Name: Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Lernen Sie die Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten zur Untersuchung des nukleozytoplasmatischen Transports. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung zellulärer Strukturen mittels Dünnschnitt-Elektronenmikroskopie.

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Wir danken David Theilmann (Pacific Agri-Food Research Centre, Summerland, British Columbia) für die Bereitstellung der Baculovirus AcMNPV und für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Canada Foundation for Innovation (CFI), die Canadian Institutes of Health Research (CIHR), die Michael Smith Foundation for Health Research (MSFHR) und dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) unterstützt .

Teil 1: Herstellung von Xenopus Oozyten für die Mikroinjektion <ol><li> Legen Sie ein kleines Stück (ca. 2 cm) von Xenopus laevis Ovarien in einem 50-ml konische Röhrchen mit 20 ml Kollagenase-Lösung (5 mg / ml Collagenase in Calcium-freier geändert Barths Kochsalzlösung: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 10 mM Hepes, pH 7,5). Collagenase wird verwendet, um die Follikelzellen, die die Eizellen umgeben zu entfernen. </li><li> Das Röhrchen auf einem Schüttler-Plattform und Rock sanft (bei 100 RPM) für eine Stunde. Diese variiert mit verschiedenen Chargen von Kollagenase. So nach einer Stunde, eine kleine Probe von Eizellen und untersuchen sie unter einem Binokular. Richtig de-folliculated Eizellen sollten gut voneinander getrennt werden, und es sollte einfach zu einem Glas Nadel in die Eizelle eingefügt werden soll. Wenn die Eizellen nicht ausreichend de-folliculated, sind sie in der Collagenase-Lösung nach links und wieder überprüft alle fünf Minuten. </li><li> Waschen Sie die Oozyten dreimal mit modifizierten Barths Salzlösung (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 0,41 mM CaCl 2, 10 mM Hepes, pH 7,5), und übertragen Sie sie eine 100-mm Durchmesser Petrischale mit MBS plus 1% Penicillin / Streptomycin. Die Eizellen sind nun bereit, mikroinjiziert werden. Wenn Mikroinjektion an einem anderen Tag durchgeführt werden, speichern die Eizellen bei 4 ° C bis zu einer Woche. </li><li> Mit einem Binokular, wählen Sie reifen Stadium VI Oozyten für die Mikroinjektion. Diese Eizellen sind groß, mit gutem Kontrast zwischen den schwarzen Tier Hemisphäre und die cremefarbenen pflanzlichen Hemisphäre. </li><li> Übertragen Sie die reifen Stadium VI Oozyten in eine Mikrotiterplatte (Nunc, 10 ul Well-Volumen). Dies sollte sorgfältig durchgeführt werden, mit einem 200-ul-Pipette mit einer Pipettenspitze, die am Ende geschnitten wurde, um ungestört Sog der Eizellen ermöglichen. </li></ol> Teil 2: Mikroinjektion von Xenopus Oozyten <ol><li> Bereiten Sie die Import-Substrat durch Zugabe einer kleinen Menge von 1% Bromphenolblau, um in der Visualisierung von Mikroinjektion Hilfe mikroinjiziert werden. Zum Beispiel, fügen wir 1 ul Bromphenolblau bis 10 ul Substrat. </li><li> Setzen Sie einen kleinen Streifen Parafilm auf einer 100-mm-Petrischale, und verzichten einen 5-ul Tropfen der Lösung auf dem Parafilm Streifen injiziert werden. </li><li> Füllen eines zuvor kalibrierten Injektionsnadel (durch Ziehen eines 6,6-ul Mikropipette Drummond mit dem Inject + Matic Puller) mit der Lösung injiziert werden. Dafür ist die Mikroinjektor auf Aspiration Modus eingestellt. Zur Kalibrierung der Injektionsnadel zu Punkt markiert auf der Nadel alle 0,5 mm, was einem Volumen