Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

Dieses Verfahren beginnt mit der Herstellung von Morpho- und in vitro transkribierter Kappen-mRNA. Eine Mikropipette wird durch Absaugen der Morpho-haltigen Lösung gefüllt und das Injektionsvolumen wird dann mit einem Mikrometer für eine Zellstufe kalibriert. Die Zebrafischembryonen werden dann entnommen und in einer Mikroinjektionskammer für Dotter-Mikroinjektionen angeordnet.

Die Arbeitslösung wird in das Eigelb direkt unter der Zelle injiziert und zytoplasmatische Bewegungen werden verwendet, um die Lösung für die Mikroinjektionen der Zellen zu transportieren. Injizieren Sie die Lösung nach den Injektionen in das Zytoplasma der Zelle. Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius im Medium E drei und bewerten Sie die Phänotypen, die in den nachfolgenden Stadien von Interesse sind.

Hallo, ich bin Shiloh Yuen aus dem Labor, Dr. Sashas Sohn und die Abteilung für Genetik an der Yale University School of Medicine. Heute werden wir eine robuste Mikroinjektionstechnik zur Durchführung von mRNA-Überexpressions- und Morpho-Oligo-Nukleotid-Gen-Knockdown-Studien im Zebrafisch vorstellen. Wir nutzen dieses Verfahren in unserem Labor, um die Rolle des S-Ziliums bei zystischen Nierenerkrankungen zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Ein leistungsfähiger Ansatz für Genfunktionsstudien ist die Mikroinjektion von in vitro transkribierter gedeckelter RNA in Zebrafischembryonen. In dieser Demonstration werden wir ein EGFP-markiertes Transkript mikroinjizieren und die lebende GFP-Expression des gesamten Embryos als sichtbare Anzeige für eine erfolgreiche Injektion verwenden.

Zuerst führen wir eine In-vitro-Cap-RNA-Transkriptionsreaktion an Ihrem Transkript von Interesse durch. In unserem Labor fügen wir routinemäßig A-C-D-N-A von Interesse in einen PC zwei plus-Vektor ein und führen eine In-vitro-Synthesereaktion großer Mengen gedeckelter RNA mit dem M message M machine SP six Kit durch. Als nächstes reinigen wir die RNA-Probe, indem wir sie durch das RN easy Mini-Kit laufen lassen oder durch Phenolchloroform-Extraktion und Isopropanol-Fällung.

Bestimmen Sie sorgfältig die Konzentration des RNA-Präparats und lagern Sie es bis zur Gebrauchsbereitschaft am Tag der Injektion bei minus 80 Grad Celsius. Tauen Sie den RNA-Probenvortex leicht auf und schleudern Sie ihn kurz nach unten. Bereiten Sie nun mit sterilem Wasser und einer Endkonzentration von 0,025 bis 0,05 % Phenolrot eine Arbeitslösung vor, Phenolrot dient als sichtbarer Marker für die Injektion der Lösung in den Embryo.

Hier werden wir eine Arbeitslösung von 100 Nanogramm pro Mikroliter EGFP-mRNA mit 0,05 % Phenolrot herstellen. Bewahren Sie zum Schluss die Arbeitsprobe auf Eis auf und stellen Sie den RNA-Bestand wieder auf minus 80 Grad Celsius. Fahren Sie mit der Vorbereitung des Morphos fort, wenn Sie bereit sind, diese Probe zu injizieren.

Morino-Antisense-Oligonukleotide werden häufig verwendet, um die Genexpression zu modifizieren, indem sie die Translation eines Zielproteins blockieren oder Prem-NA modifizieren. Das Spleißen von Morphos im Zebrafisch dient als mächtiges Werkzeug der reversen Genetik, indem es die Genfunktion ausschaltet. Hier werden wir ein Morph-Oligo mikroinjizieren, das auf die translationale Initiationsstelle von pkd zwei abzielt. Wir verwenden routinemäßig 300 M eines Morph-Oligos, das speziell für ein Gen von Interesse entwickelt wurde, das von Gene Tools LLC gewonnen wurde.

