Phagen-Transduktion: Eine Methode zur Übertragung der Ampicillinresistenz von einem Spender auf den Empfänger E. coli

1. Einrichtung

1. Bevor Sie mit einer Arbeit mit Mikroben zu tun haben, sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. Verwenden Sie immer die notwendige PSA (Labormantel und Handschuhe).
2. Stellen Sie sicher, dass LB-Agarplatten mit 1x Ampicillin, handelsübliche P1-Phagenlysatlösung, Chloroform, 1 M Natriumcitrat, Glycerin und eine Schachtel vorsterilisierter Kunststoffpipettenspitzen und Zellstreuer in der Nähe sind.
3. Bereiten Sie sterile LB durch Autoklavieren vor und verwenden Sie es, um drei 1 ml Aliquots von LB-Salzlösung herzustellen.
   1. mM MgCl₂ (952.11-2.3803 'g), 5 mM CaCl₂ (11.098 mg), 0.1-0.2% Glukose (100-200 g)
   2. mM MgSO₄ (12.0366 mg), 5 mM CaCl₂ (11.098 mg)
   3. mM Natriumcitrat (25.806 mg)
4. Nach der Fertigstellung alle Oberflächen sowie Handschuhe mit 70% Ethanol sterilisieren und die Hände waschen.

2. Protokoll

1. Spender Phage Lysate Vorbereitung
   1. Bereiten Sie eine 1 ml Kultur des Spenders W3110 Stamm E. coli in LB mit 1x Ampicillin über Nacht bei 37 °C mit Belüftung und Schütteln bei 220 U/min.
   2. Verdünnen Sie diese Nachtkultur 1:100 in 1 ml frischelb ergänzt mit 10-25 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂, und 0.1-0.2% Glukose.
   3. Wachsen Sie diese bakterielle Verdünnung bei 37 °C für 2 Stunden mit Belüftung und Schütteln bei 220 Rpm.
   4. Sobald diese Zellen eine frühe logarithmische Wachstumsphase erreicht haben (spürbares Wachstum und leichte Trübung), 40 l kommerziell erhältlichen P1-Phagen hinzufügen und bei 37 °C mit Belüftung und Schütteln bei 220 Umdrehungen pro Minute ablassen.
      1. Vor der Phagenzugabe sollte die gemessene optische Dichte bei 600 nm dieser Zellen etwa 0,4 (6) betragen.
   5. Überwachen Sie Zellen 1-3 Stunden lang, bis die Kultur lysiert ist.
      1. Lyse führt zu erhöhtem zellulären Schmutz sowie zu einer spürbaren Abnahme der Trübung (d.h. Zellen werden als lysiert betrachtet, sobald man in der Lage ist, durch die Kultur zu sehen).
   6. Fügen Sie dem Lysat mehrere Tropfen (50-100 l) Chloroform hinzu und mischen Sie sie durch Wirbel.
      1. Chloroform sterilisiert das Phagenlysat, indem es alle verbleibenden Spenderzellen tötet, nur noch Phagen hinterlässt und den Titer dieses Lysats erhöht.
   7. Zentrifuge lysiert bei 14.000 U/min für 2 Minuten, um Schmutz zu entfernen und Überstand in ein frisches Rohr zu übertragen.
   8. Ein paar Tropfen Chloroform dazugeben und bei 4 °C für nicht mehr als einen Tag lagern.
2. Transduktion
   1. Bereiten Sie eine 1 ml Kultur des Empfängers J53-Stamm E. coli über Nacht in LB bei 37 °C mit Belüftung und Schütteln bei 220 U/min.
   2. Übertragen Sie 100 l Spenderphagenlysat (2,1) in ein 1,5 ml Mikrofugenrohr und inkubieren Sie mit einer Kappe, die bei 37 °C für 30 Minuten geöffnet ist.
      1. Diese Inkubation ermöglicht es, dass alle verbleibenden Chloroformen in der P1-Lysatlösung verdampfen, bevor sie den Empfängerzellen zugesetzt werden.
   3. Sanft Pellet-Empfänger-Stammzellen durch Zentrifugation bei 6.000 U/min für 5 Minuten.
   4. Setzen Sie diese Zellen in 300 l frischem LB mit 100 mM MgSO₄ und 5 mM CaCl₂wieder aus. (P1-Phagen erfordert Kalzium, um infektiös zu sein).
   5. Richten Sie zwei Reaktionen mit den Empfängerbakterienzellen und vorbereiteten Spenderphagenlysat ein: 1) Transduktionsreaktion, die 100-L-Empfänger-J53-Stamm E. coli und 100 L Spenderphagenlysat kombiniert, und 2) Negativkontrolle, die 100-L-Empfänger-J53-Stamm kombiniert E. coli und 100 l LB mit 100 mM MgSO₄ und 5 mM CaCl₂.
   6. Bei 37 °C 30 Minuten mit Schütteln bei 220 Rpm inkubieren.
   7. 1 ml LB und 200 l 1M Natriumcitrat (pH=5,5) hinzufügen und 1 Stunde bei 37 °C mit Schütteln bei 220 Rpm inkubieren.
      1. Citrat wird verwendet, um die Infektiosität von P1 durch Chelatmitat mit Kalzium zu reduzieren, die Lyse von Empfängerbakterien zu verhindern.
      2. Die Inkubation dieser Lösung ermöglicht die Expression des Ampicillin-Resistenzmarkers.
   8. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 6.000 U/min für 5 Minuten.
   9. Zellpellets in 100 l LB mit 100 mM Natriumcitrat (pH 5,5) wieder aufsetzen. Vortex und Platte Gesamtlösung für beide Reaktionen auf zwei LB Agarplatten.
      1. LB-Platte sollte 1x Amp für die transduced Probe und keine Amp für die negative Kontrolle haben.
      2. P1-Phagenkontamination auf dieser Platte muss erneut gestreift werden, bevor Gefriervorräte vorbereitet werden können.
      3. Wenn phagen nicht entfernt wird, werden Kulturen, die aus diesen Kolonien wachsen, nur in Gegenwart eines Kalziumchelators wachsen.
   10. Wählen Sie etwa 3-4 Kolonien von beiden Platten und streifen Sie wieder auf zwei LB Agarplatten verteilt mit 100 l von 1 M Natriumcitrat (pH =5,5).
       1. LB-Platte sollte 1x Amp für die transduced Probe und keine Amp für die negative Kontrolle haben.
   11. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C über Nacht, damit Kolonien ohne Phagen wachsen können.
   12. Pflücken Sie Kolonien von beiden Platten und verwenden Sie sie, um Übernachtkulturen in 5 ml LB bei 37 °C mit Belüftung und Schütteln bei 220 Rpm anzubauen.
   13. Isolieren Sie DNA aus diesen Kulturen durch DNA Miniprep mit 4,5 ml des gesamten Kulturvolumens.
       1. Elute DNA mit 35 l nukleasefreiem Wasser.
       2. Messen Sie die resultierende Konzentration durch Nanodrop. Reine DNA erzeugt ein Absorptionsverhältnis (A_260/280) von etwa 1,8.
   14. Verwenden Sie die restlichen 0,5 ml jeder Kultur, um 1 ml Glycerinvorräte zuzubereiten, indem Sie eine 1:1-Mischung aus 100% Glycerin und Bakterienkultur herstellen.
   15. Bakterielle Glycerinbestände bei -80 °C lagern.

