Name: Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-07T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Mikroinjektionstechnik für mRNA-Überexpression und Morpholino-vermittelten Gen-Knockdown in Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht präzise genetische Manipulationen in der Entwicklungsbiologie.

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Diese Arbeit wurde durch die NIH und PKD Stiftung ZS unterstützt. Alle Tierexperimente wurden nach Yale Tiere Resources Center (YARC) und Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Richtlinien durchgeführt.

Teil 1: Herstellung von Mikropipetten und die Mikroinjektion Kammerplatten <ol><li> Fertigen Mikropipetten durch Erhitzen und Ziehen Borosilikatglas Kapillaren (World Precision Instruments, Inc., 1B100-4) in einer Mikropipette Abziehvorrichtung (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown P-97). Shop in einer Petrischale auf der kleinen Menge von Ton oder Klebeband. </li><li> Gießen Sie 1,5% Agarose (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00500) in 1x E3 Medium-Platten mit keilförmigen Rinnen, die als eine einfache Methode zur Aufnahme des Embryos während der Injektion dienen (wie in &quot;Der Zebrafisch Book&quot; beschrieben) wird geformt 1. Lassen Agar Kammerplatten erstarren vor dem Gebrauch und Lagerung bei 4 º C. </li></ol> Teil 2: Herstellung von RNA Ein leistungsfähiges Konzept für die Gen-Funktions-Studien ist es, in vitro transkribiert capped RNA in Zebrafisch-Embryonen microinject. Capped RNA verhält sich ähnlich wie eukaryotischen mRNAs in vivo durch die Anwesenheit der GAP analog gefunden. Zebrafisch Forscher routinemäßig nutzen diese Methode, um überexprimieren oder misexpress ihre Gen von Interesse. In dieser Demonstration werden wir microinject eines EGFP-markierten Transkript und Nutzung leben ganzen Embryo GFP-Expression als eine sichtbare Anzeige für eine erfolgreiche Injektion. <ol><li> Führen Sie eine In-vitro-CAP RNA-Transkription Reaktion auf Ihrem Transkript des Interesses. In unserem Labor haben wir routinemäßig legen Sie eine cDNA von Interesse in einen pCS2 + Vektor, und führen Sie ein in vitro-Synthese-Reaktion von großen Mengen von capped RNA mit dem mMessage mMachine SP6 Kit (Ambion, Inc., AM1340). </li><li> Purify der RNA-Probe, indem Sie es durch die RNeasy Mini Kit (Qiagen, Inc., 74104) oder durch Phenol: Chloroform-Extraktion und Isopropanol-Fällung. </li><li> Sorgfältig bestimmen die Konzentration der RNA-Präparation und Lagerung bei -80 º C bis zur Verwendung. </li><li> Am Tag der Injektion, tauen die RNA-Probe, Wirbel leicht und Spin-down kurz. </li><li> Bereiten Sie eine funktionierende Lösung mit sterilem Wasser und eine endgültige Konzentration von 0,025 bis 0,050% Phenolrot (Sigma-Aldrich Co., P0290). Phenolrot dient als sichtbare Markierung für die Injektion der Lösung in den Embryo. In diesem Artikel werden wir eine funktionierende Lösung von 100 ng / ul EGFP mRNA mit 0,050% Phenolrot vorzubereiten. </li><li> Halten Sie arbeiten Probe auf Eis und zurück RNA Lager bis -80 ° C. </li><li> Fahren Sie mit Teil 4 als bereit, diese Probe zu injizieren. </li></ol> Teil 3: Herstellung von Morpholino Morpholino Antisense-Oligonukleotide sind weit verbreitet, um die Genexpression durch die Blockierung Übersetzung eines Zielproteins oder durch die Änderung pre-mRNA-Spleißen 2,3 zu ändern. Morpholinos in der Zebrafisch als leistungsfähige reversen Genetik Werkzeug