Analyse von Genexpressionsdaten aus marinen mikrobiellen Gemeinschaften mit Environmental Transcriptomics

Dieses Verfahren beginnt mit der Gewinnung mariner mikrobieller Biomasse aus Wasserproben durch Vorfiltration über Filter mit fünf und drei Mikrometern, gefolgt von der Sammlung auf einem 0,22-Mikrometer-Filter. Anschließend wird die gesamte RNA aus den auf dem 0,22-Mikrometer-Filter zurückgehaltenen Organismen extrahiert. Unsere RNA wird aus der Gesamt-RNA durch selektiven enzymatischen Abbau entfernt und die angereicherte Mr.N mittels Poly-A-Schwanzbildung und in-vitro-Transkription linear amplifiziert.

Die amplifizierte antisense-RNA wird anschließend mit Hilfe von randomen Hexameren in doppelsträngige cDNA umgewandelt. Die resultierende cDNA kann kloniert und sequenziert oder direkt mittels Pyrosequenzierung analysiert werden. Hallo, ich bin Rachel Persky aus dem Labor von Dr. Marianne Moran am Department für Meereswissenschaften der University of Georgia.

Heute werden wir Ihnen ein Verfahren zur Untersuchung der Genexpression aus Umweltproben zeigen. Mithilfe der Umwelt-Metatranskriptomik wird Scott Gifford Ihnen zeigen, wie man Umweltproben zur RNA-Gewinnung aufarbeitet.

Ich zeige Ihnen, wie man RNA aus den Proben und den Johanna RINs extrahiert. AON wird die RNA-Entfernung demonstrieren. Anschließend erläutert Maria Kosta die Schritte zur RNA-Amplifikation und zur cDNA-Synthese.

Beginnen wir nun. Um die Sammlung von Umwelt-RNA zu starten, richten wir das Filtersystem ein, indem wir ein Ende des Schlauchs in das Wasser in der gewünschten Probentiefe eintauchen und das gegenüberliegende Ende an ein Hochdurchsatz-Dreimikrometer-Filter anschließen, wobei die Pumpe zwischen den beiden Schlauchenden platziert wird. Das Dreimikrometer-Filter wird anschließend mit dem 0,22-Mikrometer-Filterturm verbunden, und der Ausfluss wird vom 0,22-Mikrometer-Turm in einen Messzylinder geleitet.

Lassen Sie mehrere Liter Wasser durch das System laufen, um es zu spülen. Entfernen Sie anschließend das Schlauchstück aus dem Wasser, während die Pumpe weiterläuft, um das verbleibende Wasser aus der Leitung zu entfernen. Danach platzieren Sie mit einer Pinzette einen 0,22-Mikrometer-Filter auf dem Filterturm und schließen diesen.

Bringen Sie das Ende der Leitung wieder ins Wasser und schalten Sie die Pumpe ein. Lassen Sie die Luft aus beiden Filtern entweichen und überwachen Sie das gefilterte Wasservolumen am Kanister. Sobald das gewünschte Volumen gefiltert wurde, nehmen Sie die Leitung aus dem Wasser und drücken Sie das verbleibende Wasser aus dem System.

Sobald der Filter trocken ist, entfernen Sie schnell die obere Filterplatte und falten Sie das Filterpapier zusammen. Legen Sie den Filter in einen Whirl-Beutel und schockgefrieren Sie ihn in flüssigem Stickstoff. Bevor wir mit dem Experiment beginnen, ist es wichtig zu beachten, dass, da RNAs ubiquitär vorkommen und mRNA-Moleküle rasch abbauen, Standardvorkehrungen für die Arbeit in einer ribonukleasefreien Umgebung eingehalten werden müssen, einschließlich der Arbeitsflächen und Pipetten.

Daher sollten beim Umgang mit allen Materialien, die in diesem Verfahren verwendet werden, saubere Handschuhe getragen werden. Außerdem sollten die Proben so schnell wie möglich verarbeitet werden. Um die Gesamt-RNA-Extraktion aus dem 0,22-Mikrometer-Filter zu beginnen, bereiten wir Bead-Beating-Röhrchen vor, indem wir acht Milliliter RLT-Puffer mit zugesetztem Beta-Mercaptoethanol in ein 50-Milliliter-Konischrohr geben.

Dann werden ein bis zwei Milliliter RNA-Beads aus einem mobilen Boden-DNA-Extraktionskit hinzugefügt. Entfernen Sie den gefrorenen Filter schnell aus dem Gefrierschrank und halten Sie ihn in der Kühlbox. Zerschlagen Sie ihn mit einem Hammer.

