Plaque-Assay: Eine Methode zur Bestimmung des Virustiters als Plaque bildende Einheiten (PFU)

Bakteriophagen, auch Phagen genannt, sind Viren, die spezifisch Bakterien infizieren, und wir können ihr Vorhandensein mit einem Tool namens Plaque-Assay bestätigen und quantifizieren. Bakteriophagen infizieren ihre anfälligen Wirte, indem sie sich zunächst an die bakterielle Zellwand anheften und ihr Erbgut injizieren. Dann kapern sie die Biosynthesemaschinerie der Zelle, um ihre DNA zu replizieren und zahlreiche Nachkommen-Phagenpartikel zu produzieren, die sie dann freisetzen, indem sie die Wirtszelle lysieren und töten.

Diese lytische Aktivität ist die Grundlage einer weit verbreiteten Phagen-Zähltechnik, die als Plaque-Assay oder Doppel-Agar-Schicht-Assay bekannt ist. Hier wird zunächst ein Bakteriophagen-Mix in einer geschmolzenen Nährbrühe hergestellt, die niedrig konzentrierten Agar enthält. Alle Bakterien, die in der Mischung verwendet werden, sollten lebendig sein und sich in der logarithmischen Phase ihres Wachstums aktiv teilen, was sicherstellt, dass ein großer Prozentsatz der Bakterien lebensfähig ist und in der Lage ist, einen dichten Rasen um die Plaques herum zu bilden. Anschließend wird diese geschmolzene Bakterien-Phagen-Agar-Mischung auf einem festeren, konzentrierten Agar-Nährmedium verteilt, das bereits auf einer Petrischale verfestigt ist. Bei der Inkubation bei Raumtemperatur verfestigt sich auch die niedrig konzentrierte Agar-Phagen-Bakterien-Brühe zu einer weichen Agar-Überlagerung.

Hier können die Bakterienzellen zusätzliche Nährstoffe aus der unteren Schicht ableiten und sollten sich schnell vermehren, um einen zusammenfließenden Bakterienrasen zu erzeugen. Da jedoch auch Phagenpartikel in der weichen Schicht vorhanden sind, infizieren und vermehren diese ihr genetisches Material innerhalb der Bakterien, was in der Zelllyse gipfelt, bei der mehrere Nachkommen freigesetzt werden. Diese Phagen-Nachkommen infizieren dann die Nachbarzellen, da der halbfeste Zustand der Bakterien-Phagen-Schicht ihre Bewegung auf weiter entfernte Wirtszellen beschränkt. Dieser Zyklus von Infektion und Lyse setzt sich über mehrere Runden fort und tötet eine große Anzahl von Bakterien in einem lokalisierten Bereich ab. Der Effekt, wenn die benachbarten Zellen zerstört werden, besteht darin, eine einzige kreisförmige klare Zone zu erzeugen, die als Plaque bezeichnet wird und mit bloßem Auge gesehen werden kann, wodurch die lytische Aktivität der Bakterien der Phagen effektiv verstärkt und ihre Zählung ermöglicht wird.

Die Anzahl der Plaques auf einer Petrischale wird als Plaque-bildende Einheiten oder PFUs bezeichnet und sollte, vorausgesetzt, die anfängliche Bakteriophagenkonzentration war ausreichend verdünnt, direkt der Anzahl der infektiösen Phagenpartikel in der ursprünglichen Probe entsprechen. Diese Technik kann auch zur Charakterisierung der Plaquemorphologie, zur Identifizierung von Phagentypen oder zur Isolierung von Phagenmutanten verwendet werden. In diesem Labor lernen Sie, wie Sie den Plaque-Assay zur Zählung von Phagen am Beispiel des T7-Phagen von E. coli durchführen.

Identifizieren Sie zunächst ein geeignetes Medium für die Kultivierung der Wirtsbakterienzellen und des Bakteriophagen. Hier wurde Lysogeniebrühe oder LB-Medium verwendet, um E. coli und den T7-Phagen zu kultivieren. Nehmen Sie als nächstes drei saubere Glasflaschen und beschriften Sie sie mit Medium, Name und dann die erste als LB-Brühe, die zweite als LB-Bottom Agar und die dritte als LB-Top Agar. Wiegen Sie nun vier Gramm vorformuliertes LB-Pulver in drei Sätzen ab und geben Sie dann einen Satz gewogenes getrocknetes Medium in jede Flasche. Geben Sie 200 Milliliter Wasser in die erste Flasche. Mischen Sie den Inhalt mit einem magnetischen Rührstab.