von 50 nl entsprechen. </li><li> Für zytoplasmatische Injektion, legen Sie die Spitze der Nadel in eine Eizelle in der pflanzlichen Hemisphäre, sehr nah an das Tier Hemisphäre, bei einem etwa 45-Grad-Winkel. Drehen Sie den Mikroinjektor Einstellung microinject und microinject jeder Eizelle mit 50 nl der Einfuhr Substrat. Der Punkt markiert auf der Nadel werden verwendet, um die Menge an Substrat, das injiziert wurde überwachen. </li><li> Übertragen Sie die injizierten Oozyten zu einem kleinen (35-mm Durchmesser) Petrischale mit MBS gefüllt und bei Raumtemperatur inkubieren für die gewünschte Zeit (Zeitpunkte sind so die Beobachtung der Import Substrat mit NPCs verbundenen erlauben gewählt; in diesem Fall zwischen 10 und 30 Minuten für Proteine ​​und Viren, die sich aktiv gegen die NPC transportiert werden, dies hängt auch von der Injektionsstelle und die Größe des Proteins / Virus). </li><li> Nach Ablauf der Inkubationszeit abgeschlossen ist, übertragen Oozyten zu einem 4-ml-Glas-Fläschchen mit 2% Glutaraldehyd in MBS und fix über Nacht bei 4 ° C. </li></ol> Teil 3: Präparation des Xenopus-Oozyten <ol><li> Am nächsten Tag, waschen Sie die Oozyten 3-mal mit MBS. </li><li> Transfer-Oozyten zu einer kleinen Petrischale mit wenig Salz-Puffer (LSB: 1 mM KCl, 0,5 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,5) gefüllt. Mit einem Binokular und Sezieren einer Pinzette entfernen Sie die vegetativen Pol aus jeder Eizelle. Es ist sinnvoll, die Eizelle wird mit einer Pinzette seziert zu stabilisieren, während das andere Paar wie eine Schere benutzt wird, um den vegetativen Pol zu entfernen. An dieser Stelle ist es möglich, den Erfolg der Mikroinjektion durch die Anwesenheit von einem blauen Schimmer in das Cytosol zu bewerten. Das Protokoll ist nur für die Eizellen, die erfolgreich waren mikroinjiziert fortgesetzt. Darüber hinaus, wenn die Proben für die EM vorbereitet sind, macht dieser Schritt Dissektion es viel leichter, den Kern zu finden, wenn Trimmen und Schneiden der Proben. </li><li> Fix der sezierten Eizellen wieder mit 2% Glutaraldehyd in LSB für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der Fixierung, waschen Sie die seziert Oozyten dreimal mit LSB. </li></ol> Teil 4: Vorbereitung der injizierten Oozyten für Embedding und Thin-Sectioning EM <ol><li> Übertragen Sie die seziert Eizellen, um eine Depression gleiten. Saugen Sie so viel von der Flüssigkeit wie möglichSible, und dann schnell (so dass sie nicht austrocknen) decken die seziert Eizellen mit 2% niedrig schmelzende Agarose. Während die Agarose noch weich ist, verwenden Sie eine Pipettenspitze, die Eizellen von einander zu trennen und dafür zu sorgen, dass jede Eizelle ist nach oben oder nach unten (nicht seitlich). </li><li> Lassen Sie die Agarose auf ca. 10 Minuten erstarren. Nachdem die Agarose erstarrt, verwenden Sie eine Rasierklinge, die Agarose in kleine Stücke, die jeweils eine Eizelle seziert geschnitten. </li><li> Legen Sie die Agarose-embedded Eizellen in einem 4-ml Glasflasche, und post-fix sie mit 1% OsO 4 in LSB für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Probe dreimal in LSB. Falls erforderlich, speichern Sie die Probe bei 4 ° C über Nacht und weiterhin das Protokoll am nächsten Tag. </li><li> Sequenziell dehydrieren die Proben in eine aufsteigende Reihe von Alkohol (50, 70 und 90% Ethanol für jeweils 20 min). Dies wird durch zwei Änderungen in 100% Ethanol für je 15 min folgte. Schließlich dehydrieren Proben mit 100% Aceton für 15 