dienen, indem man den Gen-Funktion. In diesem Artikel werden wir microinject eine Morpholino Oligo gezielt auf die Translation zur Website von PKD2 (5&#39;-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 &#39;). Basierend auf vorher festgelegten Arbeiten erwarten wir, dass die injizierten Embryonen phänotypisch imitieren PKD2 mutierten Fische 4. <ol><li> Wir routinemäßig um 300 nmol eines Morpholino Oligo speziell für ein Gen von Interesse von Gene Tools, LLC (Philomath, OR) entwickelt. </li><li> Add 100 uL sterilem Wasser zu einer 3 mM-Stammlösung zu machen. Aliquot der Lösung und bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Am Tag der Injektion Wärme der Morpholino-Lösung bei 65 ° C für 5 Minuten. Snap kühl auf Eis sofort und Spin kurz. Dieser Schritt denaturiert alle sekundären Strukturen in der Oligo und sorgt dafür, dass die Lösung vollständig gelöst. </li><li> Bereiten Sie eine funktionierende Lösung durch Verdünnen der Morpholino-Lösung in sterilem Wasser und eine endgültige Konzentration von 0,025 bis 0,050% Phenolrot. In dieser Demonstration werden wir vorbereiten eine funktionierende Lösung von 0,50 mM PKD2 Morpholino mit 0,050% Phenolrot. </li><li> Keep funktionierende Lösung bei Raumtemperatur. </li><li> Fahren Sie mit Teil 4 als bereit, diese Probe zu injizieren .---- </li></ol> Teil 4: Füllen der Mikropipette mit Ihrem funktionierende Lösung <ol><li> Cut der distalen Spitze einer Mikropipette mit einer Pinzette oder einer chirurgischen Rasierklinge, um eine Öffnung, die gerade noch sichtbar unter einem Binokular (Nikon Instruments, Inc., SM2645) bei 50X Vergrößerung ist zu schaffen. </li><li> Platz 2 uL Ihrer Gebrauchslösung wie ein Tropfen auf einem Deckglas. </li><li> Befestigen Sie die Rückseite einer Mikropipette auf eine 5 ml-Spritze mit Schlauch auf einer Injektionsnadel und leicht untertauchen der distalen Spitze der Mikropipette in die Tropfen funktionierende Lösung ausgestattet. Achten Sie darauf, die Spitze der Mikropipette zu brechen. </li><li> Siphon der Arbeitslösung durch das distale Ende der Mikropipette, indem Sie den Kolben der Spritze. </li></ol> Teil 5: Kalibrierung der Mikropipette Injektionsvolumen <ol><li> Geben Sie einen Tropfen Mineralöl (American Bioanalytische, Inc., AB00921-00025) auf einem Mikrometer slide (Fisher, 12-561-SM1). </li><li> Schalten Sie die Stromversorgung und Luftzufuhr, um den Druck-gepulsten Mikro Injektorvorrichtung (World Precision Instruments Inc., PV830). </li><li> Bringen Sie die Mikropipette auf die Mikropipette Inhaber der Mikro Injektorvorrichtung. Die Mikro-Injektor wird der Druck reguliert und Entladungen werden durch Drücken des Pedals aktiviert. </li><li> Unter dem Dissektionsmikroskop, testen das Injektionsvolumen mit dem Mikro-Injektor zu einem Rückgang der funktionierende Lösung auf den Mikrometer-Öl statt. Messen Sie den Durchmesser der Tropfen, wie sie als eine Kugel auf der Oberseite des Öl schwimmt. </li><li> Stellen Sie die Dauer und der Druck der Injektion sorgfältig kalibrieren Ihr Volumen der Injektion. Dieser Schritt hilft bei der Reproduzierbarkeit der Mikroinjektion Experiment. In dieser Demonstration werden alle microinjections mit einem Tropfen Durchmesser von 0,15 mm (ungefähr 1,76 nL in Volumen) durchgeführt werden. </li><li> Sobald Ihr Injektionsvolumen kalibriert wurde, verwenden Sie die &quot;Hold&quot;-Knopf auf der Mikro-Injektor zur Verfüllung und undichte der Mikropipette zu verhindern. </li></ol> Teil 