Geben Sie den zerkleinerten Filter in die vorbereitete 50-Milliliter-Konischenschale und verschließen Sie den Deckel der Schale mit Parafilm oder Laborklebeband. Vortexen Sie 10 Minuten lang. Zentrifugieren Sie anschließend die 50-Milliliter-Schale eine Minute lang mit 5.000 U/min. Entfernen Sie bei Raumtemperatur so viel wie möglich der Lyseprobe und überführen Sie sie in eine 15-Milliliter-Schale, bevor Sie erneut fünf Minuten lang zentrifugieren.

Bei 5.000 × g wird das Überstand dann in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen überführt, und eine äquivalente Menge 100 %igen Ethanol wird zur Lyse hinzugefügt. Mit einer 10-Milliliter-Spritze wird die Lyse durch eine Nadel mit einem Durchmesser von 18 bis 21 Gauge aufgezogen und etwa fünfmal wieder ausgestoßen. Für die anschließenden Extraktionsschritte verwenden Sie das KaiGen R- und Easy-Mini-Kit gemäß den Herstelleranweisungen, wobei die Lyse entweder mithilfe des Vakuummanifolds oder durch wiederholte Zentrifugation auf die bereitgestellte Säule aufgetragen wird.

Quantifizieren Sie die Gesamt-RNA spektrophotometrisch. Nach der Bestimmung der Gesamt-RNA-Ausbeute entfernen wir mithilfe des Ambien Turbo DNA-free-Kits gemäß den Herstelleranweisungen eventuelle DNA-Verunreinigungen. Da die RNA-Extraktionen nun abgeschlossen sind, werde ich die Gesamt-RNA an Johanna übergeben, die die ersten und zweiten rRNA-Entfernungsschritte durchführen wird.

Vielen Dank, Rachel. Um die RRNA-Entfernung zu beginnen, mischen Sie vorsichtig und zentrifugieren Sie das mRNA-einzigartige 10× Reaktionspuffer kurz vor der Verwendung in einem sterilen, RNA-freien 0,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie die entsprechenden Volumina des 10× Reaktionspuffers, RNA-Inhibitors, der Gesamt-RNA-Probe und des Terminator-Exonukleasen zusammen. Gemäß dem Epicenter-Protokoll inkubieren Sie die Reaktion 60 Minuten lang bei 30 °C in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel oder in einem Wasserbad.

Als Nächstes beenden Sie die Reaktion durch eine Phenol-Ethanol-Fällung, indem Sie zunächst RNase-freies Wasser auf ein Gesamtvolumen von 200 µL hinzufügen und dann eine äquivalente Menge einer 1:1-Phenol-Chloroform-Lösung zur mRNA-Zentrifuge geben. Sammeln Sie die wässrige Phase und fallen Sie anschließend mit 100 %igem Ethanol aus und zentrifugieren Sie. Dieser Schritt kann als möglicher Unterbrechungspunkt dienen.

RNA kann bei minus 80 Grad Celsius aufbewahrt werden, bis die Probe in nachgeschalteten Anwendungen verwendet wird. Nach Abschluss der ersten mRNA-Anreicherung verwenden wir die Ambien Microbe Enrich- und Microbe Express-Kits gemäß den Herstelleranweisungen, um jegliches verbleibende rRNA aus unserer Probe zu entfernen. Zur Erleichterung der Entfernung eukaryotischer rRNA verwenden wir das Microbe Enrich-Kit.

Alle Volumina werden durch die Lektüre der Herstelleranweisungen bestimmt. Geben Sie zunächst 300 Mikroliter Bindungspuffer in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie fünf bis 100 Mikrogramm Gesamt-RNA in einem maximalen Volumen von 30 Mikrolitern hinzu und wirbeln Sie die Probe im Vortex.

Geben Sie vorsichtig zwei Mikroliter der Capture-Oligo-Mischung für fünf Mikrogramm RNA im Bindungspuffer hinzu und klopfen Sie das Röhrchen leicht an. Zentrifugieren Sie die Mischung kurz. Denaturieren Sie die Mischung bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten, bevor Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubieren.

Während dieser Inkubation bereiten Sie die Oligo-Mag-Perlen vor, indem Sie sie einmal mit nukleasefreiem Wasser und einmal mit Bindungspuffer waschen und die Perlen zwischen den Waschschritten auf einem Magnethalter fangen. Bewahren Sie die Perlen auf Eis auf und erwärmen Sie sie vor der Verwendung auf Raumtemperatur. Fünf Minuten vor Gebrauch erwärmen Sie die Waschlösung in einem Heizblock auf 37 Grad Celsius.