min. </li><li> Infiltrate Proben mit einem 1:1-Gemisch aus Epon (Fluka) und Aceton eine Stunde lang, durch Infiltration mit einem 2:1-Gemisch aus Epon und Aceton für 2 Stunden und schließlich in reinem Epon für mindestens sechs Stunden. </li><li> Ort Proben in flachen Einbettformen mit frischem reinem Epon gefüllt. Die Eizellen werden in so ausgerichtet, dass die Seite des Kerns näher an der Injektionsstelle - in diesem Fall die Seite der Eizellen, die seziert hat - wird im Schnitt zuerst. Dieser Schritt optimiert die Chance der Visualisierung Import der gewählten Substrat. </li><li> Schließlich polymerisieren die Epon für zwei Tage bei 60 ° C. </li><li> Um die Proben zu visualisieren, werden die Blöcke geschnitten und dann geschnitten mit einem Ultramikrotom. Die Schnitte werden auf EM-Gitter, gebeizt mit Standard-Verfahren übertragen und visualisiert mit einem Transmissions-Elektronenmikroskop. Wir werden uns nicht zeigen, diesen Teil des Protokolls, wie es Standard-EM Prozedur ist. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse: Wenn das Protokoll erfolgreich gewesen ist, dann ist die Kernhülle (NE) und NPCs muss deutlich sichtbar in EM-Aufnahmen. Je nach Untergrund injiziert und die Zeit zwischen Injektion und Fixierung, sollte das Substrat sichtbar auf der cytoplasmatischen Seite des NPC, in dem NPC, oder an der Kernenergie angesichts der NPC. Abbildung 1 zeigt eine NE Querschnitt mit angrenzenden Zytoplasma (c) und Kern (n) aus einer Xenopus-Oozyten, die mit Kapside des Baculovirus AcMNPV injiziert wurde, bei 4 ° C für 4 Stunden und verarbeitet für die Einbettung und Dünnschliff EM wie beschrieben. Pfeilspitzen weisen auf NPCs. Ein Kapsid Andocken an der cytoplasmatischen Gesicht eines NPC ist durch einen weißen Pfeil angezeigt. Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 2 a NE Querschnitt mit angrenzenden Zytoplasma (c) und Kern (n) aus einer Xenopus-Oozyten, die mit dem Parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), bei Raumtemperatur für 4 Stunden inkubiert injiziert wurde, und verarbeitet zum Einbetten und Dünnschliff EM, wie beschrieben. Mit dieser Technik haben wir festgestellt, dass MVM Störungen des NE (Cohen und Pante, 2005) induziert. Eckige Klammern zeigen Brüche in der NE. Pfeilspitzen weisen auf NPCs. Vermeintliche MVM Kapside mit dem NE verbunden sind durch weiße Pfeile gekennzeichnet. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="Abbildung 1" width="600" height="459" /> Abbildung 1: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines NE Querschnitt mit angrenzenden Zytoplasma (c) und Kern (n) aus einer Xenopus-Oozyten, die mit Kapside des Baculovirus Ac MNPV injiziert wurde, inkubiert bei 4 ° C für 4 Stunden, und verarbeitet Einbettung und Dünnschliff EM, wie beschrieben. Pfeilspitzen weisen auf NPCs. Kapside sind durch weiße Pfeile gekennzeichnet. Maßstab: 100 nm. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="Abbildung 2" width="600" height="264" /> Abbildung 2: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines NE Querschnitt mit angrenzenden Zytoplasma (c) und Kern (n) aus einer Xenopus-Oozyten, die mit dem Parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), bei Raumtemperatur für 4 Stunden inkubiert injiziert wurde, und verarbeitet zum Einbetten und Dünnschliff EM, wie beschrieben. Pfeilspitzen weisen auf NPCs. Eckige Klammern zeigen Brüche in der NE. Vermeintliche MVM Kapside mit dem NE verbunden sind durch weiße Pfeile gekennzeichnet. Maßstab: 100 nm.

