Analyse von Genexpressionsdaten aus marinen mikrobiellen Gemeinschaften mit Environmental Transcriptomics

Dieses Verfahren beginnt mit der Gewinnung der marinen mikrobiellen Biomasse aus Wasserproben durch Vorfiltration durch Fünf- und Drei-Mikrometer-Filter, gefolgt von der Sammlung auf einen 0,22-Mikrometer-Filter. Die Gesamt-RNA wird dann aus den Organismen extrahiert, die auf dem 0,22-Mikrometer-Filter zurückgehalten werden. Unsere RNA wird durch selektiven enzymatischen Abbau und subtraktive Hybridisierung aus der Gesamt-RNA entfernt; angereichertes Mr.N wird linear über PolyA-Tailing und in vitro Transkription amplifiziert.

Die amplifizierte Antisense-RNA wird dann unter Verwendung eines zufälligen Hexamers in doppelsträngige CD NA umgewandelt. Die resultierende CD NA kann geklont und sequenziert oder direkt mit Pyrosequenzen sequenziert werden. Hallo, ich bin Rachel Persky aus dem Labor von Dr. Marianne Moran am Department of Marine Sciences der University of Georgia

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, mit dem Sie die Genexpression aus Umweltproben untersuchen können. Verwendung von Meta-Transkriptomik in der Umgebung. Scott Gifford zeigt Ihnen, wie Sie Umweltproben für die RNA-Entnahme verarbeiten.

Ich zeige dir, wie du RNA aus den Proben und Johanna RINs extrahieren kannst. AON wird die RNA-Entfernung demonstrieren. Maria Kosta wird dann die Schritte der RNA-Amplifikation und der CD-NA-Synthese durchlaufen.

Also lasst uns loslegen. Um mit der Entnahme von Umwelt-RNA zu beginnen, richten wir das Filterleitungssystem ein, indem wir ein Ende des Schlauchs in der gewünschten Tiefe in das Wasser stecken, um die Probenahme zu nehmen, und das gegenüberliegende Ende an einen großvolumigen Drei-Mikrometer-Filter anschließen, wobei wir die Pumpe zwischen den beiden Enden des Schlauchs platzieren. Der Drei-Mikrometer-Filter wird dann mit dem 0,22-Mikrometer-Filterturm verbunden und der Ausfluss wird vom 0,22-Mikrometer-Turm in eine abgestufte Ladung geleitet.

Lassen Sie mehrere Liter Wasser zum Spülen durch das System laufen. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie den Schlauch aus dem Wasser, während die Pumpe läuft, um das restliche Wasser aus der Leitung zu entfernen. Platzieren Sie anschließend mit einer Pinzette einen 0,22-Mikrometer-Filter auf dem Filterturm und schließen Sie ihn.

Stecken Sie das Ende der Leitung wieder ins Wasser und schalten Sie die Pumpe ein. Lassen Sie die Luft aus beiden Filtern spülen und überwachen Sie die Menge des gefilterten Wassers mit dem auf der Ballonflasche. Sobald das gewünschte Volumen gefiltert wurde, entfernen Sie die Leitung aus dem Wasser und gießen Sie das restliche Wasser aus dem System.

Sobald der Filter trocken ist, entfernen Sie schnell die obere Filterplatte und falten Sie das Filterpapier. Legen Sie den Filter in ein Wirbelpaket und frieren Sie ihn in flüssigem Stickstoff ein. Bevor wir mit dem Experiment beginnen, ist es wichtig zu beachten, dass, da RNAs allgegenwärtig sind und mRNAs schnell abgebaut werden, die Standardvorsichtsmaßnahmen für die Arbeit in einer ribonukleasefreien Umgebung befolgt werden müssen, einschließlich Arbeitsflächen und Pipetten.

In diesem Sinne sollten beim Umgang mit Materialien, die bei diesem Verfahren verwendet werden, saubere Handschuhe getragen werden. Und die Proben sollen in möglichst kurzer Zeit verarbeitet werden. Um mit der Gesamt-RNA-Extraktion aus dem 0,22-Mikrometer-Filter zu beginnen, bereiten wir Bead-Bead-Röhrchen vor, indem wir acht Milliliter RLT-Puffer mit Beta-Meto-Ethanol in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen geben.

Dann werden ein bis zwei Milliliter RNA-Kügelchen aus einem mobilen Power Soil Extraktionskit hinzugefügt. Nehmen Sie den Tiefkühlfilter schnell aus dem Gefrierschrank und bewahren Sie ihn in der Weltverpackung auf. Zerschmettere ihn mit einem Hammer.