Bringen Sie dann mit einem pH-Messgerät und ständigem Rühren den endgültigen pH-Wert durch Zugabe von Natriumhydroxid oder Salzsäure auf 7,4. Wiederholen Sie die Wasserzugabe und die pH-Einstellung auch für die anderen beiden verbleibenden Flaschen. Wiegen Sie nun drei Gramm Agarpulver ab und geben Sie es in die zweite Flasche, um ein Agar mit 1,5 % Boden herzustellen. Zum Schluss wiegen Sie 1. 2 Gramm Agar und gib es in die dritte Flasche, um das Top Agar von 0,6 % LB herzustellen. Der Brühezustand in der Flasche benötigt man keine Agar-Zugabe. Verschließen Sie die Flasche halbfest und sterilisieren Sie das Medium dann, indem Sie es 20 Minuten lang bei 121 Grad Celsius autoklavieren. Wenn Sie fertig sind, nehmen Sie die Medienflaschen aus dem Autoklaven und drehen Sie sofort die Flaschenverschlüsse, um sie vollständig zu schließen und eine Kontamination zu vermeiden. Bewahren Sie die LB-Bouillon und das LB-Top Agar-Medium für die spätere Verwendung auf der Bank auf. Legen Sie den LB-Bottom Agar zum Abkühlen in ein Wasserbad, das auf ca. 45 Grad Celsius voreingestellt ist.

Wenn der LB-Bottom-Agar etwa 45 Grad Celsius erreicht, wird er auf die Werkbank übertragen. Als nächstes sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70 % Ethenol. Als nächstes fügen Sie 450 Mikroliter steriles einmolares Calciumchlorid zum geschmolzenen Bodenagar hinzu, um eine Endkonzentration von 2,25 Millimolar zu erreichen. Schwenken Sie die Flasche vorsichtig, um sie zu mischen. Stellen Sie dann sieben saubere Petrischalen bereit. Beschriften Sie jedes Gericht auf der Unterseite mit dem Namen des Mediums und dem Zubereitungsdatum. Gießen Sie dann 15 Milliliter des unteren Agars in jede der sieben Petrischale. Lassen Sie die Platten einige Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur fest werden. Nach dem Aushärten können die Kulturplatten bei Bedarf mehrere Tage lang bei vier Grad Celsius gelagert werden, auf dem Kopf, um die Kondensation zu minimieren. Übertragen Sie die Petrischalen eine Stunde vor dem Assay aus dem vier Grad Celsius heißen Kühlschrank in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Am Tag vor der Durchführung des Assays sollten die E. coli kultiviert werden. Hier wurden 10 Mikroliter E. coli-Kultur in 10 Milliliter LB-Brühe geimpft. Platzieren Sie die Bakterien, um über Nacht zu wachsen, in einem Schüttelbrutkasten, der auf 37 Grad Celsius bei 160 U/min eingestellt ist. Nehmen Sie dann am Tag des Assays die Bakterienkultur aus dem Inkubator. Säen Sie frische 10 Milliliter frische LB-Brühe mit 0,5 Millilitern der Nachtkultur aus. Platzieren Sie diese Zellen zum Wachsen in einem Schüttelinkubator, der auf 37 Grad Celsius bei 160 U/min eingestellt ist. Verwenden Sie als Nächstes ein Spektralphotometer, um zu überprüfen, wann diese Kultur ein logarithmisches Phasenwachstum erreicht, das durch eine optische Dichte von 0,5 bis 0,7 angezeigt wird. Sobald die OD dieses Niveau erreicht hat, stoppen Sie die Inkubation, indem Sie die Zellkultur auf die Bank übertragen. Sie sind nun bereit für den Einsatz für Phagen-Overlay-Assays.

Phagentiter können je nach Phagentyp und Probe exponentiell variieren. Um sie effektiv zählen zu können, sollten sie also verdünnt werden, um eine breite Palette von Phagenkonzentrationen zu erzeugen. Am Tag des Assays wird eine Reihe von Phagenverdünnungen im Bereich von einem Zehntel bis zu einem Millionstel Konzentrationen nach einer 10-fachen Verdünnungstechnik erzeugt. Um statistisch signifikante und genaue Daten zu erhalten, führen Sie die serielle Verdünnung in dreifacher Ausfertigung durch.

Als nächstes schmelzen Sie den erstarrten LB-Top-Agar mit einer Mikrowelle. Legen Sie es dann eine Stunde lang in ein Wasserbad, das auf 45 Grad Celsius voreingestellt ist. Nach einer Stunde entnehmen Sie die Petrischalen mit der unteren Agarschicht aus dem Inkubator. Beschriften Sie die Platten mit der Phagenkonzentration und dem Datum des Assays. Stellen Sie dann sieben saubere Reagenzgläser aus. Beschriften Sie jedes Reagenzglas mit der seriellen Phagenverdünnungsnummer und kennzeichnen Sie eines als Kontrolle.