<ol><li>Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li>
<li>Panté, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li>
<li>Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li>
<li>Cohen, S., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+Envelope%3A+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li>
<li>Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li>
</ol>

Mikroinjektion von Xenopus-Oozyten, Dünn-Schnitte EM kombiniert ist ein hoch effektives Werkzeug für die Untersuchung nukleozytoplasmatischen transportieren. Dieses System wurde verwendet, um verschiedene Schritte der Einfuhr durch die NPC Karte, z. B. Wechselwirkung eines Kernimport Substrat mit strukturellen Komponenten der NPC wie die zytoplasmatische Filamente und nuklearen Korb (Bewertung von Pante, 2006). Es wurde auch verwendet, um die nukleare Import von Atom-replizierende Viren (Pante und Kann, 2002; R...

mikroinjektion von xenopus laevis oozyten

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten von Dünnschicht-Schneiden-Elektronenmikroskopie (EM) gefolgt ist ein ausgezeichnetes System für die Untersuchung nukleozytoplasmatischen transportieren. Wegen seiner großen Kern und eine hohe Dichte von Kernporenkomplexe (NPCs), kann Kerntransport leicht sichtbar in der Xenopus-Oozyten. Viel Einblick in die Mechanismen der nuklearen Import und Export ist durch den Einsatz dieses Systems (Bewertung von Pante, 2006) gewonnen. Darüber hinaus haben wir die Mikroinjektion von Xenopus Oozyten verwendet, um die nukleare Import Wege von mehreren Viren, die in der Host-Kern replizieren zu sezieren. Hier zeigen wir die cytoplasmatische Mikroinjektion von Xenopus Oozyten mit einem nuklearen Import Substrat. Wir zeigen auch, Vorbereitung der injizierten Oozyten für die Visualisierung von Dünnschicht-Schnitte EM, einschließlich Dissektion, Dehydrierung und Einbettung der Eizellen in ein Epoxidharz eingebettet Harz. Schließlich bieten wir repräsentative Ergebnisse für Oozyten, die mit dem Kapsid des Baculovirus Autographa californica Nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) oder Parvovirus Minute Virus of Mice (MVM) wurden mikroinjiziert, und diskutieren mögliche Anwendungen dieser Technik.

Hier zeigen wir zytoplasmatische Mikroinjektion<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen mit einem nuklearen Import Substrat, sowie die Vorbereitung der injizierten Eizellen für die Visualisierung von Dünnschicht-Schnitte Elektronenmikroskopie.

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Die Mikroinjektion in Oozyten von Xenopus laevis mit anschließender Dünnschnitt-Elektronenmikroskopie (EM) stellt ein exzellentes System zur Untersuchung der nukleozytoplasmatischen ...

