Konjugation: Eine Methode zur Übertragung der Ampicillinresistenz vom Spender auf den Empfänger E. coli

Bakterienzellen wie E. coli sind in der Lage, genetische Informationen von Zelle zu Zelle zu übertragen. Die Konjugation unterscheidet sich von anderen Mechanismen des DNA-Transfers, wie z.B. Transduktion oder Transformation, dadurch, dass sie physischen Kontakt zwischen den Zellen erfordert.

Um fortzufahren, erfordert die Konjugation eine Spenderzelle, die den Fertilitätsfaktor oder F-Faktor exprimiert, und eine Empfängerzelle ohne ihn, eine F-Minus-Zelle. Der Prozess erfordert zwei Schritte. Die erste ist die Etablierung eines direkten Zell-zu-Zell-Kontakts. Zu diesem Zweck erzeugt die Spenderzelle eine extrazelluläre filamentöse Struktur, die als Sex Pilus bezeichnet wird. Es wird so genannt, da die Konjugation eine Form der Paarung für sich asexuell fortpflanzende Bakterien ist, aber es sollte beachtet werden, dass es sich nicht um eine echte sexuelle Fortpflanzung handelt, da keine Gameten ausgetauscht und keine Nachkommen gebildet werden.

Der zweite Schritt ist die Abgabe der DNA an die Empfängerzelle. Nachdem der Sexualpilus den Kontakt zwischen zwei Zellen hergestellt hat, wird ein Kanal namens Typ-IV-Sekretionssystem aufgebaut, der den Transfer von DNA ermöglicht. Die Spenderzelle beginnt dann, die extrachromosomale DNA zu replizieren, die übertragen wird, ausgewählt auf der Grundlage des Vorhandenseins eines genetischen Elements, das als OriT oder Ursprung des Transfers bekannt ist. Ein Ende der neu replizierten DNA wird durch DNA-Proteinbindung in den Kanal eingefädelt. Wenn die DNA weiter repliziert wird, wird sie durch den Kanal gepumpt, was durch einen Komplex von Proteinen erleichtert wird, die von Genen kodiert werden, die sich in der Nähe des OriT befinden. Sobald die DNA vollständig übertragen ist, bildet sie entweder ein zusätzliches chromosomales Plasmid oder sie kann sich in das Chromosom der Empfängerzelle integrieren. Unabhängig vom Endpunkt der übertragenen DNA werden dann die Gene, die sie kodiert, exprimiert. Diese Genexpression kann verwendet werden, um eine erfolgreiche Konjugation zu bestätigen.

Stellen Sie sich zum Beispiel ein Szenario vor, in dem der Spenderstamm eine Ampicillinresistenz exprimiert und diese in der konjugierten DNA an das Empfängerbakterium weitergibt, der Empfängerstamm aber auch ein Tetracyclin-Resistenzgen aufweist, das im Spender nicht vorhanden ist. In diesem Fall, wenn die Zellen auf LB-Medien plattiert werden, die sowohl Tetracyclin als auch Ampicillin enthalten, sollten Kolonien nur aus erfolgreich konjugierten Bakterien wachsen, die beide Resistenzphänotypen exprimieren. Um die erfolgreiche Konjugation weiter zu bestätigen, kann Plasmid-DNA aus diesen Kolonien geerntet und dann ein DNA-Abschnitt, der für das übertragene Plasmid spezifisch ist, mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert werden. Wenn das PCR-Produkt auf einem Elektrophoresegel neben einer Leiter mit Standardgrößen ausgeführt wird, sollte ein PCR-Fragment einer bekannten Größe auf dem Gel sichtbar sein, was die erfolgreiche Konjugation weiter bestätigt. In diesem Experiment wird ein Plasmid verwendet, um das Ampicillin-Resistenzgen durch Konjugation von einem Spenderstamm auf einen Tetracyclin-resistenten Empfängerstamm zu übertragen. Um die Konjugation zu bestätigen, wird die Konjugationsmischung anschließend auf einer Platte inkubiert, die beide Antibiotika enthält, wobei nur die transformierten Bakterien übrig bleiben. Schließlich wird die erfolgreiche Konjugation mit PCR weiter bestätigt.

Ziehen Sie vor Beginn des Eingriffs die entsprechende persönliche Schutzausrüstung an, einschließlich eines Laborkittels und Handschuhe. Sterilisieren Sie anschließend den Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol, um die Oberfläche abzuwischen.

