Basis der Petrischalen (zuvor in Schritt 2.1.7) mit Name, Datum und einer kurzen Probenbeschreibung (einschließlich des Verdünnungsfaktors der Phagenprobe). Die Petrischalen im 37°C-Inkubator eine Stunde vor dem Assay vorheizen.
   2. Schmelzen Sie das erstarrte weiche Agar-Medium (typischerweise mit einer Mikrowelle; erstarrter Agar schmilzt bei 85°C), und lassen Sie es auf etwa 45°C kommen. Das beheizte Medium kann in einem 45°C-Wasserbad für 1h platziert werden, um eine entsprechende Temperatur zu erreichen. Es sollte heiß genug sein, um in flüssiger Form zu bleiben, aber kühl genug, um zugesetzte Bakterien nicht abzutöten.
   3. 4 ml Bakterienkultur (ab Schritt 2.2) mit 35 ml LB Soft Agar (bei 45°C) mischen. Wirbeln Sie, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, aber vermeiden Sie Schütteln, um Schaumbildung zu verhindern (Abbildung 4A).
   4. Etikettieren Sie ein steriles Reagenzglas für jeden der seriellen Verdünnungsschritte und eines für die Kontrollprobe für insgesamt 7 beschriftete Reagenzgläser. 5 ml Aliquots der Bakterienkultur/Soft-Agar-Mischung aus Schritt 2.4.3 in die 7 Röhren geben. Arbeiten Sie schnell durch Schritt 2.4.6, da solche kleinen Mengen von agar-basierten Medien schnell bei Raumtemperatur verfestigen.
   5. Fügen Sie 100 l der Kontrollprobe (ab Schritt 2.3) in das Kontrollprüfrohr und wirbeln Sie vorsichtig. Entsorgen Sie die verwendete Pipettenspitze und übertragen Sie das gleiche Volumen von jeder der seriell verdünnten Bakteriophagenproben (Schritt 2.3) auf ihre jeweiligen Reagenzgläser, wirbeln, um sie zu mischen.
   6. Die 5 ml-Mischungen sofort auf die beschrifteten, vorgewärmten, festen Agarplatten geben (Abbildung 4A). Wirbeln Sie die Platten sanft, um die Mischungen gleichmäßig zu verteilen.
      Hinweis: Wenn Sie den Test in dreifacher Ausfertigung durchführen, wiederholen Sie die Schritte 2.4.3-6 zwei weitere Male.
   7. Versiegeln Sie jede Platte mit Laborfolie, und lassen Sie beide Schichten bei Raumtemperatur (ca. 15 Minuten) richtig erstarren, bevor Sie sie einen 37°C-Inkubator nach oben legen, was das Wachstum sowohl der Bakterien als auch des Phagens anregt, für 24 Stunden oder bis zu Plaques entwickeln, Es dauert in der Regel etwa 1-5 Tage für Plaques erscheinen (Abbildung 4B), aber das Timing variiert erheblich je nach Inkubationsbedingungen, Medium, und die Bakterienarten.

3. Datenanalyse und Ergebnisse

1. Zähltafeln
   1. Stellen Sie sicher, dass keine Plaques in den Schildern mit der Aufschrift "Kontrolle" sichtbar sind, da dies auf eine Viruskontamination hindeuten würde.
   2. Beginnen Sie mit den Platten mit der Bezeichnung 10^-6, die die am meisten verdünnte Bakteriophagenprobe enthalten. Zählen Sie die Plaketten, ohne den Deckel zu entfernen, und markieren Sie sie mit einem Stift, während Sie gehen, um anzugeben, welche Plaketten bereits gezählt wurden.
   3. Zählen Sie die restlichen Platten. Einige Platten haben möglicherweise zu wenige oder zu viele Plaketten, um zu zählen. Verwenden Sie die Platten mit 10-150 Plaques für die weitere Analyse.
2. Berechnung von PFU
   1. Dividieren Sie die Anzahl der Plaques durch den Verdünnungsfaktor (z.B. 10^-6 für die am meisten verdünnte Probe), um die Anzahl der Plaque forming Units (PFU) in 100 l phagengemisch zu erhalten.
      Hinweis: Wenn Sie den Test in Dreifacharbeit durchführen, verwenden Sie die durchschnittliche Anzahl der Plaques aus den drei Platten.
   2. Um die Konzentration (in PFU/ml) der Ausgangsprobe zu bestimmen, multiplizieren Sie sie mit einem zusätzlichen Verdünnungsfaktor von 10, da nur 100 l der Probe plattiert wurden. (dh )
   3. Berechnen Sie den Mittelwert der PFU/ml für alle Verdünnungen, die zwischen 10 und 150 Plaques hatten, um ein zuverlässigeres Ergebnis zu erzielen.