Dann fügen wir 100 Mikroliter steriles Wasser hinzu, um eine drei Millimolare Stammlösung herzustellen, aliquotieren die Lösung und lagern sie bei minus 20 Grad Celsius, bis sie am Tag der Injektion gebrauchsfertig ist. Wir erhitzen die Morino-Lösung fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Dann kühlen wir die Lösung sofort auf Eis ab und drehen sie kurz: Dieser Schritt denaturiert alle Sekundärstrukturen im Oligo und sorgt dafür, dass die Lösung vollständig löslich ist.

Als nächstes bereiten wir eine Arbeitslösung her, indem wir die Morpho-Lösung in sterilem Wasser und einer Endkonzentration von 0,025 bis 0,05 % Pinalrot verdünnen. In dieser Demonstration bereiten wir eine Arbeitslösung aus 0,5 Millimolar PKD zwei Morino mit 0,05 % Phenolrot her. Bewahren Sie die Arbeitslösung bei Raumtemperatur auf und fahren Sie mit der Mikropipettenfüllung fort, wenn Sie bereit sind, diese Probe zu injizieren.

Zu Beginn müssen wir Mikropipetten herstellen, die für die Injektionen verwendet werden. Dies geschieht durch Erhitzen und Ziehen von BOS-Silikatglas-Kapillarröhrchen in einem polaren Mikropipettengerät. Sobald die Nadeln gezogen sind, werden sie in einer Petrischale auf einer kleinen Menge Ton oder Klebeband aufbewahrt.

Als nächstes bereiten wir Mikroinjektionskammerplatten vor, indem wir 1,5 % aros in eine XE mit drei mittelgroßen Platten gießen, die mit keilförmigen Trögen geformt sind. Dies dient als einfache Methode, um die Embryonen während der Injektion zu halten. Anschließend werden die Agrokammerplatten erstarrt und bei vier Grad Celsius gelagert, bis sie einsatzbereit sind.

Um mit dem Befüllen der Mikropipette zu beginnen. Schneiden Sie die distale Spitze mit einer Pinzette oder einer chirurgischen Rasierklinge ab, um eine Öffnung zu schaffen, die unter einem Präpariermikroskop bei 50-facher Vergrößerung gerade sichtbar ist. Geben Sie als nächstes zwei Mikroliter Ihrer Arbeitslösung hinein.

Befestigen Sie als Tropfen auf einem Deckglas die Rückseite einer Mikropipette an einer Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einem Schlauch an einer Injektionsnadel versehen ist, und tauchen Sie die distale Spitze der Mikropipette leicht in Ihren Tropfen Arbeitslösung ein. Achten Sie darauf, dass die Spitze der Mikropipette nicht bricht. Saugen Sie die Arbeitslösung durch das distale Ende der Mikropipette ab, indem Sie am Kolben der Spritze ziehen.

Als Nächstes kalibrieren wir das Injektionsvolumen der Mikropipette. Geben Sie einen Tropfen Mineralöl auf einen Mikrometerschieber und schalten Sie die Strom- und Luftzufuhr zum Druckimpuls-Mikroinjektorgerät ein. Befestigen Sie als Nächstes die Mikropipette an der Mikropipettenhalterung des Mikroinjektorgeräts.

Der Mikroinjektor ist druckgeregelt und die Entladungen werden durch Drücken des Fußpedals unter dem Präpariermikroskop aktiviert. Testen Sie das Injektionsvolumen, indem Sie mit dem Mikroinjektor einen Tropfen Ihrer Arbeitslösung auf das Mikrometeröl geben. Miss den Durchmesser des Tropfens, während er als Kugel auf dem Öl schwimmt.

Passen Sie die Dauer und den Druck der Injektion an, um Ihr Injektionsvolumen sorgfältig zu kalibrieren. Dieser Schritt trägt zur Reproduzierbarkeit des Mikroinjektionsexperiments bei. In dieser Demonstration werden alle Mikroinjektionen mit einem Tropfendurchmesser von 0,15 Millimetern durchgeführt.

