Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

Männliche und weibliche Zebrafische werden in einem Brutkäfig gepaart, wobei befruchtete Eier auf den Boden fallen, wo sie leicht gesammelt werden können. Anschließend werden die Eier in einer Petrischale an einem Objektträger ausgerichtet. Danach wird die beladene Injektionsnadel abgeschnitten und die Injektionseinstellungen werden angepasst, sodass das Injektionsbolus eine gewünschte Größe aufweist, wenn es mit einem Mikrometer gemessen wird.

Schließlich werden die Eier nacheinander einzeln injiziert. Hallo, ich bin Jonathan Rosen aus dem Labor von John MA in der Abteilung für Kardiologie im Bostoner Kinderkrankenhaus. Und ich bin Michael Sweeney, ebenfalls im VY-Labor.

Heute werden wir demonstrieren, wie mRNA oder Morpholino in Zebrafischembryonen injiziert werden kann. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Auswirkungen einer Herunterregulation oder Überexpression bestimmter Genprodukte zu untersuchen. Beginnen wir also.

Zunächst müssen die Fische und die Zuchtbecken bereits am Abend vor der Injektion mit eingebauten Trennwänden vorbereitet werden, um die Gesamteiproduktion zu erhöhen. Falls gewünscht, können die Fische im Verhältnis von zwei Weibchen auf ein Männchen zusammengestellt werden. Am nächsten Morgen, nachdem das Raumlicht eingeschaltet wurde, ziehen Sie die Trennwände aus mehreren Becken heraus und gewähren Sie etwa 20 Minuten ungestörter Paarungszeit. Sammeln Sie mithilfe eines Siebs die Eier aus den Zuchtkäfigen, spülen Sie sie mit Ei-Wasser ab und gießen Sie sie anschließend in eine Petrischale.

Mit Ei-Wasser können die Fische in größeren Tanks neu gruppiert werden, um zusätzliche Eierchargen für die Injektion zu erhalten. Passen Sie den Zeitpunkt der Eiersammlung so an, dass die maximale Anzahl an Eiern produziert wird, ohne dass sie das Einzelzellstadium überschreiten. Legen Sie abschließend einen Objektträger in den umgedrehten Deckel einer 100 Millimeter Petrischale.

Verwenden Sie eine Transferpipette, um die Eier entlang der Seite des Objektträgers in einer einzelnen Spalte auszurichten, und entfernen Sie anschließend das überschüssige Ei-Wasser, indem Sie ein Kim-Tuch an der gegenüberliegenden Seite des Objektträgers anlegen. Danach bereiten wir die Mikroinjektionsnadeln mit einem Mikropipettenzug vor. Wir ziehen eine Glas-Kapillare mit einem Außendurchmesser von einem Millimeter zu zwei Nadeln auseinander und lagern diese Nadeln in einer 150-Millimeter-Petri-Schale. Indem wir sie über Rampen aus Knetmasse legen, können die Nadeln im Voraus gezogen werden.

Wir verwenden die folgenden Einstellungen. Hitze 6 45 Pol 60 Geschwindigkeit 80. Beladen Sie das breite Ende der Nadel mit drei Mikrolitern Injektionsmaterial unter Verwendung einer Mikrolader-Pipette.

Schütteln Sie den Bolus in Richtung der Nadelspitze, bis nur noch wenige oder keine Bläschen mehr übrig sind. Als Nächstes schalten wir die Luftzufuhr und den Mikroinjektor ein. Führen Sie die Nadel in den Mikroinjektor ein und stellen Sie sicher, dass sie im Gehäuse dicht abschließt.

Überprüfen Sie, ob der Mikromanipulator in einer geeigneten Position ist, um einen weiten Bewegungs- und Einstellbereich zu ermöglichen. Bringen Sie die Nadelspitze in die Fokusebene des Mikroskops ein. Heben Sie sie weit vom Objekttisch an und fokussieren Sie auf den dünnsten Bereich der Spitze.