Bei diesem Verfahren wird das Ampicillin-Resistenzgen vom WM3064-Stamm von E. coli auf den J53-Stamm von E. coli durch Konjugation übertragen. Der Spenderstamm WM3064 ist resistent gegen Tetracyclin und Ampicillin und benötigt zum Wachstum Diaminopimelsäure (DAP). Der Empfängerstamm J53 ist nur gegen Tetracyclin resistent und benötigt kein DAP, um zu wachsen. Das bedeutet, dass erfolgreich konjugierte Zellen resistent gegen Tetracyclin und Ampicillin sein sollten und ohne DAP wachsen können.

Bereiten Sie die Spenderstammkultur vor, indem Sie fünf Milliliter LB mit 0,3 Millimol DAP mit einem Reste des gefrorenen Glycerinstamms beimpfen. Bereiten Sie dann den Empfängerstamm vor, indem Sie fünf Milliliter LB-Brühe ohne DAP mit einem Fetzen des gefrorenen Glycerinstamms beimpfen. Züchten Sie diese Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Belüftung und Schütteln bei 220 U/min in einem Schüttelinkubator. Sobald die Kulturen auf einen OD 600 von zwei angewachsen sind, entnehmen Sie jeweils einen Milliliter Kultur und geben Sie diesen in zwei neue, separate 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie diese Aliquots dann fünf Minuten lang bei 3000 U/min, um die Bakterienzellen zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie jedes Pellet mit 250 Mikrolitern 1X PBS. Die Proben werden erneut zentrifugiert und nach dem Verwerfen des Überstands jedes Pellet in 500 Mikrolitern PBS resuspendiert.

Um mit der Konjugation zu beginnen, kombinieren Sie zunächst 50 Mikroliter Empfängerzellen mit 50 Mikrolitern Spenderzellen in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Pipettieren Sie anschließend 100 Mikroliter der Empfängerzellkultur auf eine weitere 1X-Tetracyclinplatte, die DAP enthält. Bereiten Sie als Nächstes Ihre Negativkontrolle vor, indem Sie 100 Mikroliter der Empfängerzellkultur nur auf eine nicht-selektive Agarplatte pipettieren, die DAP enthält. Inkubieren Sie dann die Konjugations- und Negativkontrollplatten über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Nehmen Sie am nächsten Tag einen sterilen Zellschaber und ernten Sie Zellen aus der Konjugationsplatte, indem Sie Kolonien sammeln. Übertragen Sie dann die Kolonien in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das einen Milliliter 1X PBS enthält. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die Empfängerzellen von der anderen Platte zu sammeln.

Danach die Proben zum Mischen vortexen. Nach dem Mischen werden die Röhrchen in eine Zentrifuge gegeben, um die Zellen schonend zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie dann die Zellpellets in einem Milliliter PBS und wirbeln Sie die Röhrchen auf, um die Zellen wieder zu suspendieren. Pelletieren Sie die Zellen erneut durch Zentrifugieren. Der Überstand wird wieder verworfen und beide Zellpellets in einem Milliliter PBS resuspendiert. Nun werden mit einer sterilen Pipettenspitze 100 Mikroliter des Zellgemisches der Konjugationsreaktion auf eine LB-Agarplatte ohne DAP aufgebracht, die 1X Tetracyclin und 1X Ampicillin enthält. Wiederholen Sie die Plattierungsmethode mit 100 Mikrolitern einer zehnfachen Verdünnung desselben Zellgemisches in PBS auf eine andere LB-Agarplatte ohne DAP, die 1X Tetracyclin und 1X Ampicillin enthält.

Zum Schluss pipettieren Sie 100 Mikroliter der negativen Kontrollzellenmischung auf eine einzelne LB-Agarplatte mit nur 1X Tetracyclin. Nach der Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius sollten die Völker sichtbar sein. Entnehmen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze eine einzelne Kolonie aus der Konjugationsreaktionsplatte und geben Sie sie in ein Röhrchen mit fünf Millilitern selektivem LB-Medium, das beide Antibiotika enthält. Wiederholen Sie dann die Kolonieisolierung, indem Sie eine einzelne Kolonie aus der Empfängerzellplatte auswählen. Züchten Sie diese Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius und Belüftung bei 220 U/min.

