Phagen-Transduktion: Eine Methode zur Übertragung der Ampicillinresistenz von einem Spender auf den Empfänger E. coli

Bakterien können sich schnell an eine sich schnell verändernde Umgebung anpassen, indem sie genetisches Material austauschen, und eine Möglichkeit, dies zu tun, ist die Transduktion, der Austausch von genetischem Material, der durch bakterielle Viren vermittelt wird. Ein Bakteriophagen, oft als Phagen abgekürzt, ist eine Virusart, die Bakterien infiziert, indem sie sich zuerst an die Oberfläche des Wirts heftet und dann deren DNA in die Bakterienzelle injiziert. Dann baut es die eigene DNA der Wirtszelle ab und repliziert ihr virales Genom, während es die Maschinerie der Zelle kapert, um viele Kopien ihrer Proteine zu synthetisieren. Diese Phagenproteine ordnen sich dann selbst an und verpacken die Phagengenome, um mehrere Nachkommen zu bilden. Aufgrund der geringen Genauigkeit des DNA-Verpackungsmechanismus verpackt der Phagen jedoch gelegentlich Fragmente bakterieller DNA in das Phagenkapsid. Nachdem die Lyse des Wirts induziert wurde, werden die Phagennachkommen freigesetzt und sobald ein solcher Phagen eine andere Wirtszelle infiziert, überträgt er das DNA-Fragment seines vorherigen Wirts. Dieses kann dann rekombinieren und dauerhaft in das Chromosom des neuen Wirts eingebaut werden, wodurch der Gentransfer zwischen den beiden Bakterien vermittelt wird.

Um eine Phagentransduktion im Labor durchzuführen, ist ein Spenderstamm erforderlich, der ein Gen von Interesse enthält, ein Empfängerstamm, dem es fehlt, ein Phagen, der beide Stämme infizieren kann, und eine Methode zur Auswahl der transduzierten Bakterien. In den meisten Fällen handelt es sich dabei um ein selektives festes Wachstumsmedium, das das Wachstum von transduzierten Bakterien unterstützt, aber das Wachstum von nicht transduzierten Bakterien hemmt. Zu Beginn wird der Spenderstamm, der das interessierende Gen enthält, in einem flüssigen Wachstumsmedium kultiviert. Wenn sich alle Bakterien in der logarithmischen Phase ihres Wachstums aktiv teilen, wird die Kultur mit dem Zielphagen geimpft. Nach drei- bis vierstündiger Inkubation, wenn fast alle Bakterien die Phagenpartikel lysiert und freigesetzt haben, wird das Donor-Phagen-Lysat in eine frisch gewachsene Kultur des Empfängerbakterienstamms geimpft. Nach einer kurzen Inkubation von einer Stunde sollte die Kultur nun eine Mischung aus transduzierten und nicht transduzierten Bakterienzellen enthalten, und diese wird auf die transduzierten Zellen untersucht, indem ein Teil der Suspension auf ein geeignetes selektives festes Wachstumsmedium aufgetragen wird. Nach weiterer Inkubation sollten die transduzierten Zellen wachsen und sich vermehren, um sichtbare Kolonien zu erhalten. Diese Kolonien können dann für die weitere Analyse mit einer Vielzahl von Methoden ausgewählt werden, um die erfolgreiche Transduktion weiter zu bestätigen, wie z. B. Kolonie-PCR, DNA-Sequenzierung oder quantitative PCR.

Ziehen Sie vor Beginn des Eingriffs geeignete persönliche Schutzausrüstung an, einschließlich eines Laborkittels und Handschuhe. Als nächstes sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und wischen Sie die Oberfläche ab.