Verwenden Sie ein Paar scharfer Pinzetten, um die Nadel an einer Stelle abzuknipsen, an der die Nadel schmal genug bleibt, um die Chorionhaut und die Eigelbmasse zu durchdringen, aber dennoch in der Lage ist, eine gleichmäßige Tröpfchengröße abzugeben. Um das Volumen jeder Injektion zu berechnen, bringen wir einen Tropfen Mineralöl auf ein Messmikrometer auf, führen die Nadel in das Öl ein und betätigen das Fußpedal, um eine Tröpfchenlösung in das Öl zu injizieren. Überwachen Sie die Größe des Tröpfchens, während Sie die Nadel kürzen und den Injektionsdruck anpassen, falls erforderlich, wenn in das Öl injiziert wird.

Ein Kügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 Millimeter enthält 500 Pikroliter Injektionsmaterial. Üblicherweise werden Injektionsvolumina von 500 Pikrolitern oder einem Nanoliter verwendet. Ideale Injektionsvolumina füllen etwa 10 % des Eivolumens aus.

Die Qualität der Nadelspitze ist entscheidend sowohl für die Leichtigkeit der Injektion als auch für die Qualität und Konsistenz der Ergebnisse. Nun ist es an der Zeit, mit der Injektion zu beginnen. Stellen Sie sicher, dass sich die Embryonen nicht über das Vierzellstadium hinaus entwickelt haben.

Im Idealfall sollte sich das Embryo im Ein-Zell-Stadium befinden. Senken Sie danach die Nadel in Richtung der Eiersäule ab, durchstechen Sie in einer flüssigen Bewegung unter Beobachtung die Oberfläche des Chorions und dringen Sie in das Eigelb ein. Sollte die Eigelbhaut zerquetscht oder zerrissen werden, injizieren Sie das Injektionsmaterial in das Eigelb.

Vermeiden Sie das Einspritzen von Luftblasen und achten Sie auf Embryonen, die während des Injektionsvorgangs sichtbar beschädigt werden. Stellen Sie den Druck bei Bedarf so ein, dass eine gleichmäßige Tröpfchengröße beibehalten wird, und entfernen Sie mit einer Pipettenspitze Eier, die unbefruchtet erscheinen oder während des Injektionsvorgangs zerstört wurden. Nachdem eine Reihe Eier injiziert wurde, spülen Sie die injizierten Eier mit einem sanften Strom von Ei-Wasser in eine saubere Petrischale und wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf.

Behalten Sie mehrere nicht injizierte Embryonen als Kontrolle bei. Entfernen Sie später am ersten Tag tote Embryonen und notieren Sie die Anzahl der injizierten Embryonen. Ersetzen Sie das Ei-Wasser in der Petrischale regelmäßig, um die Gefahr einer Infektion zu verringern.

Beachten Sie, dass die Embryonen je nach Art der Injektion eine geringere Überlebensrate aufweisen können als ihre nicht injizierten Geschwister. Zum Glück ist es einfach, eine große Anzahl von ihnen zu injizieren, sodass dies selten ein Problem darstellt. Nun zeigen wir einige repräsentative Ergebnisse sowohl der Morpholinoinjektion als auch der mRNA-Injektion.

Der unbehandelte injizierte Kontrollstamm 48 Stunden nach der Befruchtung sieht normal aus, wie erwartet. Allerdings weisen Embryonen, die mit dem Morpholino HG E drei i drei eeg FFR eins injiziert wurden, das die HG-Isoformen herunterreguliert, welche die erste von zwei EEG-ähnlichen Wiederholungen enthalten, Hirnödeme und Herzinsuffizienz auf. Mr.NA verursachte ebenfalls ein offensichtliches Phänotyp 24 Stunden nach der Befruchtung.

Die Köpfe der uninjizierten Kontrollen sahen normal aus. Umgekehrt weisen einige der mit M NNA injizierten Embryonen Opia auf. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie die Injektion von Morpholinos oder mRNA während des Ein-Zell-Stadiums die Expression spezifischer Gene in der späteren Entwicklung erhöhen oder verringern kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, auch dies zu beachten.

Eine hohe Konzentration entweder von mRNA oder Morpholino kann eine unspezifische Letalität in den Embryonen mit dem Morpholino verursachen. Jede dieser Konzentrationen muss empirisch getestet werden, aber typischerweise liegen die Konzentrationen zwischen 200 und 500 Mikromolar, um die Genaktivität spezifisch zu reduzieren, ohne eine allgemeine Letalität hervorzurufen. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.