Name: Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Lernen Sie die Mikroinjektion von mRNA oder Morpholino in Einzellstadien von Danio rerio Embryonen. Diese Methode ermöglicht Knockdown- und Überexpressionsexperimente zur Analyse von Genfunktionen in vivo.

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Wir erkennen die Mitglieder des Mably Labor und Narie Storer für ihre technische Unterstützung, und die American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 0635363N) und dem National Heart, Lung, and Blood Institute (Grant SCCOR RFA HL02-027) für die Finanzierung.

Teil 1: Egg Produktion und Sammlung <ol><li> Die Nacht vor der Injektion, richten Sie den Fisch in Zuchtbecken mit Trennwänden in Platz. Zur Erhöhung der Gesamtzahl der Eierproduktion, können die Fische in einem Verhältnis von zwei Frauen eingestellt werden, um ein Männchen, falls gewünscht. </li><li> Am nächsten Morgen, nach der Raumbeleuchtung eingeschaltet, ziehen Sie den Teilern von mehreren Tanks und damit für etwa 20 Minuten ungestört Paarungszeit. </li><li> Mit einem Sieb, sammeln die Eier aus der Zucht Käfige und spülen Sie sie mit Ei Wasser. Gießen Sie die Eier in einer Petrischale mit Ei Wasser und entfernen unbefruchteten Eiern und Schmutz mit einem Transfer-Pipette. Fische können in größeren Tanks zusammengefasst werden, um zusätzliche Runden von Eiern für die Injektion zu produzieren. Passen Sie den Zeitpunkt der Entnahme der Eizellen, um eine maximale Anzahl von Eiern, ohne dass sie passieren die einzelnen Zell-Stadium hergestellt werden können. </li><li> Legen Sie einen Objektträger in der umgekehrten Deckel eines 100mm Petrischale. Verwenden Sie einen Transferpipette antreten die Eier gegen die Seite des Schiebers bilden eine einzelne Spalte. Entfernen Sie überschüssiges Wasser aus dem Ei gleiten durch Drücken einer Kimwipe gegen die gegenüberliegende Seite der Eier. (Abbildung 1A) </li></ol> Teil 2: Nadel ziehen, Lade-und Vorbereitung <ol><li> Mit einer Mikropipette Abzieher, ziehen Sie einen 1,0 mm OD Glaskapillare in zwei Nadeln und an einem 150mm Petrischale indem über Silly Putty Rampen. Needles kann im Voraus gezogen werden. </li><li> Backload die Nadel mit 3 ul von Injektionsmaterial mit einem Microloader Pipette. Schütteln Sie die Bolus in Richtung der Nadelspitze bis es wenige oder gar keine Blasen mehr vorhanden sind. </li><li> Schalten Sie die Luftquelle und Mikroinjektor. Legen Sie die Nadel in die Mikroinjektor und versichern eine gute Abdichtung innerhalb des Gehäuses. Prüfen Sie, ob der Mikromanipulator in eine geeignete Position, um für eine breite Palette von Bewegung und Anpassung zu ermöglichen. Bringen Sie die Nadelspitze in die Ebene der Sicht des Mikroskops, hoch über der Bühne, und konzentrieren sich auf die dünnste Bereich der Spitze. Verwenden Sie ein Paar scharfe Zange kneifen Sie die Nadel an einem Punkt, der die Nadel schmal genug zu durchdringen das Chorion und Dotter, aber immer noch der Lage, eine konsistente Perlgröße Blätter. Ein Tropfen Mineralöl auf einem Mikrometer können verwendet werden, um die Lautstärke der einzelnen Injektion zu berechnen. Wenn in das Öl eingespritzt wird, enthält eine Perle mit einem Durchmesser von 0,1 mm 500 pL von Injektionsmaterial (Abbildung 1B); Injektionsvolumina von 500 pL oder 1nL werden üblicherweise verwendet. Drücken Sie das Fußpedal und überwachen die Größe der Raupe beim Trimmen der Nadel und die Anpassung der Einspritzdruck je nach Bedarf. Ideal Injektionsvolumina füllt ca. 10% des Eies Volumen. Die Qualität der Nadelspitze ist von entscheidender Bedeutung, um sowohl die einfache Injektion und die Qualität und Konsistenz der Ergebnisse. </li></ol> Teil 3: Injection <ol><li> Sicherstellen, dass die Embryonen nicht über