Wenn der LB-Top-Agar 45 Grad Celsius erreicht, wird er auf die Arbeitsbank übertragen. Fügen Sie nun 450 Mikroliter eines molaren Calciumchlorids zum 200-Milliliter-Agar hinzu, um eine Endkonzentration von 2,25 Millimolar zu erreichen. Schwenken Sie die Flasche vorsichtig, um sie zu mischen. Geben Sie anschließend 35 Milliliter LB-Top-Agar und vier Milliliter Bakteriensuspension in ein steriles konisches Röhrchen. Schwenken Sie vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, aber vermeiden Sie Schütteln, um Schaumbildung zu vermeiden.

Aliquotieren Sie nun fünf Milliliter dieser Bakterien-Top-Agar-Mischung in jedes der sieben Reagenzgläser. Dann werden 100 Mikroliter der seriell verdünnten Bakteriophagenproben und Kontrollmedien, bei denen es sich lediglich um Medien ohne Bakteriophagen handeln sollte, in die respektvoll gekennzeichneten Reagenzgläser überführt. Schwenken Sie die Mischung vorsichtig, um eine gute Mischung zu gewährleisten. Fünf Milliliter Bakteriophagenmischung vorsichtig auf die jeweilige Petriplatte geben. Verteilen Sie die Mischung gleichmäßig auf der gesamten Oberfläche, indem Sie die Petriplatte vorsichtig schwenken.

Sobald alle Petriplatten mit der Mischung geschichtet sind, lassen Sie die oberste Schicht erstarren, indem Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederholen Sie nach Abschluss dieser Schritte den Vorgang für den zweiten und dann den dritten Satz der Petrischalen mit den verbleibenden zwei Sätzen Phagenverdünnungen. Jede Schale mit Parafilm verschließen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Stellen Sie die Kulturplatte 24 Stunden lang kopfüber bei einer geeigneten Temperatur auf oder bis sich Plaques bilden. Hier wurden die Platten für einen Tag in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator gelegt, eine stimulierende Wachstumsbedingung für E. coli und den T7-Phagen.

Plaques treten nach ein bis fünf Tagen Inkubation auf, abhängig von der Bakterienart, den Inkubationsbedingungen und der Wahl des Mediums. Hier waren nach einem Tag Inkubation bei 37 Grad Celsius Plaques sichtbar. Beginnen Sie mit der Überprüfung der mit Kontrolle gekennzeichneten Platten und stellen Sie sicher, dass sich in diesen Platten keine Plaques gebildet haben, da dies auf eine Viruskontamination hinweisen würde. Um den Phagentiter in der Originalprobe zu bestimmen, beginnen Sie zuerst mit den Platten mit der am stärksten verdünnten Phagenprobe und zählen Sie die Plaques, ohne die Deckel zu entfernen, und markieren Sie sie, um anzuzeigen, welche bereits gezählt wurden. Wiederholen Sie das Zählen für jede Platte in jedem Satz. Einige Platten haben möglicherweise zu viele oder zu wenige Tafeln, um gezählt zu werden. Betrachten Sie 10 bis 150 als ideale Plaquezahl.

Erstellen Sie als Nächstes eine Tabelle, in der die Plaquezahlwerte für die verschiedenen Verdünnungen und Replikationen aufgeführt sind. Berechnen Sie dann die mittleren Plaquezahlwerte für die Verdünnungsplatten, die die ideale Anzahl von Plaquezahlen enthielten. In diesem Beispiel war dies die durchschnittliche Anzahl der Plaques, die sich in den Verdünnungsplatten von 10 bis minus drei und 10 bis minus vier gebildet haben. Passen Sie nun den Phagenverdünnungsfaktor an, indem Sie die erhaltenen mittleren Plaquewerte durch die jeweiligen Phagenverdünnungsfaktoren dividieren. Hier wurde die durchschnittliche Anzahl der gebildeten Plaques zu den 10 zu den minus drei und 10 zu den minus vier Verdünnungsplatten durch ihre jeweiligen Verdünnungsfaktoren dividiert, um die Anzahl der plaquebildenden Einheiten oder PFUs in 100 Mikrolitern Phagenmischung zu erhalten. Um den Wert in PFU pro Milliliter umzurechnen, multiplizieren Sie die generierten Werte mit 10, da während des Vorbereitungsschritts des Bakteriophagen-Overlays nur 100 Mikroliter Phagenverdünnungsmischung verwendet wurden, wodurch ein zusätzlicher Verdünnungsfaktor von 10 erzeugt wurde. Berechnen Sie abschließend den Durchschnitt der Werte, die sich aus den verschiedenen Verdünnungsplatten ergeben. Daraus ergibt sich die durchschnittliche Anzahl der PFUs pro Milliliter. Die Anzahl der PFUs entspricht der Anzahl der infektiösen Phagenpartikel in der Originalprobe.