Bereiten Sie danach drei Ein-Milliliter-Aliquots LB-Salzlösung vor. Bereiten Sie nun eine Spenderstammkultur vor, indem Sie 100 Mikroliter E. coli in ein konisches 15-Milliliter-Fläschchen geben, das fünf Milliliter LB-Wachstumsmedium mit 500 Mikrogramm Ampicillin enthält. Lassen Sie die Kultur dann über Nacht bei 37 Grad Celsius wachsen, belüften und schütteln Sie sie bei 220 U/min. Wischen Sie am nächsten Tag die Tischplatte mit 70 % Ethanol ab, bevor Sie die Kultur aus dem Schüttelbrutkasten nehmen. Als nächstes verdünnen Sie die Übernachtkultur um eins auf 100, indem Sie 10 Mikroliter Spenderstamm zu 990 Mikrolitern frischem LB hinzufügen, der mit Salzlösung ergänzt wird.

Lassen Sie die Bakterienverdünnung zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius wachsen, belüften und bei 220 U/min schütteln. Sobald die Zellen die frühe Log-Phase erreicht haben, nehmen Sie die Kultur aus dem Inkubator, geben Sie 40 Mikroliter P1-Phagen in die Kultur und inkubieren Sie erneut. Überwachen Sie die Zellen weiterhin für ein bis drei Stunden, bis die Kultur lysiert ist. Als nächstes fügen Sie dem Lysat 50 bis 100 Mikroliter Chloroform hinzu und mischen durch Vortexen. Zentrifugieren Sie dann das Lysat, um Rückstände zu entfernen, und übertragen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen. Geben Sie ein paar Tropfen Chloroform in den Überstand und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius für nicht länger als einen Tag.

Um mit dem Transduktionsverfahren zu beginnen, entnehmen Sie eine Ein-Milliliter-Kultur des Empfängerstamms. Als nächstes werden 100 Mikroliter Spenderphagenlysat in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei 37 Grad Celsius bei geöffneter Kappe 30 Minuten lang inkubiert, damit das verbleibende Chloroform verdampfen kann. Während das Spenderphagenlysat inkubiert, pelletieren Sie die Empfängerstammzellen durch schonende Zentrifugation. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 300 Mikrolitern frischem LB resuspendiert, das 100 millimolare Magnesiumsulfate und fünf millimolare Calciumchloride enthält.

Als nächstes wird die Transduktionsreaktion eingerichtet, indem 100 Mikroliter des Empfängerstamms und 100 Mikroliter des Donor-Phagen-Lysats in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert werden. Richten Sie dann die Negativkontrolle ein, indem Sie 100 Mikroliter des Empfängerstamms und 100 Mikroliter des LB mit Magnesiumsulfat und Calciumchlorid kombinieren. Nach der Inkubation 200 Mikroliter eines molaren Natriumcitrats und eines Milliliters LB in beide Röhrchen geben und durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mischen. Nachdem die Röhrchen eine Stunde lang inkubiert wurden, pelletieren Sie die Zellen vorsichtig durch Zentrifugation.

Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand verworfen und die pelletierten Zellen in 100 Mikrolitern LB mit 100 millimolaren Natriumcitrat resuspendiert. Wirbeln Sie die Lösungen und pipettieren Sie die gesamte transduzierte Probe auf eine LB-Agarplatte mit 1X Ampicillin. Zum Schluss pipettieren Sie das gesamte Volumen des Negativkontrollzellengemisches auf eine LB-Agarplatte ohne Ampicillin. Nachdem Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze, um drei bis vier Kolonien aus der Transduktionsplatte zu entnehmen und sie auf eine neue LB-Agarplatte zu streichen, die 1X Ampicillin und 100 Mikroliter eines molaren Natriumcitrats enthält. Diese Plattierungsmethode für die Negativkontrolle auf einer anderen LB-Agarplatte, die nur 100 Mikroliter eines molaren Natriumcitrats enthält, wiederholen. Inkubieren Sie die Platten dann über Nacht bei 37 Grad Celsius, damit die von Phagen freien Kolonien wachsen können.