6: Vorbereiten befruchtete Zebrafisch-Embryos für die Mikroinjektion <ol><li> Zebrafische nach dem Zufallsprinzip in den ersten Stunden des Morgens mate. Sammeln Embryonen im 1-Zell-Stadium und legen Sie sie in 1x E3 Medium. </li><li> Mit einem 3 mL Transfer-Pipette (Becton Dickinson Labware, 357524), ordnen Sie die Embryonen an der keilförmigen Rinnen in die Mikroinjektion Kammerplatten. </li><li> Entfernen Sie das Medium so, dass die Embryonen flach sind untergetaucht und nicht überflutet. Dieser Schritt hilft bei der Lösung des Embryos an der Unterseite der Tröge sowie in der Durchdringung des Chorion durch die Mikropipette. </li></ol> Teil 7: Mikroinjektion durch das Chorion <ol><li> Bearbeiten Sie die Embryonen mit der Mikropipette, so dass das Zytoplasma der 1-Zell-Stadium Embryos sichtbar unter dem Binokular ist. Achten Sie darauf, die Spitze der Mikropipette zu brechen. </li><li> Dringen in die Chorion und dann das Eigelb mit der Mikropipette, um in den Embryo zu injizieren. In dieser Demonstration werden wir zunächst Mikroinjektion in den Dotter direkt unterhalb der Zelle sein, und erlauben zytoplasmatische Strömung und Diffusion an die funktionierende Lösung in die Zelle zu bringen. Dieser Fluss wird sichtbar durch die Phenolrot hinzugefügt, um die funktionierende Lösung. </li><li> Wir werden auch zeigen, direkte Injektion in das Zytoplasma. Die direkte Mikroinjektion in die Zelle ist robuster, aber zeitaufwendig, da richtige Embryo Orientierung und Mikroinjektionstechnik erforderlich ist. Da die Zellmembran ist strenger als die Dotterhaut, ist es oft schneller auf die Mikropipette durch das Eigelb geben, um Zytoplasma der Zelle zu erreichen. Die Ausrichtung der animalen Pol in Richtung Boden der Wanne und die Arbeit mit ruhige Hände können bei dieser Methode der Injektion zu unterstützen. </li><li> Nach Mikroinjektion, legen Sie die Embryonen in einer Petrischale mit E3 mittel-und inkubieren sie bei 28,5 ° C für eine normale Entwicklung. </li><li> Im Laufe der nächsten Stunden und Tage der Embryonalentwicklung, beobachten die Embryonen für Ihre Phänotypen von Interesse. </li></ol> Teil 8: Repräsentative Ergebnisse EGFP mRNA-Überexpression: Um zu überprüfen, den Erfolg der Mikroinjektion, überwachen wir die Expression von GFP in den sich entwickelnden Embryonen ab Schild Stufe (~ 6 hpf) durch in vivo whole-Embryo-Fluoreszenzmikroskopie (Leica Microsystems GmbH, MZFLIII). Expression des Konstrukts ist am starken während der frühen Ereignisse der embryonalen Entwicklung und wird oft während der Entwicklung schwinden, da die injizierten capped RNA wird allmählich abgebaut und hängt von der Stabilität des exprimierten Proteins. PKD2 translationale-blocking Morpholino: Basierend auf den bisher veröffentlichten Ergebnissen erwarten wir, dass die PKD2 morphants zum dorsalen Körperachse Krümmung wie in PKD2 mutierte Zebrafische und Gegenwart Nierenzysten bei etwa 2 zu imitieren - 3 dpf 4. <img src="/files/ftp_upload/1113/1113fig1.png" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Repräsentative Ergebnisse aus Mikroinjektion von EGFP mRNA und PKD2 August Morpholino. (A) TAB Embryonen wurden bei der 1-Zell-Stadium mit 0,17 ng EGFP mRNA mikroinjiziert und visualisiert bei 1 dpf für in vivo GFP-Expression. (B, c) TAB Embryonen wurden bei der 1-Zell-Stadium mit ~ 1,7 nl einer PKD2 translationale blockiert Morpholino bei 0,50 mM mikroinjiziert und erzielte für die dorsale Körper Krümmung bei 4 dpf.

