Name: Horizontale Scheiben Vorbereitung der Retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Lernen Sie eine neue horizontale Schnittmethode zur Präparation der Retina, die die dendritische Morphologie präzise erhält. Diese Technik ermöglicht verbesserte funktionelle Studien retinaler Schaltkreise.

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Wir danken Drs. Richard H. Masland und Akimichi Kaneko, dass sie uns wertvolle Hinweise und Anregungen an das Verfahren der horizontalen Scheibe Vorbereitung der Netzhaut zu etablieren.

<ol><li> Bereiten Sie eine Agar-Block (30 mg / ml, dh 3%, in destilliertem Wasser). Auflösen und Mikrowelle es zuerst und gießen Sie sie in einer Glasschale. Halten Sie das Gericht in einem Kühlschrank bei 4 ° C. Tipp: Die Agar-Block sollte im Vorfeld vorbereitet werden. </li><li> Bereiten Sie bei niedrigen Temperaturen schmelzende Agarosegel (25 mg / ml, dh 2,5%, in Medium). Auflösen und Mikrowelle es. Halten Sie es in dem heißen Wasserbad bei 35 o C. Tipp: Halten Sie das Agarosegel nicht zu heiß. Wenn es zu heiß ist, dauert es eine lange Zeit verfestigt werden, und das Gel kann die Netzhaut zu töten . </li><li> Euthanize das Tier, entkernen einen Augapfel, und öffnen Sie es als eine Augenmuschel. Zu verflüssigen Glaskörper, ist die geöffnete Augenmuschel für 10 min in Hyaluronidase in das Medium (0,07 mg / ml) getränkt, wenn nötig. </li><li> Schneiden Sie das Agar in einen Block (zB, 1 cm x 1,5 cm für Maus Netzhaut) und fest auf einem Vibratom Bühne von Sekundenkleber befestigt. Halten Sie die Agarblock nass. </li><li> Legen Sie das Blatt bei 5 Grad an der Schneidemaschine. Vorsichtig schnitt die Oberfläche des Agar-Block mit einer Geschwindigkeit von ca.. 50 mu m / sec, Freq. 50 Hz. Tipp: Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des Agar-Block völlig glatt und eben ist. Mehrere Schnitte (mindestens 3-mal) erforderlich sein, um die glatte und ebene Oberfläche des Agar-Block zu bekommen. </li><li> Spülen Sie die Augenmuschel mit dem Medium ohne Hyaluronidase. Isolieren Sie die Netzhaut aus einer Pigmentepithel und legen Sie sie Photorezeptor-Seite nach unten auf ein Stück Filterpapier. Um fest an der Netzhaut auf das Filterpapier, Vakuum der Netzhaut auf dem Filterpapier mehrmals. Tipp: Stellen Sie sicher, dass die Netzhaut auf das Filterpapier vollständig flach ist beigefügt. Nachdem Sie eine Netzhaut setzen auf dem Filterpapier, schneiden Sie die überschüssige Filterpapier Umgebung der Netzhaut (Abb. 2a). Der Überschuss Filterpapier verhindert oft eine Klinge aus, die in der entsprechenden Schicht der Netzhaut. </li><li> Wischen Sie das überschüssige Medium auf die Agar-Block und vorsichtig die Netzhaut auf dem Filterpapier auf die Agar-Block. Um einen festen Platz das Filterpapier auf die Agar-Block legen Sekundenkleber am Rand des Filterpapiers. Tipp: Um zu vermeiden, Unerwartete crack, Ort der Netzhaut wie vor als möglich auf der Oberseite des Agar-Block. </li><li> Vorsichtig gießen Sie die niedrigen Temperaturen schmelzende Agarosegel über die Netzhaut. Warten Sie 1 min und gießen Sie leicht das Medium auf, um es abzukühlen. Das Agarosegel verfestigt schnell. Tipp: Zu heiß Agarosegel tötet die Netzhaut. </li><li> Nehmen Sie die Klinge der Lage, mehrere hundert um über die Oberfläche des Agar-Block und sanft schneiden Sie die Spitze des erstarrten Agarosegel. </li><li> Weiter unten die Klinge Position. Cut der Netzhaut auf der Ebene des proximalen ein Drittel der inneren Körnerschicht (ca. zwischen 200 und 250 pm oberhalb der oberen Oberfläche des Agar-Block). Tipp: Zu viel Geschwindigkeit des Blattes wird die Netzhaut stark beschädigen. Ca. 50 mu m / sec (50 Hz) geeignet ist. </li><li> Beachten Sie, dass die Amakrinzellen jetzt verdeckt sind. Sorgfältig nehmen die Scheibe der Netzhaut zusammen mit der erstarrten Agarosegel und legen Sie sie offen in eine Kammer oder ein Gericht. Tipp: Da die Maus Netzhaut ist winzig und wellig, ist es schwierig, eine perfekte horizontale Scheibe an einer geeigneten Schicht zu erhalten. Eine &quot;schräge&quot; Scheibe kann eine alternative Methode, um die relative flache Scheibe der Netzhaut zu erhalten. Um die schrägen Scheibe, anders Filterpapier in zwischen der Netzhaut auf dem Filterpapier und die Agar-Block wie in Fig. 2B gezeigt. Obwohl Sie nicht erwarten können eine perfekte horizontale Scheibe, gibt es immer einige Bereiche, in denen amakrinen Zelle soma ist auf der Oberfläche der Scheibe. </li></ol>