Mikroinjektion von Opus Lavu-Zellen, gefolgt von dünnschnittlicher Elektronenmikroskopie, ist ein hervorragendes System zur Untersuchung des nukleoplasmatischen Transports. In diesem Experiment werden die Zellen mit Kollagenase defoliiert, Zellen des Entwicklungsstadiums sechs ausgewählt und in eine Mehrmuldenplatte gegeben. Anschließend werden die Zellen mit einem Substrat für den nukleären Import mikroinjiziert und danach bei Raumtemperatur inkubiert, um den Eintritt des Substrats in den Zellkern zu ermöglichen.Die Zellen werden fixiert und präpariert. Die präparierten Zellen werden in niedrig schmelzendes Agarose eingebettet, erneut mit Osmiumtetroxid fixiert, dehydriert und in ein Epoxidharz eingebettet. Die in Epoxidharz eingebetteten Proben werden mit einem Ultramikrotom geschnitten, und die Schnitte werden auf ein Kupfergitter für die Elektronenmikroskopie aufgebracht.Nach der Färbung werden die Schnitte unter einem Transmissionselektronenmikroskop sichtbar gemacht. Hallo, ich bin Sarah Cohen aus dem Labor von Dr. Nellie Pane am Fachbereich Zoologie der University of British Columbia. Ich bin Shelly Ow, ebenfalls aus dem Panta-Labor.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Mikroinjektion von Zenap Lavis-Zellen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um den nukleären Import von Frachtmolekülen wie Viren zu untersuchen. Beginnen wir also.Um das Experiment zu beginnen, geben Sie ein kleines Stück von etwa zwei Zentimetern Zenap Lavis-Ovar in ein 50-Milliliter-Konischglas, das 20 Milliliter Kollagenase-Lösung enthält. Kollagenase entfernt die Follikelzellen, die die Zellen umgeben. Stellen Sie dann das Gefäß auf die Schüttelplattform und schütteln Sie es vorsichtig bei 100 U/min für 30 Minuten. Diese Zeit variiert je nach Charge der Kollagenase.Nach einer Stunde entnehmen Sie eine kleine Probe der Zellen und untersuchen Sie unter einem Stereomikroskop. Richtig entlaubte Zellen sollten gut voneinander getrennt sein. Führen Sie eine Glasnadel in eine Zelle ein, um zu prüfen, ob sie leicht hineingleitet.Falls die Zellen nicht ausreichend entblättert sind, belassen Sie sie in der Kollagenase-Lösung und überprüfen Sie alle fünf Minuten erneut. Sobald die Zellen ausreichend dereguliert sind, waschen Sie sie dreimal mit modifiziertem Bar-Salz und überführen Sie sie in eine 100 Millimeter große Petrischale, die MBS plus 1 % Penicillin-Streptomycin enthält. Wählen Sie unter Verwendung eines Stereomikroskops reife Zellen im Stadium sechs für die Mikroinjektion aus.Diese Eizellen sind groß und weisen einen deutlichen Kontrast zwischen der schwarzen animalen Hemisphäre und der cremefarbenen vegetativen Hemisphäre auf. Überführen Sie die reifen Eizellen im Stadium sechs in eine Mehrmuldenplatte. Verwenden Sie hierzu einen 200-Mikroliter-Pipettierer mit einer Pipettenspitze, deren Ende abgeschnitten wurde, um eine ungehinderte Aspiration der Oozyten zu ermöglichen, und übertragen Sie die Oozyten vorsichtig in die Mehrmuldenplatte.Wir verwenden eine Mikrotiterplatte ohne Vertiefungen mit einem Brunnenvolumen von 10 Mikrolitern. Die EO-Standorte sind nun bereit für die Mikroinjektion. Bereiten Sie das zu injizierende Importsubstrat vor, indem Sie ein Mikroliter 1 % Bromphenolblau zu 10 Mikrolitern Substrat hinzufügen. Der Bromphenolblau-Farbstoff ermöglicht die Visualisierung der Mikroinjektion.Platzieren Sie dann einen kleinen Streifen Paraform auf einer Petrischale mit 100 Millimeter Durchmesser und geben Sie einen Tropfen von fünf Mikroliter der Injektionslösung auf den Paraform-Streifen. Danach gewinnen Sie eine Injektionsnadel, indem Sie eine 6,6-Mikroliter-Drummond-Mikropipette mit dem Inject Plus Matt Puller ziehen. Kalibrieren Sie die Injektionsnadel, indem Sie alle 0,5 Millimeter Markierungspunkte