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</ol>

Mikroinjektion in Zebrafisch-Embryonen ist eine gut etablierte und robuste Technik für die Erkundung der Rolle eines bestimmten Gens in der Entwicklung. Zu den Anwendungen gehören Überexpression misexpression und Knockdown Assays Ihrer Gen von Interesse als auch epistatisch Analyse zwischen mehreren Genen. Mikroinjektion in Zebrafisch wurde weithin für die Erzeugung transgener Tiere und Mapping-Zell-Schicksal in frühen Blastula Embryonen 5,6,7,8,9 verwendet. Darüber hinaus dient die Anwendung dieser Technik, ...

Alle anderen Materialien werden im Protokoll aufgelistet.

mikroinjektion von mrna und morpholino antisense oligonukleotide in zebrafisch-embryonen.

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Ein wesentliches Werkzeug zur Untersuchung der Rolle eines Gens während der Entwicklung ist die Fähigkeit, Gen Knockdown, Überexpression und misexpression Studien durchzuführen. In Zebrafisch (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), Bietet die Mikroinjektion von RNA, DNA, Proteine, Antisense-Oligonukleotide und andere kleine Moleküle in den sich entwickelnden Embryo Forscher eine schnelle und robuste Assay für die Erkundung der Genfunktion<em&gt; In vivo</em&gt;. In diesem Video-Artikel werden wir zeigen, wie die Vorbereitung und microinject<em&gt; In-vitro-</em&gt; Synthetisiert EGFP mRNA und eine translatorische-blocking Morpholino Oligo gegen<em&gt; PKD2</em&gt;, Ein Gen mit autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD), in 1-Zell-Stadium Zebrafischembryonen verbunden. Wir werden dann analysiert den Erfolg der mRNA und Morpholino microinjections durch Überprüfung der GFP-Expression und Phänotyp-Analyse. Broad Anwendungen dieser Technik gehören Erzeugung transgener Tiere und Keimbahn-Chimären, Zell-Schicksal-Mapping und Gen-Screening. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Überexpression von EGFP und Knockdown von<em&gt; PKD2</em&gt; Durch mRNA und Morpholino Oligonukleotid Injektion.

Mikroinjektion ist eine gut etablierte und effektive Methode für die Einführung von Fremdstoffen in befruchtete Zebrafisch-Embryos. Hier zeigen wir eine robuste Mikroinjektionstechnik für die Durchführung von mRNA-Überexpression und Morpholino-Oligonukleotid-Gen Knockdown Studien im Zebrafisch.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

Ein wesentliches Instrument zur Untersuchung der Rolle eines Gens während der Entwicklung ist die Fähigkeit, einen Gene Knockdown, eine Überexpression sowie eine Mischexpression durchzuführen ...