Geben Sie den zerbrochenen Filter in das vorbereitete konische 50-Milliliter-Röhrchen und verschließen Sie den Röhrchendeckel 10 Minuten lang mit Parfum oder Laborbandwirbel. Zentrifugieren Sie dann das 50-Milliliter-Röhrchen eine Minute lang bei 5.000 U/min. Bei Raumtemperatur wird so viel Lysat wie möglich entfernt und in ein 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt, bevor es erneut fünf Minuten lang zentrifugiert wird.

Bei 5.000 mal G wird der Überstand dann in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen überführt und dem Lysat ein Volumen 100%iges Ethanol zugesetzt. Ziehen Sie das Lysat mit einer 10-Milliliter-Spritze durch eine 18- bis 21-Gauge-Nadel nach oben und geben Sie es etwa fünfmal wieder heraus. In den nachfolgenden Extraktionsschritten wird das KaiGen R und das easy mini Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, wobei das Lysat entweder mit dem Vakuumverteiler oder mit wiederholter Zentrifugation auf die dafür vorgesehene Säule aufgetragen wird.

Quantifizieren Sie das Gesamt-RNA-Spektro photometrisch. Nach der Bestimmung der Gesamt-RNA-Ausbeute verwenden wir das Ambien Turbo DNA Free Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers, um DNA-Kontaminationen zu entfernen. Jetzt, da die RNA-Extraktionen abgeschlossen sind, werde ich die gesamte RNA an Johanna übergeben, die den ersten und zweiten RRNA-Entfernungsschritt durchführen wird.

Danke Rachel. Um mit der RRNA-Entfernung zu beginnen, mischen und zentrifugieren Sie die mRNA vorsichtig nur 10-mal Reaktionspuffer, bevor Sie sie in einem sterilen RNA-freien 0,5-Milliliter-Röhrchen verwenden, kombinieren Sie die entsprechenden Volumina von 10-fachem Reaktionspuffer, RNA-Inhibitor, Gesamt-RNA-Probe und Terminator-Exonuklease. Gemäß dem Epizentrumsprotokoll wird die Reaktion 60 Minuten lang bei 30 Grad Celsius in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel oder Wasserbad inkubiert.

Als nächstes beenden Sie die Reaktion mit einer Phenolethanol-Fällung, indem Sie zuerst RNAs-freies Wasser zu einem Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern hinzufügen und dann ein Volumen einer Eins-zu-Eins-Phenolchloroform-Lösung zur mRNA-Zentrifuge hinzufügen. Sammeln Sie die wässrige Phase und fällen Sie sie dann mit hundertprozentigem Ethanol und Angriff. Dies ist ein potenzieller Haltepunkt.

RNA kann bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden, bis man bereit ist, die Probe in Downstream-Anwendungen zu verwenden. Sobald wir die erste mRNA-Anreicherung abgeschlossen haben, werden wir die Ambien-Mikrobenanreicherungs- und Mikroben-Express-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers verwenden, um alle RRNA-Reste aus unserer Probe zu entfernen. Um die Entfernung von eukaryotischer RRNA zu erleichtern, werden wir das Mikrobenanreicherungskit verwenden.

Alle Volumina werden durch Lesen der Herstellerangaben bestimmt. Um mit dem Pipettieren zu beginnen, geben Sie 300 Mikroliter Bindungspuffer in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie fünf bis 100 Mikrogramm Gesamt-RNA in einem maximalen Volumen von 30 Mikrolitern hinzu und wirbeln Sie ihn ein.

Geben Sie vorsichtig zwei Mikroliter Capture Oligo Mix für fünf Mikrogramm RNA in den Bindungspuffer und klopfen Sie vorsichtig auf das Röhrchen. Schleudern Sie die Mischung kurz ein. Denaturieren Sie die Mischung 10 Minuten lang bei 70 Grad Celsius, bevor Sie die Mischung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius knien.

Bereiten Sie während dieser Inkubation die Oligo-Mag-Kügelchen vor, indem Sie sie einmal in nukleasefreiem Wasser und einmal in Bindungspuffer waschen und die Kügelchen zwischen den Wäschen auf einem Magnetständer auffangen. Lagern Sie die Kügelchen auf Eis und erwärmen Sie sie auf Zimmertemperatur. Erhitzen Sie die Waschlösung fünf Minuten vor Gebrauch in einem Heizblock auf 37 Grad Celsius.

