Konjugation: Eine Methode zur Übertragung der Ampicillinresistenz vom Spender auf den Empfänger E. coli

1. Einrichtung

1. Autoklav ca. 1L von Luria-Bertani medium (LB). Diese sterile LB wird verwendet, um ca. 5 ml LB mit 0,3 ml Diaminopimelsäure (DAP) herzustellen.
2. Sammeln Sie folgende Platten: LB Agarplatten mit 1X Tet und 0,3 mM DAP, LB Agarplatten nur mit 1X Tet und LB Agarplatten nur mit 1X Amp/Tet.
3. Stellen Sie sicher, dass einige Glycerin und eine Box mit vorsterilisierten Kunststoff Pipettenspitzen in der Nähe sind.
4. Vor Beginn der Arbeiten mit Mikroben, sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. Tragen Sie immer die notwendige persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Labormantel und Handschuhe.
5. Nach der Fertigstellung alle Oberflächen und Handschuhe mit 70% Ethanol sterilisieren und die Hände waschen.

2. Vorbereitung der Spender- und Empfängerstämme

1. 5 ml Bakterienkulturen der Spender- und Empfängerstämme vorbereiten und bei 37 °C mit Belüftung und Schütteln bei 220 Umdrehungen pro Minute über Nacht anbauen. Der Spenderstamm sollte in LB mit 0,3 mM DAP angebaut werden.
2. Drehen Sie 1 ml beider Kulturen (ca. 3000 U/min für 5 Minuten) und waschen Sie die Zellen mit PBS.
3. Setzen Sie die Zellen in 500 l Phosphatgepufferte Saline (PBS) wieder aus.

3. Konjugation

1. Kombinieren Sie 50 l Empfängerzellen mit 50 l Spenderzellen in einem Mikrozentrifugenrohr und mischen Sie sie durch Pipettieren.
2. Die Zellmischung 1 Stunde bei 37 °C inkubieren. Dies wird die Effizienz der Konjugation vor und während des nächsten Beschichtungsschritts verbessern.
3. Pipetten Sie 100 l des Zellgemisches auf eine Agarplatte mit 1X Tet und 0,3 mM DAP. Nicht auf dem Teller verteilen.
4. Pipetten Sie 100 l der Empfängerzellkultur auf eine Agarplatte mit 1X Tet und 0,3 mM DAP. Nicht auf dem Teller verteilen.
5. Beide Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
6. Verschrotten Sie die Konjugationszellmischung und die Empfängerzellkultur mit einem sterilen Zellschaber. Übertragen Sie die Zellen in ein steriles Mikrozentrifugenrohr und setzen Sie die Zellen in 1 ml PBS wieder auf.
7. Wirbeln Sie die Zellen und drehen Sie sie sanft nach unten (ca. 3000 U/min für 5 Minuten).
8. Setzen Sie die Zellen in 1 ml PBS wieder aus.
9. Die Konjugationsreaktionszellmischung auf einer LB-Agarplatte nur mit 1X Amp/Tet vereiteln. Auf dieser Platte werden nur die Empfängerbakterien, die das Amp-Resistenzgen durch Konjugation erfolgreich gewonnen haben, voraussichtlich wachsen.
10. Die Empfängerzellen nur mit 1X Tet auf eine LB-Agarplatte geben. Auf dieser Platte werden nur nicht konjugierte Empfängerbakterien erwartet, die nicht über das Amp-Resistenzgen verfügen.
11. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
12. Wählen Sie einzelne Kolonien aus beiden Platten und verwenden Sie sie, um Übernachtkulturen in 5 ml Medien (37 °C mit Belüftung bei 220 Rpm) zu züchten.

4. DNA-Isolation

1. Isolieren Sie DNA aus den zuvor hergestellten Kulturen mit 4,5 ml des gesamten Kulturvolumens durch DNA Miniprep.
2. Um dies zu tun, elute die DNA mit 35 l Nuklease-freies Wasser.
3. Reine DNA erzeugt ein Absorptionsverhältnis (A_260/280) von etwa 1,8.
4. Verwenden Sie die restlichen 0,5 ml jeder Kultur, um Glyzerinvorräte zuzubereiten, indem Sie eine 1:1-Mischung aus Bakterienkultur und 100% Glycerin herstellen.
5. Lagern Sie die Gefriervorräte bei -80 °C.

5. Bestätigung der Plasmid-Transferkonjugation durch PCR

1. Bereiten Sie zwei PCR-Master-Mixe vor, die jeweils einen anderen Satz von Vorwärts- und Rückwärtsprimern aufweisen, wobei einer auf ein 500 Base-Pair-Segment innerhalb des Ampicillin-Resistenz-Gens abzielt und der andere auf ein Segment innerhalb eines Housekeeping-Gens abzielt.
   1. Housekeeping-Genprimer wurden entwickelt, um ein DNA-Segment innerhalb des bakteriellen Gens zu verstärken, das für DNA-Gyrase B (14) kodiert.
   2. Die folgenden Reagenzienvolumina wurden verwendet, um 90 l jeder Mastermischung vorzubereiten:
      7,5 l von 10 m Vorwärtsgrundierung
      7,5 l von 10 m Reverse-Primer
      75 l mit 2X PCR Master Mix
2. Bereiten Sie die folgenden sechs PCR-Reaktionen mit 15 L-Master-Mix, 10 ng Vorlagen-DNA und nukleasefreiem Wasser bis zu einem Endvolumen von 25 l vor.
   Konjugationsreaktion DNA und Ampicillin-Primer
   Konjugationsreaktion DNA und Housekeeping Primer
   Negative Kontroll-DNA und Ampicillin-Primer
   Negativkontroll-DNA und Housekeeping-Primer
   Keine DNA und Ampicillin-Primer
   Keine DNA- und Housekeeping-Primer
3. Übertragen Sie diese Reaktionen auf eine PCR-Maschine mit vorgewärmten Block auf 98 C und beginnen Sie mit dem Thermocycling unter folgenden Bedingungen:
   98 °C für 30 Sekunden
   25-35 Zyklen von 98 °C für 5-10 Sekunden, 45-72 °C für 10 bis 30 Sekunden und 72 °C für 15-30 Sekunden pro kb
   72 °C für 5-10 Minuten
   Halten bei 4 °C
4. Laden Sie alle sechs PCR-Reaktionen auf ein 1% Agarose-Gel und laufen Sie bei 150V für ca. 20 Minuten.
5. Visualisieren Sie das PC-Produkt mit einem UV-Beleuchtungsgerät.