Dieses Verfahren beginnt mit der Herstellung von Morpholino- und in-vitro-transkribiertem cap-mRNA. Eine Mikropipette wird durch Absaugen der Morpholino-haltigen Lösung gefüllt, und das Injektionsvolumen wird anschließend mithilfe eines Mikrometers an einem Ein-Zell-Stadium kalibriert. Danach werden Zebrafischembryonen gesammelt und in einer Mikroinjektionskammer für Mikroinjektionen in das Eiweiß angeordnet.Die Arbeitslösung wird in das Eiweiß direkt unterhalb der Zelle injiziert, und zytoplasmatische Bewegungen dienen dazu, die Lösung für mikroinjektionen in die Zelle zu transportieren. Injizieren Sie die Lösung anschließend in das Zellzytoplasma. Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius in E3-Medium und bewerten Sie die Phänotypen von Interesse in den nachfolgenden Entwicklungsstadien.Hallo, ich bin Shiloh Yuen aus dem Labor, Sohn von Dr. Sasha und der Abteilung für Genetik an der Yale University School of Medicine. Heute werden wir eine robuste Mikroinjektionstechnik demonstrieren, mit der mRNA-Überexpression und Gen-Knockdown-Studien mittels morphologischer Oligonukleotide bei Zebrafischen durchgeführt werden können. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Rolle des S-Ziliums bei zystischen Nierenerkrankungen zu untersuchen.Beginnen wir also. Ein leistungsfähiger Ansatz für Genfunktionsstudien besteht darin, in vitro transkribierte, kapazillerte RNA in Zebrafischembryonen mikroinjizieren. In dieser Demonstration werden wir einen mit EGFP markierten Transkript mikroinjizieren und die lebende, gesamte Embryonal-GFP-Expression als sichtbaren Nachweis einer erfolgreichen Injektion verwenden.Zunächst führen wir eine in-vitro-Cap-RNA-Transkriptionsreaktion für Ihren Transkript-Strang der Wahl durch. In unserem Labor klonen wir üblicherweise das gewünschte A-C-D-N-A in einen PCs-two-plus-Vektor und führen eine in-vitro-Synthese-Reaktion zur Herstellung großer Mengen kapptierter RNA mit dem M-message-M-machine-SP-sechs-Kit durch. Anschließend reinigen wir die RNA-Probe mithilfe des RN-easy-mini-Kits oder durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Isopropanol-Fällung.Bestimmen Sie sorgfältig die Konzentration der RNA-Präparation und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie am Tag der Injektion verwendet wird. Tauen Sie die RNA-Probe auf, wirbeln Sie sie vorsichtig um und zentrifugieren Sie sie kurz. Bereiten Sie nun eine Arbeitslösung mit steriler Wasser und einer Endkonzentration von 0,025 bis 0,05 % Phenolrot vor; Phenolrot dient als sichtbarer Marker für die Injektion der Lösung in den Embryo.Hier bereiten wir eine Arbeitslösung von 100 Nanogramm pro Mikroliter EGFP-mRNA mit 0,05 % Phenolrot vor. Bewahren Sie die Arbeitsprobe schließlich auf Eis auf und stellen Sie die RNA-Grundlösung wieder bei minus 80 Grad Celsius zurück. Fahren Sie mit der Vorbereitung des Morphos fort, sobald Sie bereit sind, diese Probe zu injizieren.Morpholino-Antisense-Oligonukleotide werden häufig verwendet, um die Genexpression zu modifizieren, indem sie die Translation eines gezielten Proteins blockieren oder die Vorläufer-mRNA-Spleißen beeinflussen. Morpholinos im Zebrafisch dienen als leistungsfähiges Werkzeug der umgekehrten Genetik, indem sie die Genfunktion herunterregulieren. Hier werden wir ein auf die Translationsstartstelle von pkd2 ausgerichtetes Morpholino-oligonukleotid mikroinjizieren. Üblicherweise verwenden wir 300 M eines Morpholino-Oligonukleotids, das speziell für ein Gen von Interesse konzipiert ist und von Gene Tools LLC bezogen wurde.Anschließend geben wir 100 Mikroliter sterilem Wasser hinzu, um eine dreimolare Stammlösung herzustellen, portionieren die Lösung anschließend und lagern sie bei minus 20 Grad Celsius, bis sie am Tag der Injektion verwendet wird. Wir erhitzen die Morino-Lösung fünf Minuten lang auf 65 Grad Celsius. Danach kühlen wir die Lösung sofort auf Eis ab und zentrifugieren kurz. Dieser Schritt denaturiert sämtliche sekundären Strukturen im Oligo und stellt sicher, dass die Lösung vollständig gelöst ist.Danach stellen wir eine Arbeitslösung her, indem wir die Morpho-Lösung in sterilem Wasser verdünnen und eine Endkonzentration von 0,025 bis 0,05 % Pinalrot erreichen. In dieser Demonstration werden wir eine Arbeitslösung von 0,5 Millimolar PKD zwei Morino mit 0,05 % Phenolrot herstellen. Bewahren Sie die Arbeitslösung bei Raumtemperatur auf und füllen Sie die Mikropipette, sobald Sie bereit sind, diese Probe zu injizieren.Zunächst müssen Mikropipetten für die Injektionen hergestellt werden. Dazu werden BOS-Silikat-Glaskapillaren in einer Mikropipettenziehvorrichtung erhitzt und auseinandergezogen. Nach dem Ziehen werden die Nadeln in einer Petrischale auf einer kleinen Menge Klebeton oder Klebeband aufbewahrt.Danach bereiten wir Mikroinjektionskammerplatten vor, indem wir 1,5 % Agarose in eine XE-three-Medium-Platte gießen, die mit keilförmigen Rillen geformt ist. Dies dient als einfache Methode, um die Embryonen während der Injektion zu fixieren. Die Agar-Kammerplatten werden anschließend gerinnen lassen und bei vier Grad Celsius gelagert, bis sie verwendet werden.Um mit dem Befüllen der Mikropipette