Geben Sie den RNA-Capture-Oligo-Mix zu den gewaschenen Oligo-Mag-Kügelchen, vergraben Sie das Röhrchen vorsichtig und schleudern Sie es. Inkubiere die Mischung kurz bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Legen Sie das Röhrchen in das Magnetstativ und warten Sie etwa drei Minuten, bevor Sie die mRNA, die den Überstand enthält, aspirieren und dann in ein Sammelröhrchen auf Eis übertragen.

Geben Sie anschließend 100 Mikroliter vorgewärmte Waschlösung zu den aufgefangenen Kügelchen. Und fange die Perlen sanft mit dem Wirbel ein und berge den überstehenden Narren. Dieser Überstand mit Mr.NA im Auffangrohr auf Eis.

Legen Sie ein Entnahmeröhrchen auf Eis, während Sie sich auf die Entfernung von prokaryotischem RRNA mit dem Ambi-Mikroben-Express-Kit vorbereiten, das wir zur Entfernung von prokaryotischen Resten (RRNA) verwenden. Verwenden Sie den Bioanalysator oder Experion, um auf RRNA-Kontamination und MRT zu prüfen. NA-Qualität. Dies ist ein potenzieller Haltepunkt.

RNA kann bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Sobald die RRNA entfernt wurde, werden wir das Ambien message AMP Zwei-Bakterien-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwenden, um unsere mRNA zu amplifizieren. Jetzt, da wir eine reine Probe von mRNA haben, übergebe ich das Experiment an Maria, die Sie durch die mRNA-Amplifikation und die CDNA-Synthese führt.

Danke, Hannah. Bevor wir mit der mRNA-Amplifikation beginnen, berechnen wir die Volumina jeder Komponente der Ambien message AMP zwei Bakterien-Kit-Mastermixe online, wir beginnen mit der Polyadenylierung der Template-RNA, indem wir bis zu 1000 Nanogramm Gesamt-RNA in ein steriles RNA-freies Mikrofuge-Röhrchen geben. Verwenden Sie 6,5 Mikroliter Probe und kein RNA-freies Wasser im ersten Puffer, um eine RNA durch In-vitro-Transkription zu synthetisieren.

Es wird empfohlen, einen Hybridisierungsofen oder -inkubator zu verwenden, da diese eine gleichmäßige Temperatur haben. Und da es äußerst wichtig ist, dass sich in den Röhrchen kein Kondenswasser bildet, empfehlen wir dringend eine 14-stündige Inkubation der Transkriptionsreaktion in vitro. Um eine RNA-Ausbeute für die höchste A-RNA-Ausbeute zu maximieren, führen Sie die IBT in einem Endreaktionsvolumen von 40 Mikrolitern durch: Lagern Sie die A-RNA bei minus 80 Grad Celsius in Quats von etwa 10 Mikrolitern.

Sobald die RNA amplifiziert ist, ist es an der Zeit, das Komplementär oder CDNA zu synthetisieren. Der Promega Universal-Ribot Clone. Das CDNA-Synthesesystem-Kit wird verwendet, um CD-NA aus der a NA zu synthetisieren. Das Kit enthält Anweisungen zum Umrechnen von zwei Mikrogramm, einer NA in CD NA. Wir empfehlen, sechs bis 10 Mikrogramm pro NA einzugeben und die Reaktionen entsprechend zu skalieren.

Reinigen Sie die CD NA entweder mit einer Ethanolfällung oder dem DNA-Aufreinigungssystem promega wizard. Gemäß den Anweisungen des Herstellers können Proben bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Doppelsträngige CDNA kann an dieser Stelle direkt aus 10 Litern Meerwasser sequenziert werden, wir extrahierten etwa 10 Mikrogramm Umwelt-RNA und amplifizierten sie mit dem 20-fachen durch Umwandlung der amplifizierten MR. NA bis doppelsträngige CDNA wurden ausreichende Mengen an Material für die Sequenzierung und Analyse von Umwelttranskripten erzeugt. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Genexpression von marinen mikrobiellen Gemeinschaften mit Hilfe von Meta-Transkriptomik in der Umwelt beurteilen können.

Denken Sie immer daran, dass bei diesem Verfahren die mRNA schnell abgebaut wird und RNAs allgegenwärtig sind. Treffen Sie daher die üblichen Vorsichtsmaßnahmen für die Arbeit in einer rippenkernfreien Umgebung und verarbeiten Sie die Proben so schnell wie möglich. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.