<ol><li>Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+spatiotemporal+patterns+of+dendritic+Ca2%2B+signals+in+goldfish+retinal+amacrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells.</a> Brain Res. , 64-73 (2004).</li>
<li>Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifying+currents+stabilize+the+membrane+potential+in+dendrites+of+mouse+amacrine+cells%3A+patch-clamp+recordings+and+single-cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell.</a> , 328-340 (2004).</li>
<li>MA, M. acN. eil, RH, M. asland <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+diversity+among+amacrine+cells%3A+implications+for+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. , 971-982 (1998).</li>
</ol>

Alle experimentellen Protokolle wurden nach Angaben des National Institutes of Health Richtlinien für Tierversuche durchgeführt.

Es gibt mehrere wichtige Vorteile der horizontalen Scheibe Vorbereitung der Netzhaut. Zunächst wird die Morphologie der Zellen, die Dendriten erweitern horizontal wie Amakrinzellen und horizontale Zellen, erhalten. Es hat sich gezeigt, dass es über 20 Arten von Amakrinzellen in der Netzhaut (MacNeil und Masland, 1998), so dass es ganz wichtig ist, die Morphologie der Zellen mit der physiologische Eigenschaft zu vergleichen. Zweitens, in der ganzen-mount Netzhaut verhindert, dass die umfangreiche Berichterstattung von Gliazel...

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1296</td><td></td></tr><tr><td>Agarose L</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>317-01182</td><td>Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Typ I-S, 300 U/mg</td></tr><tr><td>Medium</td><td></td><td></td><td>in mM: 102 NaCl, 3,1 KCl, 2,0 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1,0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 23 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; und 10 Glukose, pH-Wert 7,8; oder Ames&amp;rsquo; Solution (Sigma)</td></tr><tr><td>Mikrowelle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heißwasserbad</td><td></td><td></td><td>35 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Vibratomschneider</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>MF-Membranfilter</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWP01300</td><td>Filterpapier, Porengröße 0,45 &amp;#181;m</td></tr><tr><td>Präparationswerkzeuge</td><td></td><td></td><td>Pinzette, Klinge, Zange, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Sofortkleber</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;z. B.&lt;/em&gt; Alonalpha, Krazy Glue</td></tr><tr><td>50-mL-Spritze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritzenfilter</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0001300</td><td></td></tr></tbody></table>

horizontale scheiben vorbereitung der retina

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionell wird der vertikale Scheiben schneiden und die ganze-mount Vorbereitung der Netzhaut verwendet worden, um die Funktion der Netzhaut Schaltkreise zu untersuchen. Allerdings sind viele der retinalen Nervenzellen, wie Amakrinzellen, erweitern ihre Dendriten horizontal, so dass die Morphologie der Zellen soll zu stark in den vertikalen Scheiben beschädigt werden. In der ganzen-mount Vorbereitung, insbesondere für Patch-Clamp-Aufnahmen sind Netzhautneuronen in der mittleren Schicht nicht leicht zugänglich durch die umfangreiche Berichterstattung von Gliazellen (Mueller-Zelle) s endfeets. Hier beschreiben wir den Roman Slicing-Verfahren, um die dendritischen Morphologie der retinalen Nervenzellen intakt zu erhalten. Die Scheibe wurde horizontal an der inneren Schicht der Netzhaut mit einem Vibratom Allesschneider gemacht, nachdem der Netzhaut in der Tieftemperatur-Agarose-Gel eingebettet war. In diesem horizontalen Scheibe Vorbereitung der Netzhaut, untersuchten wir die Funktion der Netzhaut Neuronen im Vergleich zu ihrer Morphologie, mit Patch-Clamp-Aufzeichnung, Kalzium-Imaging-Technik, Immunzytochemie und Einzelzell-RT-PCR.

Traditionell wird der vertikale Scheiben schneiden und die ganze-mount Vorbereitung der Netzhaut verwendet worden, um die Funktion der Netzhaut Schaltkreise zu untersuchen. Hier beschreiben wir den Roman Slicing-Verfahren, um die dendritischen Morphologie der retinalen Nervenzellen intakt zu erhalten.