Geben Sie die RNA-Einfang-Oligo-Mischung zu den gewaschenen Oligo-Mag-Perlen, mischen Sie das Röhrchen vorsichtig und zentrifugieren Sie kurz. Inkubieren Sie die Mischung kurz bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Stellen Sie das Röhrchen auf den Magnethalter und warten Sie etwa drei Minuten, bevor Sie den mRNA-haltigen Überstand abpipettieren und in ein Sammelröhrchen auf Eis überführen.

Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter vorgewärmte Waschlösung zu den gebundenen Kügelchen hinzu. Vortexen Sie vorsichtig, um die Kügelchen zu erfassen, und gewinnen Sie den Überstand zurück. Dieser Überstand mit Mr.NA wird in ein Sammelröhrchen auf Eis gegeben.

Stellen Sie ein Sammelröhrchen auf Eis, während Sie die Vorbereitungen zum Entfernen von prokaryotischem rRNA mit dem Ambi Microbe Express Kit treffen, das wir zur Entfernung von restlichem prokaryotischem rRNA verwenden werden. Überprüfen Sie mithilfe eines Bioanalyzer oder Experion die Kontamination mit rRNA und die MR.NA-Qualität. Dies ist ein möglicher Haltepunkt.

RNA kann bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Nachdem die rRNA entfernt wurde, verwenden wir das Ambien Message AMP two Bacteria Kit gemäß den Herstelleranweisungen, um unsere mRNA zu amplifizieren. Da wir nun eine reine mRNA-Probe haben, übergebe ich das Experiment an Maria, die Sie durch die mRNA-Amplifikation und die cDNA-Synthese führen wird.

Vielen Dank, Hannah. Bevor wir mit der mRNA-Amplifikation beginnen, berechnen Sie die Volumina der einzelnen Komponenten der Ambien Message AMP Two Bacteria Kit Mastermixe online. Beginnen Sie dann mit der Polyadenylierung der Vorlage-RNA, indem Sie bis zu 1000 Nanogramm Gesamt-RNA in ein steriles, RNA-freies Mikrozentrifugenröhrchen geben. Verwenden Sie 6,5 Mikroliter Probe und keine RNA-freie Wasser im ersten Puffer, um eine RNA durch In-vitro-Transkription zu synthetisieren.

Es wird empfohlen, einen Hybridisierofen oder Inkubator zu verwenden, da diese eine gleichmäßige Temperatur gewährleisten. Und da es äußerst wichtig ist, dass sich keine Kondensation im Inneren der Röhrchen bildet, empfehlen wir dringend eine 14-stündige Inkubation der In-vitro-Transkriptionsreaktion. Um die RNA-Ausbeute für die höchste RNA-Menge zu maximieren, führen Sie die IBT in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 40 Mikroliter durch und lagern Sie die RNA bei minus 80 Grad Celsius in Portionen von etwa 10 Mikrolitern.

Wenn die RNA einmal amplifiziert ist, ist es Zeit, die komplementäre DNA (cDNA) zu synthetisieren. Das Promega Universal RiboClone cDNA-Synthese-System-Kit wird verwendet, um cDNA aus der mRNA zu synthetisieren. Das Kit enthält Anweisungen zur Umwandlung von zwei Mikrogramm mRNA in cDNA. Wir empfehlen die Verwendung von sechs bis zehn Mikrogramm mRNA und eine entsprechende Skalierung der Reaktionen.

Reinigen Sie die cDNA entweder mittels Ethanolpräzipitation oder mit dem Promega Wizard DNA-Cleanup-System. Gemäß den Herstelleranweisungen sollten die Proben bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Zu diesem Zeitpunkt kann doppelsträngige cDNA direkt sequenziert werden. Aus 10 Litern Meerwasser extrahierten wir etwa 10 Mikrogramm umweltbedingte RNA und amplifizierten diese 20-fach. Durch die Umwandlung der amplifizierten mRNA in doppelsträngige cDNA konnten ausreichende Mengen an Material für die Sequenzierung und Analyse umweltbedingter Transkripte gewonnen werden. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man die Genexpression aus marinen mikrobiellen Gemeinschaften mittels umweltbedingter Metatranskriptomik untersucht.

Beachten Sie stets, dass die mRNA bei Durchführung dieses Verfahrens schnell abgebaut wird und RNA überall vorkommt. Ergreifen Sie daher Standardvorkehrungen für die Arbeit in einer ribonukleasefreien Umgebung und verarbeiten Sie die Proben so schnell wie möglich. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.