auf der Nadel anbringen, was einem Volumen von 50 Nanolitern entspricht. Stellen Sie den Mikroinjektor auf Aspirationsmodus und füllen Sie die Nadel mit der Injektionslösung für die zytoplasmatische Injektion.Führen Sie die Nadelspitze in eine Zelle der vegetativen Hemisphäre ein, ganz in der Nähe der animalen Hemisphäre, in einem Winkel von etwa 45 Grad. Drehen Sie dann die Einstellung des Mikroinjektors auf „Mikroinjektion“ und injizieren Sie jeweils 50 Nanoliter Importsubstrat in jede Zelle. Achten Sie auf die Punktmarkierungen an der Nadel, um die Menge des injizierten Substrats zu überwachen, sobald die Injektionen abgeschlossen sind.Überführen Sie die Zellen in eine 35-Millimeter-Petrischale, die mit MBS gefüllt ist. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für den gewünschten Zeitraum. Wählen Sie Zeitpunkte, die die Beobachtung des Importsubstrats in Verbindung mit nukleären Porenkomplexen oder NPCs ermöglichen.Wir verwenden typischerweise Zeitpunkte zwischen 10 und 30 Minuten für Proteine und Viren, die aktiv in Richtung der Kernporenkomplexe transportiert werden. Diese Zeitpunkte hängen außerdem von der Injektionsstelle und der Größe des Proteins oder Virus ab. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, überführen Sie die Zellen in ein vier Milliliter fassendes Glasfläschchen, das 2 % Glutaraldehyd in MBS enthält, und fixieren sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag waschen Sie die Zellen dreimal mit MBS. Nun können die Zellen präpariert werden.Überführen Sie die Zellen in eine kleine Petrischale, die mit Puffer niedriger Salzkonzentration gefüllt ist. Entfernen Sie unter Verwendung eines Stereomikroskops und einer anatomischen Pinzette den vegetativen Pol jedes Oozyten. Es ist hilfreich, das Oozyt mit einem Paar Pinzetten zu stabilisieren, während das andere Paar wie eine Schere verwendet wird, um den vegetativen Pol zu entfernen. Dieser Dissektionsschritt erleichtert das Auffinden des Zellkerns erheblich, wenn die Proben für die Elektronenmikroskopie zurechtgeschnitten und geschnitten werden.An dieser Stelle weist ein bläulicher Schimmer im Zytoplasma auf eine erfolgreiche Mikroinjektion hin; verwerfen Sie Zellen, die nicht erfolgreich mikroinjiziert wurden. Danach fixieren Sie die präparierten Zellen erneut für eine Stunde bei Raumtemperatur mit 2 % Glutaraldehyd in LSB. Nach der Fixierung waschen Sie die präparierten Zellen dreimal mit LSB. Sobald die Zellen gewaschen sind, können die injizierten Oozyten für das Einbetten und das Anfertigen dünner Schnitte vorbereitet werden.Überführen Sie die dissezierten Oozyten in eine Vertiefungsobjektträger, aspirieren Sie so viel wie möglich der Flüssigkeit und handeln Sie dann schnell, damit sie nicht austrocknen. Bedecken Sie die dissezierten Zellen mit 2 % Low-Melting-Agarose, während die Agarose noch weich ist. Trennen Sie die Zellen mit einer Pipettenspitze voneinander und stellen Sie sicher, dass jede Zelle entweder mit der Ober- oder Unterseite nach oben liegt, jedoch nicht seitlich.Lassen Sie das Agros etwa 10 Minuten lang erstarren. Sobald das Agros erstarrt ist, schneiden Sie es mit einer Rasierklinge in kleine Stücke, von denen jedes einen dissezierten Cyten enthält. Anschließend bringen Sie die in Agros eingebetteten Cyten in ein vier Milliliter fassendes Glasfläschchen ein und fixieren sie mithilfe eines Rotationsmischers eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 1 % Osmiumtetroxid in LSB.Nach der Fixierung für eine Stunde die Probe gegebenenfalls dreimal mit LSB waschen. Die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius lagern und am nächsten Tag mit dem Protokoll fortfahren. Die Proben nacheinander in 50 %, 70 % und 90 % Ethanol für jeweils 20 Minuten dehydrieren, anschließend zweimal in 