3. Datenanalyse und Ergebnisse

1. Bestätigung der Transduktion durch qPCR
   1. Bereiten Sie zwei qPCR-Master-Mischungen für sechs qPCR-Reaktionen vor, drei mit qPCR-Primern für das Ampicillin-Resistenzgen und die anderen drei qPCR-Primer für ein Housekeeping-Gen (14,5 l pro Reaktion): 12,5 l qPCR-Puffermischung + 1 L Vorwärtsprimer + 1 L-Reverse-Primer.
      1. In diesem Experiment haben wir SYBR Green Master Mix verwendet.
      2. Housekeeping-Genprimer wurden entwickelt, um ein DNA-Segment innerhalb des bakteriellen Gens zu verstärken, das für DNA-Gyrase B (7) kodiert.
   2. Kombinieren Sie für jede qPCR-Reaktion 100 g DNA aus jeder Reaktion (10,5 l) mit 14,5 l qPCR-Master-Mix.
   3. Mit Hilfe einer qPCR-Maschine und des in Tabelle 1 aufgeführten Thermocycling-Protokolls wurde die Amplifikation für die Ampicillinresistenz- und Haushaltsgene für alle sechs Reaktionen gemessen.
   4. Cq-Werte, die von qPCR generiert wurden, wurden verwendet, um die normalisierte Transduktionseffizienz des Ampicillinresistenzgens zu berechnen (Abbildung 3), was die erfolgreiche Transduktion des Ampicillinresistenzgens bestätigt.
      1. Der Cq-Wert oder Zyklusquantifizierungswert einer Stichprobe ist die früheste PCR-Zyklusnummer, bei der ein Signal, das den Hintergrundschwellenwert überschritten hat, erkannt wird. Niedrige Cq-Werte entsprechen mehr Zielsequenz, umgekehrt.
      2. Die normalisierte Transduktionseffizienz eines Gens innerhalb einer Probe kann anhand dieser Cq-Werte berechnet werden, indem der Wert des Housekeeping-Gens von dem des Zielgens subtrahiert wird, wodurch ein Cq-Wert generiert wird, der zur Berechnung normalisierter Transduktion verwendet werden kann. Effizienz um 2^(-Cq).

	temperatur	zeit
Denaturierung	94 °C	2 Min.
40 Zyklen:
Denaturierung	94 °C	15 Sek.
Glühen, Verlängerung und Fluoreszenz lesen	60 °C oder 5 °C unter niedrigster Grundierung Tm	1 Min.

Tabelle 1: qPCR Thermocycling Protocol