Sobald Ihr Injektionsvolumen kalibriert wurde, verwenden Sie den Halteknopf am Mikroinjektor, um ein Zurückfüllen und Auslaufen der Mikropipette zu verhindern. Jetzt ist es an der Zeit, die Zebrafischembryonen vorzubereiten. Zebrafische paaren sich nach dem Zufallsprinzip in den ersten Stunden eines jeden Morgens, um mit der Vorbereitung zu beginnen, sammeln Embryonen im Ein-Zell-Stadium und platzieren sie in einem XE drei Medium.

Ordnen Sie die Embryonen mit einer Drei-Milliliter-Transferpipette entlang der keilförmigen Tröge in den Mikroinjektionskammerplatten an. Entfernen Sie das Medium, so dass die Embryonen flach, untergetaucht und nicht überflutet sind. Dieser Schritt hilft bei der Ansiedlung der Embryonen am Boden der Tröge sowie beim Eindringen der Mikropipette in die Kornzelle.

Jetzt beginnen wir mit den Injektionen. Zuerst manipulieren wir die Embryonen mit der Mikropipette so, dass das Zytoplasma des Embryos im Einzelzellstadium unter dem Präpariermikroskop sichtbar ist. Achten Sie darauf, dass Sie die Spitze der Mikropipette nicht brechen, dringen Sie in das Corion ein und dann mit der Mikropipette in das Eigelb, um es in den Embryo zu injizieren.

In dieser Demonstration werden wir zunächst direkt unter der Zelle in das Eigelb mikroinjizieren und die Arbeitslösung durch Zytoplasma und Diffusion in die Zelle bringen lassen. Dieser Fluss wird durch das Phenolrot sichtbar, das der Arbeitslösung zugesetzt wird. Da es sich um einen einzelligen Embryo handelt, kann er freihändig oder mit einem Manipulator injiziert werden.

Wir werden auch die direkte Injektion in das Zytoplasma der Zelle demonstrieren. Die direkte Mikroinjektion in die Zelle ist robuster, aber zeitaufwändiger, da die richtige Embryoausrichtung und Mikroinjektionstechnik erforderlich sind. Da die Zellmembran strenger ist als die Dottermembran, ist es oft schneller, durch das Eigelb in die Mikropipette einzudringen, um die Zelle zu erreichen.

Zytoplasma, das den tierischen Pol zum Boden des Trogs hin ausrichtet und mit ruhigen Händen arbeitet, kann bei dieser Injektionsmethode hilfreich sein. Nach der Mikroinjektion legen Sie die Embryonen in eine Petrischale mit E drei Medium und inkubieren Sie sie bei 28,5 Grad Celsius für eine normale Entwicklung. Beobachten Sie in den nächsten Stunden und Tagen der Embryonalentwicklung die Embryonen auf die für Sie interessanten Phänotypen.

Um den Erfolg der Mikroinjektion zu überprüfen, werden wir die Expression von GFP in den sich entwickelnden Embryonen ab dem Schildstadium durch in vivo Fluoreszenzmikroskopie des gesamten Embryos überwachen. Die Expression des Konstrukts ist in den frühen Phasen der Embryonalentwicklung am stärksten und nimmt während der Entwicklung oft ab. Da die injizierte gedeckelte RNA allmählich abgebaut wird, hängt sie von der Stabilität des exprimierten Proteins ab. Basierend auf zuvor veröffentlichten Ergebnissen erwarten wir, dass das PKD 2-Morphin die Krümmung der dorsalen Körperachse nachahmt, wie sie bei PKD zwei mutierten Zebrafischen und Nierenzysten etwa zwei bis drei Tage nach der Befruchtung gefunden wurde.

Wir haben Ihnen gerade eine robuste Mikroinjektionstechnik zur Durchführung von mRNA-Überexpressions- und Morpho-Oligonukleotid-Gen-Knockdown-Studien am Zebrafisch gezeigt, wenn Sie dieses Verfahren durchführen. Mit ruhiger Hand injizieren. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.