100 % Ethanol für jeweils 15 Minuten dehydrieren.Schließlich die Proben mit 100 % Aceton für 15 Minuten entwässern, nachdem die Entwässerungsschritte abgeschlossen sind. Infiltrieren Sie die Proben mit einer 1:1-Mischung aus Epon, Flua und Aceton für eine Stunde, gefolgt von einer Infiltration mit einer 2:1-Mischung aus Epon und Aceton für zwei Stunden und schließlich mit reinem Epon für mindestens sechs Stunden. Sobald der letzte Infiltrationsschritt abgeschlossen ist, bringen Sie die Proben in flache Einbettungsformen, die mit frischem, reinem Epon gefüllt sind.Orientieren Sie die Zellen so, dass die Seite des Zellkerns, die näher an der Injektionsstelle liegt, zuerst geschnitten wird. In diesem Fall wird die Seite der Zellen, die präpariert wurde, zuerst geschnitten. Dieser Schritt optimiert zunächst die Möglichkeit, den Import des gewählten Substrats zu visualisieren.Wenn die Zellen korrekt ausgerichtet sind, polymerisieren Sie das Epon zwei Tage lang bei 60 Grad Celsius. Nach dem Polymerisationsschritt gewinnen Sie 50 Nanometer dicke Schnitte der in Epoxidharz eingebetteten Proben mittels Ultramikrotom. Sammeln Sie die Schnitte auf einem Kupfer-EM-Probenraster, färben Sie die Proben und visualisieren Sie sie im Transmissionselektronenmikroskop.Wenn das Protokoll erfolgreich war, sollten die nukleäre Hülle und die Kernporenkomplexe in EM-Mikroaufnahmen deutlich sichtbar sein. Abhängig vom injizierten Substrat und der Zeitspanne zwischen Injektion und Fixierung sollte das Substrat an der zytoplasmatischen Seite des Kernporenkomplexes, innerhalb des Kernporenkomplexes oder an der nukleären Seite des Kernporenkomplexes sichtbar sein. Dieses repräsentative Ergebnis zeigt einen Querschnitt durch die nukleäre Hülle mit angrenzendem Zytoplasma und Zellkern aus einer Zenap-Zelle, die mit Kapsiden des Vao-Virus injiziert wurde.A-C-M-N-P-V-Pfeilspitzen zeigen auf Kernporenkomplexe, und ein Kapsid, das an der zytoplasmatischen Seite eines Kernporenkomplexes andockt, ist durch einen weißen Pfeil gekennzeichnet. Im Gegensatz dazu zeigt diese Abbildung einen Querschnitt durch die nukleäre Hülle mit angrenzendem Zytoplasma und Zellkern einer Zenap-Oozyte, die mit dem Parvovirus der Maus injiziert wurde. Mithilfe dieser Technik haben wir festgestellt, dass MVM Störungen der nukleären Hülle induziert.Klammern zeigen Brüche in der nuklearen Hülle an. Pfeilspitzen zeigen auf NPCs, und putative MVM-Kapside, die mit der nuklearen Hülle assoziiert sind, werden durch weiße Pfeile gekennzeichnet. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Xap-Levu-Zellen mikroinjiziert und disseziert.Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass verschiedene Chargen von Kollagenase variieren können. Testen Sie daher Ihre Kollagenase sorgfältig, um die optimale Zeit für die Entlaubung zu bestimmen. Außerdem können die Zellen nach der Entlaubung und dem MBS-Waschschritt bis zu einer Woche lang bei vier Grad Celsius vor der Mikroinjektion gelagert werden.Zuletzt sollten Sie Ihre Glut immer auf Eis versteckt halten und niemals zulassen, dass die Osis austrocknet. Sie müssen während aller Dehydrierungs- und Infiltrationsschritte vollständig untergetaucht sein. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Xenopus embryonalen Epithelien sind ein ideales Modellsystem, um die Zelle Verhaltensweisen wie Polarität Entwicklung und Formänderung beim epithelialen Morphogenese zu studieren. Traditionelle Histologie des festen Proben wird zunehmend durch Live-Cell-konfokale Bildgebung ergänzt. Hier zeigen wir Methoden, um Frosch Gewebe zu isolieren und zu visualisieren leben Epithelzellen und deren Zytoskelett mit Live-cell konfokalen Mikroskopie.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Kultivierung neuronalen Explantaten aus...