zu beginnen, schneiden Sie die distale Spitze mit einer Pinzette oder einer chirurgischen Rasierklinge ab, um eine Öffnung zu erzeugen, die unter einem Stereomikroskop bei 50-facher Vergrößerung gerade noch sichtbar ist. Geben Sie anschließend zwei Mikroliter Ihrer Arbeitslösung hinein.Als Tropfen auf einen Deckgläser, befestigen Sie die Rückseite einer Mikropipette an einer Fünf-Milliliter-Spritze, die mit Schlauch an einer Kanüle befestigt ist, und tauchen Sie die distale Spitze der Mikropipette leicht in Ihren Tropfen der Arbeitslösung ein. Achten Sie darauf, die Spitze der Mikropipette nicht zu beschädigen. Saugen Sie die Arbeitslösung durch das distale Ende der Mikropipette, indem Sie den Kolben der Spritze ziehen.Als Nächstes kalibrieren wir das Injektionsvolumen der Mikropipette. Geben Sie einen Tropfen Mineralöl auf einen Mikrometerschlitten und schalten Sie die Strom- und Luftzufuhr zum Druckpuls-Mikroinjektorgerät ein. Befestigen Sie anschließend die Mikropipette am Mikropipettenhalter des Mikroinjektorgeräts.Der Mikroinjektor ist druckgeregelt, und die Ausstöße werden durch Betätigen des Fußpedals unter dem Präparationsmikroskop ausgelöst. Prüfen Sie das Injektionsvolumen, indem Sie mit dem Mikroinjektor einen Tropfen Ihrer Arbeitslösung auf das Mikrometeröl bringen. Messen Sie den Durchmesser des Tropfens, während er als Kugel auf der Oberfläche des Öls schwimmt. Passen Sie Dauer und Druck der Injektion an, um das Injektionsvolumen sorgfältig zu kalibrieren. Dieser Schritt trägt zur Reproduzierbarkeit des Mikroinjektionsexperiments bei. In dieser Demonstration erfolgen alle Mikroinjektionen mit einem Tropfendurchmesser von 0,15 Millimetern.Schließlich, nachdem das Injektionsvolumen kalibriert wurde, verwenden Sie den Halteknopf am Mikroinjektor, um ein Rückfüllen und Austreten aus der Mikropipette zu verhindern. Nun ist es an der Zeit, die Zebrafischembryonen vorzubereiten. Zebrafische paaren sich zufällig in den ersten Stunden jedes Morgens; um mit der Vorbereitung zu beginnen, sammeln Sie die Embryonen im Ein-Zell-Stadium und bringen Sie in 1× E3-Medium.Ordnen Sie die Embryonen mit einer dreimilliliter-Transferpipette entlang der keilförmigen Rillen in den Mikroinjektionskammernplatten an. Entfernen Sie das Medium, sodass die Embryonen flach untergetaucht und nicht überflutet sind. Dieser Schritt erleichtert das Absinken der Embryonen auf den Boden der Rillen sowie das Eindringen der Mikropipette durch die Chorionhülle.Jetzt beginnen wir mit den Injektionen. Zunächst manipulieren wir die Embryonen mit der Mikropipette, sodass das Zytoplasma des Embryos im Ein-Zell-Stadium unter dem Stereomikroskop sichtbar ist. Achten Sie darauf, die Spitze der Mikropipette nicht zu beschädigen, durchdringen Sie mit der Mikropipette zuerst die Chorionhülle und dann das Eiweiß, um in den Embryo hinein zu injizieren.In dieser Demonstration injizieren wir zunächst direkt in das Eiweiß unmittelbar unterhalb der Zelle und lassen den Wirkstoff durch zytoplasmatische Strömung und Diffusion in die Zelle gelangen. Dieser Fluss ist aufgrund des dem Wirkstoff zugesetzten Phenolrots sichtbar. Da es sich um einen Einzelzellembryo handelt, kann er freihand oder mit einem Manipulator injiziert werden.Wir werden außerdem die direkte Injektion in das Zellzytoplasma demonstrieren. Die direkte Mikroinjektion in die Zelle ist zwar robuster, aber zeitaufwändiger, da eine korrekte Ausrichtung des Embryos und eine präzise Mikroinjektionstechnik erforderlich sind. Da die Zellmembran widerstandsfähiger ist als die Dottmembran, ist es oft schneller, die Mikropipette durch den Dott zu führen, um die Zelle zu erreichen.Die Ausrichtung des Cytoplasmas mit der Animalpole nach unten in der Rille und das Arbeiten mit ruhigen Händen können bei dieser Injektionsmethode hilfreich sein. Nach der Mikroinjektion die Embryonen in eine Petrischale mit E3-Medium überführen und zur normalen Entwicklung bei 28,5 Grad Celsius inkubieren. Während der nächsten Stunden und Tage der Embryonalentwicklung die Embryonen auf die gewünschten Phänotypen hin beobachten.Um den Erfolg der Mikroinjektion zu überprüfen, werden wir die Expression von GFP in den sich entwickelnden Embryonen ab dem Schild-Stadium mittels in-vivo-Gesamtembryo-Fluoreszenzmikroskopie überwachen. Die Expression des Konstrukts ist während der frühen Ereignisse der embryonalen Entwicklung am stärksten und nimmt häufig im Verlauf der Entwicklung ab, da die injizierte cappierte RNA allmählich abgebaut wird und die Stabilität des exprimierten Proteins abhängt. Basierend auf zuvor veröffentlichten Ergebnissen erwarten wir, dass das PKD2-Morpholino die dorsale Körperachsenkrümmung nachahmt, wie sie bei PKD2-Mutanten-Zebrafischen beobachtet wird, und dass sich etwa zwei bis drei Tage nach der Befruchtung Nierenzysten bilden.Wir haben Ihnen soeben eine robuste Mikroinjektionstechnik gezeigt, mit der man mRNA-Überexpression und Gen-Knockdown-Studien mittels Morpholino-Oligonukleotiden bei Zebrafischen durchführen kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, mit einer ruhigen Hand zu injizieren. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