Horizontale Scheiben Vorbereitung der Retina

Traditionell wurden der Vertikalschnitt und die Whole-Mount-Präparation der Retina verwendet, um die Funktion retinaler Schaltkreise zu untersuchen. Viele von ...

Also das Legendäre ist da, und dies ist ein Bildpapier.

horizontal-slice-preparation-of-the-retina

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die nicht-menschlichen Primaten ist ein wichtiger translationale Arten für unser Verständnis der Entwicklung und Alterung. Die anatomische Organisation des Primas Netzhaut kann wichtige Einblicke in normalen und pathologischen Bedingungen beim Menschen liefern.

Das Tor zum Gehirn: Die Biologie des Primas Eye

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung von dunkeladaptierten Scheiben der Maus Netzhaut elektrophysiologischen Ableitungen.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Agar-embedded Netzhaut Scheiben, die sich für Elektrophysiologie und Ca2 +-Imaging sind. Diese Methode erlaubt es, Band-Typ Synapsen der Netzhaut Mikroschaltungen mit direkten Patch-Clamp Messungen von einzelnen präsynaptischen Nervenendigungen zu studieren.

Patch-Clamp Kapazitätsmessungen und Ca 2 + Imaging bei Single Nervenendigungen in Retinal Slices

Wir beschreiben die Herstellung von dünnen Scheiben von retinalen Wasserorganismen Tiger Salamander...

Gleichzeitige Ganzzellableitungen von Photorezeptoren und Neuronen zweiter Ordnung in eine Amphibie Retinal Scheibe Vorbereitung

Wir werden zeigen, wie man Netzhautschnitte aus dem Mausauge präpariert und Lichtreaktionen in retinalen Neuronen aufzeichnet. Das gesamte Verfahren wird unter dunkeladaptierten Bedingungen durchgeführt.

Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

Wir beschreiben ein Protokoll, um Ca 2+ Dynamik in den Axonterminalen von Zapfen-Photorezeptoren mit einem ex-vivo Scheibe Vorbereitung der Maus Netzhaut zu überwachen. Dieses Protokoll ermöglicht umfassende Studien der Kegel Ca 2+ Signalisierung in einem wichtigen Säugetiermodellsystem der Maus.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Wir entwickelten eine horizontale Schnittpräparat der erwachsenen Säugetier-Netzhaut mit der Ebene parallel zu der Netzhautoberfläche sectioning. Dendritische Bereichen nonradially orientierte Netzhautneuronen wurden nicht abgeschnitten, so dass die Untersuchung der Signalverarbeitung mit Patch-Clamp-und Imaging-Techniken.

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

Imaging netzhautgewebe kann einzellige Informationen liefern, die von den traditionellen biochemischen Methoden gesammelt werden kann nicht. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Netzhaut Scheiben von Zebrafisch für die konfokale Bildgebung. Fluoreszierende genetisch codierten Sensoren oder indikatorfarbstoffen erlaubt Visualisierung von zahlreichen biologischen Prozessen in verschiedenen retinalen Zelltypen.

Zubereitung frische retinalen Scheiben von Erwachsenen Zebrafisch für Ex Vivo Imaging-Experimente

In dieser Arbeit wird ein alternatives Flatmount-Retina-Präparat vorgestellt, bei dem die Entfernung von Photorezeptor-Zellkörpern eine schnellere Antikörperdiffusion und einen verbesserten Patch-Pipettenzugang zu inneren Netzhautneuronen für Immunhistochemie, In-situ-Hybridisierung und elektrophysiologische Experimente ermöglicht.

Split Retina als verbessertes Flatmount-Präparat zur Untersuchung von Neuronen der inneren Kernschicht in der Netzhaut von Wirbeltieren

Die Netzhaut weist eine komplexe räumliche Organisation über ihre laminare Struktur auf. Moderne räumliche Transkriptomik- und Sequenzierungstechniken erfordern Gewebeschnitte mit einer Dicke von &lt; 20 μm, was ihre Anwendbarkeit in der Netzhautforschung einschränkt. Diese frisch gefrorene Kryosektionsmethode erzeugt dünne Gesichtsabschnitte der Netzhaut von Mäusen unter Beibehaltung planarer räumlicher Beziehungen und ermöglicht so eine umfassende molekulare Kartierung über Laminae hinweg.

En face Kryosektion der Netzhaut der Maus für die hochdimensionale räumliche molekulare Analyse

Lernen Sie eine neue horizontale Schnittmethode zur Präparation der Retina, die die dendritische Morphologie präzise erhält. Diese Technik ermöglicht verbesserte funktionelle Studien retinaler Schaltkreise.

Horizontale Scheiben Vorbereitung der Retina

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