Wischen Sie am nächsten Tag die Tischplatte mit 70% Ethanol ab, bevor Sie Ihre Platten aus dem Inkubator nehmen. Entnehmen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze drei Kolonien aus der Transduktionsplatte und geben Sie sie jeweils in ein separates Röhrchen mit fünf Millilitern LB-Medium. Wählen Sie dann drei Kolonien aus der Negativkontrollplatte aus und geben Sie sie in ein anderes Röhrchen mit fünf Millilitern LB-Medium. Züchten Sie die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Belüftung und Schütteln bei 220 U/min. Verwenden Sie nach der Sterilisation der Tischplatte, wie zuvor gezeigt, ein DNA-Miniprep-Kit, um DNA aus 4,5 Millilitern jeder Kultur gemäß den Anweisungen des Herstellers zu isolieren. Dann eluieren Sie die DNA mit 35 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser und messen Sie die resultierende Konzentration mit einem Laborspektrophotometer. Bereiten Sie schließlich die Glycerinbrühen vor, indem Sie die restlichen 0,5 Milliliter beider Bakterienlösungen zu 0,5 Millilitern 100% Glycerin hinzufügen.

Um die Transduktion zu bestätigen, bereiten Sie zunächst zwei qPCR-Mastermixe für 24 qPCR-Reaktionen vor. Für den ersten Mastermix geben Sie 150 Mikroliter qPCR-Puffermischung in ein Mikrozentrifugenröhrchen und je 12 Mikroliter eines Vorwärts- und Rückwärtsprimers, der zur Amplifikation des Ampicillinresistenzgens entwickelt wurde. Bereiten Sie als Nächstes einen zweiten qPCR-Mastermix vor, indem Sie 150 Mikroliter qPCR-Mastermix in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und dann jeweils 12 Mikroliter eines Forward-Primers und eines Reverse-Primers hinzufügen, die zur Amplifikation eines Housekeeping-Gens entwickelt wurden.

Kombinieren Sie für jede qPCR-Reaktion 100 Mikrogramm experimentelle DNA aus jeder Reaktion mit 14,5 Mikrolitern qPCR-Mastermix. Bereiten Sie nun die restlichen Reaktionen vor, wie zuvor gezeigt. Übertragen Sie die Reaktionen auf einen auf 94 Grad Celsius vorgeheizten Thermocycler und starten Sie dann das Programm. Verwenden Sie schließlich die durch qPCR generierten Zyklusquantifizierungs- oder Cq-Werte, um die normalisierte Transduktionseffizienz des Ampicillin-Resistenzgens zu berechnen.

Die Zyklusquantifizierungs- oder Cq-Werte für die interessierenden Gene wurden für jede der Negativkontrollen und transduzierten Proben tabellarisch dargestellt. Niedrige Cq-Werte, typischerweise unter 29 Zyklen, wie die transduzierten Proben in diesem Beispiel, weisen auf hohe Mengen der Zielsequenz hin.

Ein Housekeeping-Gen, das hier ebenfalls tabellarisch dargestellt ist, wird als Belastungskontrolle verwendet, um die DNA-Menge in jeder Reaktion zu normalisieren, und als Positivkontrolle, um sicherzustellen, dass die qPCR funktioniert. Unter der Voraussetzung, dass die gleichen Mengen des Housekeeping-Gens geladen werden, wird es in jeder Probe mit relativ der gleichen Rate gefunden.

Um als Nächstes den Delta-Cq-Wert für jede Probe zu berechnen, subtrahieren Sie den Cq-Wert des Housekeeping-Gens für jede Probe vom Cq-Wert des entsprechenden Zielgens. Zum Beispiel beträgt das Delta Cq der ersten Negativkontrolle 13,54. Verwenden Sie dann diesen Wert, um die normierte Transduktionseffizienz jeder Probe mit der hier gezeigten Formel zu berechnen. Schließlich kann die durchschnittliche normierte Transduktionseffizienz für jede Probengruppe berechnet werden.