JoVE Journal

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Biologie

Dieses Video zeigt, wie Morpholino-oder mRNA in Zebrafisch-Embryonen können bei der Ein-Zell-Stadium zu verringern oder zu erhöhen das Niveau der spezifischen Genprodukte bei der späteren Entwicklung injiziert werden.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

Eine Methode, um Morpholinos direkt liefern in der Zebrafisch otocyst bei 24hpf entwickelt worden. Mit Mikroinjektion von Morpholinos in das Lumen des otic Vesikel und Elektroporation, um das Eindringen Effekt, konnten wir die Wirkung von Morpholinos auf das Gehirn zu umgehen und erhalten Wirkungen, die spezifisch an das Innenohr.

Direkte Lieferung von MIF Morpholinos Into the Zebrafisch Otocyst durch Injektion und Elektroporation Beeinflusst Inner Ear Entwicklung

Eine Methode, bedingt Knockdown ein Zielprotein Ausdruck in der erwachsenen Zebrafisch Retina beschrieben, das geht intravitreal Injektion antisense Morpholinos und Elektroporation sie in der Netzhaut. Das resultierende Protein ist für mehrere Tage, die Prüfung des Proteins Rolle bei der Regeneration oder intakten Netzhaut ermöglicht klopfte.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Das Protokoll beschreibt den gezielten Knockdown der Genexpression im Zebrafisch durch Morpholino-Injektion in den Schwanz.

Morpholino-Injektion: Eine Methode zur Unterdrückung der Zielgenexpression zur Untersuchung der Funktion im Zebrafisch

Dieses Video beschreibt eine Technik der Embryo-Mikroinjektion, um Verbindungen in den Dottersack des Zebrafisches zu bringen.

Mikroinjektion von Embryonen: Eine Technik, um eine Verbindung in das Eigelb des Zebrafisches zu bringen

Hier präsentieren wir einen systematischen Ansatz für die Entwicklung physiologisch relevant, sensitive und...

In Vivo Modellierung des Morbid Human Genome mit Danio rerio

In diesem Artikel zeigen wir ein Verfahren zur Manipulation der Genexpression in den Zellen des ventrikulären erwachsenen Zebrafisch telencephalon Verwendung von Antisense-Morpholino-Oligonukleotide. Wir präsentieren diese Methode als eine effiziente und schnelle Protokoll, das für funktionelle Studien in der erwachsenen Gehirn von Wirbeltieren eingesetzt werden können.

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Ein anpassungsfähiges reversen genetischen Methode für Zebrafisch-Gen-Funktion während der späteren Phasen der Entwicklung und physiologischen Homöostase wie Geweberegeneration unter Verwendung intraventrikuläre Injektion von Gen-spezifischen morpholinos beurteilen.

Rückwärts Genetische Morpholino Ansatz mit Herz ventrikuläre Injektion auf mehrere Schwer zu Zielgeweben in der Zebrafisch-Larve Transfektion

In diesem Video zeigt Nijole Jasinskiene der angewandten Methode, um transgene Aedes aegypti Mücken, die Überträger für Dengue-Fieber sind zu generieren. Die Techniken für die richtige Vorbereitung Mikroinjektion Nadeln, Entfeuchtungsmittel Embryonen, und die Durchführung der Mikroinjektion werden aufgezeigt.

Mikroinjektion von A. aegypti Embryonen, um transgene Moskitos erhalten

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafischembryonen für langfristige Bildgebung, Zwei-Photonen-Imaging-und Gewebe-Schaden Techniken und Zeitraffer-konfokale Bildgebung.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Erfahren Sie die Mikroinjektionstechnik für mRNA-Überexpression und Morpholino-vermittelten Gen-Knockdown in Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht präzise genetische Manipulationen in der Entwicklungsbiologie.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

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