Wischen Sie am nächsten Tag die Tischplatte mit 70% Ethanol ab und nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator. Verwenden Sie ein DNA-Mini-Vorbereitungskit, um DNA von 4 zu isolieren. 5 Milliliter jeder Kultur gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nachdem Sie die DNA-Minivorbereitung abgeschlossen haben, eluieren Sie die DNA mit 35 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Verwenden Sie abschließend die restlichen 0. 5 Milliliter jeder Kultur, um einen Milliliter Glycerinvorräte herzustellen, indem 0,5 Milliliter 100% Glycerin für eine Eins-zu-Eins-Verdünnung hinzugefügt werden. Bewahren Sie diese Aliquots bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius auf.

Um die erfolgreiche Konjugation durch PCR zu bestätigen, bereiten Sie zunächst einen PCR-Mastermix her, indem Sie 75 Mikroliter 2X PCR-Mastermix in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben. Fügen Sie dann jeweils 7,5 Mikroliter eines 10-mikromolaren Forward-Primers und eines 10-mikromolaren Reverse-Primers hinzu, die zur Amplifikation des Ampicillin-Resistenzgens aus dem Plasmid entwickelt wurden. Bereiten Sie als Nächstes einen zweiten PCR-Mastermix vor, indem Sie 75 Mikroliter 2X PCR-Mastermix in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und dann jeweils 7,5 Mikroliter eines 10 mikromolaren Forward-Primers und eines 10-mikromolaren Reverse-Primers hinzufügen, die zur Amplifikation eines Housekeeping-Gens, in diesem Fall DNA-Gyrase B, entwickelt wurden.

Fügen Sie nun 15 Mikroliter des ersten Mastermixes in ein PCR-Röhrchen hinzu und fügen Sie dann 10 Nanogramm hinzu. etwa zwei Mikroliter der experimentellen Matrizen-DNA in dasselbe Röhrchen. Bringen Sie die Reaktion mit nukleasefreiem Wasser auf ein Endvolumen von 25 Mikrolitern. Wiederholen Sie diese Schritte, um die restlichen fünf Reaktionen zu erzeugen, sodass die Röhrchen die hier gezeigten Komponenten enthalten. Übertragen Sie nun diese Reaktionen auf einen Thermocycler, wobei der Block auf 98 Grad Celsius vorgeheizt ist, und starten Sie dann das Programm. Entfernen Sie nach Abschluss der PCR die Röhrchen aus der Maschine. Laden Sie dann zwei Mikroliter jeder Reaktion, gemischt mit zwei Mikrolitern Ladefarbstoff und vier Mikrolitern eines Molekulargewichtsmarkers, in aufeinanderfolgende Vertiefungen mit einem 1%igen Agarosegel. Stellen Sie das Gel so ein, dass es 20 Minuten lang mit 150 Volt läuft. Zum Schluss visualisieren Sie das Gel mit einem UV-Strahler.

In diesem Experiment wurde der erfolgreiche Transfer des Ampicillin-Resistenzgens durch Konjugation mittels PCR bestätigt. Hier sollte eine etwa 500 Basenpaare große Bande in der Vertiefung beobachtet werden, die die konjugierten DNA- und Ampicillin-Primer enthält, in diesem Beispiel Vertiefung zwei. Ein Haushaltsgen, DNA-Gyrase B, wurde mit konjugierter DNA bzw. Empfängerzell-DNA in die Vertiefungen drei und fünf geladen. Die in diesen Vertiefungen beobachteten Banden dienen als Positivkontrolle, um sicherzustellen, dass die DNA-Vorlage vorhanden war und die PCR erfolgreich war. In der Vertiefung, die die Reaktion auf die Empfängerzell-DNA und das Ampicillin-Primerpaar enthält, in diesem Beispiel Vertiefung vier, sollten keine Banden beobachtet werden, da die Empfängerzellen nicht Ampicillin-resistent sind. Darüber hinaus sollten keine Banden in den Reaktionen ohne Template-DNA beobachtet werden, hier in den Vertiefungen sechs und sieben. Wenn diese Bedingungen erfüllt sind, bestätigt dies die erfolgreiche Übertragung des Ampicillin-Resistenzgens und verleiht die Ampicillin-Resistenz vom WM3064-Stamm von E. coli auf den J53-Stamm von E. coli.