Neural Explantatkulturen aus<em&gt; Xenopus laevis</em

Wir beschreiben Methoden zur Manipulation unreifer Eizellen von Xenopus laevis, zur In-vitro-Reifung von Eizellen zu Eizellen und zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion. Dieses Protokoll ermöglicht den Abbau einiger mütterlicher Proteine und die Überexpression von Genen von Interesse während der Befruchtung und ist daher wertvoll, um die Rolle spezifischer Faktoren in der frühen Embryonalentwicklung zu untersuchen.

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Die Kontrolle der Proteinsynthese erfolgt hauptsächlich im Initiationsschritt der Translation, dessen Mängel mit verschiedenen Störungen verbunden sind. Um ihre Ätiologie besser zu verstehen, haben wir hier ein Protokoll mit Xenopus laevis Eizellen beschrieben, das die Translation des mos-Transkripts in Gegenwart einer Mutante des Translationsinitiationsfaktors eIF4G1 bewertet.

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Das Manuskript hier bietet eine einfache Reihe von Methoden für die Sekretion und Verbreitung von fluoreszierend markierten Liganden in Xenopus-Analyse. Dies bietet einen Rahmen für die Prüfung der Fähigkeit von anderen Proteinen zu Ligand Verteilung ändern und erlaubt Experimente, die Einblick in die Mechanismen, die Morphogen Gradienten geben kann.

Mittels konfokaler Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen

Wir beschreiben ein Xenopus-Eizell- und Tierkappensystem für die Expressionsklonierung von Genen, die in der Lage sind, eine Reaktion in kompetentem Ektoderm zu induzieren, und diskutieren Techniken für die anschließende Analyse solcher Gene. Dieses System ist nützlich bei der funktionellen Identifizierung einer Vielzahl von Genprodukten.

Functional Cloning Mit ein<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizellen Expression System

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Verwendung von Schicksalskarten und Abstammungsverfolgungen, um gezielte Injektionen in einzelne Blastomere durchzuführen, aus denen die Niere von Xenopus laevis-Embryonen entsteht.

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

Optimierte Verfahren für die Isolierung einzelner Follikel, zytoplasmatische RNA-Mikroinjektionen, die Entfernung umgebender Zellschichten und die Proteinexpression in Xenopus-Eizellen werden beschrieben. Darüber hinaus wird eine einfache Methode für schnelle Lösungsänderungen in elektrophysiologischen Experimenten mit ligandengesteuerten Ionenkanälen vorgestellt.

Xenopus Oozyten: Optimierte Methoden für die Mikroinjektion, Entfernen von Follicular Zellschichten und schnelle Lösung Änderungen in elektrophysiologischen Experimenten

Dieser Artikel beschreibt eine Verbesserung der konventionellen Voltage-Clamp Fluorometry (VCF), bei der fluoreszierende unnatürliche Aminosäuren (fUAA) anstelle von Maleinimidfarbstoffen verwendet werden, um strukturelle Umlagerungen in Ionenkanälen zu untersuchen. Das Verfahren umfasst Xenopus- Oozyten-DNA-Injektion, RNA / fUAA-Coinjektion und gleichzeitige Strom- und Fluoreszenzmessungen.

Spannklemme Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mit fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren

Dieses Protokoll soll zeigen, wie man ein DNA/DOTAP-Gemisch in Augenknospen von eintägigen Xenopus laevis Embryonen mikroinjiziert und wie man einzelne grüne fluoreszierende Proteine (GFP) abbilden und rekonstruieren kann, die optische axonale Lauben in tektalen Midhirnen von intakte, lebende Xenopus Kaulquappen.

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Gap-Junction-Proteine in Xenopus-Eizellen zu exprimieren und den Sperrschichtstrom zwischen zwei apponierten Eizellen mit einem kommerziellen Verstärker aufzuzeichnen, der für Dual-Eizellen-Spannungs-Clamp-Aufnahmen in einem hohen Seitenstrom-Messmodus entwickelt wurde.

Aufzeichnung des Gap-Junction-Stroms von Xenopus-Eizellen

Lernen Sie die Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten zur Untersuchung des nukleozytoplasmatischen Transports. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung zellulärer Strukturen mittels Dünnschnitt-Elektronenmikroskopie.

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

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