die Vier-Zellen-Stadium entwickelt. Idealerweise sollte Embryonen im Ein-Zell-Stadium werden. </li><li> Senken Sie die Nadel auf die Spalte von Eiern, hält das Gericht an Stelle mit der anderen Hand. </li><li> Pierce die Oberfläche des Chorion und geben Sie das Eigelb in einem gleichmäßigen Lauf, während Sie für jede Brechen oder Reißen der Dottersacks. Spritzen Sie das Injektionsmaterial in den Dotter (Abbildung 1C). Vermeiden Sie die Injektion von Luftblasen oder Strecken der Dotter entweder kann tödlich sein, um den Embryo. Arbeiten auf der ganzen Linie, stellen Sie den Druck wie nötig, um eine konsistente Perle Größe und mit einer Pipettenspitze zu erhalten, entfernen Sie die Eier unbefruchtet schauen oder während der Injektion zerstört. </li><li> Nach Abschluss einer Säule von Eiern, mit einem sanften Strom von Ei-Wasser in den injizierten Eier in eine saubere Petrischale bewegen. Bei Bedarf wiederholen. Halten Sie mehrere injizierten Embryonen als Kontrolle. Am Ende des ersten Tages, entfernen abgestorbene Embryonen und notieren Sie die Anzahl der injizierten Embryonen. Ersetzen Sie das Ei Wasser in die Schüssel in regelmäßigen Abständen, um die Chance einer Infektion zu verringern. </li></ol> Teil 4: Repräsentative Ergebnisse Je nachdem, was wird gespritzt haben, kann Embryonen mit einer niedrigeren Rate als ihre injizierten Geschwister überleben. Glücklicherweise ist es einfach, eine große Anzahl von ihnen injizieren, so ist dies selten ein Problem. Es ist normal, morphants leicht verzögerte Entwicklung aufweisen können. Zur Veranschaulichung der Ergebnisse der Mikroinjektion, haben wir dieses Protokoll auf ein Niveau des Proteins Heart of Glass (HEG) zu manipulieren. Heg ist ein Transmembranprotein für normale Entwicklung des Herzens notwendig. In seiner Abwesenheit zu entwickeln Embryonen Herzen mit riesigen Zustrom Traktate und Kammern 1. Wir injizierten zwei bisher unbeschriebene Morpholinos gegen heg, heg_e3i3_egfr1 und heg_e4i4_egfr2, bei einer Konzentration von 500 uM. Bei 2 Tage nach der Befruchtung, werden die injizierten Geschwister steuert normal, wie erwartet (Abb. 2A und B). Embryonen mit heg_e3i3_egfr1 gespritzt haben Hirnödem (Abbildung 2C). Obwohl die Herzen der meisten dieser morphants Morphologie verändert haben, sind ihre Kammern normal dimensionierte (Abbildung 2D). Embryonen injiziertmit heg_e4i4_egfr2 weisen variable Herzfehler. Manche erscheinen normal, während andere große Zustrom Traktate und mäßig vergrößert Vorhöfen (Abb. 2E und F) haben. Die HEG-Mutante, wie zuvor 1 berichtet, hat eine enorm vergrößerte Einflusstrakt und Atrium (Abb. 2G-und H). Wir haben auch Wildtyp-Embryonen mit 400 ng / ul mRNA aus voller Länge heg cDNA umgeschrieben injiziert. Während injizierten Kontrollen normal entwickeln (Abb. 3A und B), Embryonen mit heg mRNA weisen ein Spektrum von Phänotypen von Wildtyp-Auftritt zu schweren Zyklopie injiziert, Verkürzung der Hauptteil Achse, Nekrose des Kopfes und des Körpers, und Spaltbildungen (Abbildung 3C und D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> Abbildung 1. Embryonen injiziert werden gegen einen Objektträger in eine Petrischale (A) gefüttert. Injektionsvolumen wird durch Injektion in Mineralöl auf einem Mikrometer platziert bestimmt. Ein Injektionsvolumen von 500 pL, die üblicherweise verwendet wird, hat einen Durchmesser von 0,1 mm (B). Unmittelbar nach der Injektion wird der Morpholino-oder mRNA sichtbar als punctuate Ort in den Dotter (C). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> Abbildung 2. Nach 2 Tagen nach der Befruchtung haben injizierten Embryonen keine grobe Mängel (A) oder Herz-Phänotyp (B). Embryonen mit dem Morpholino heg_e3i3_egfr1 gespritzt haben Hirnödem (C, Pfeil), aber in der Regel großen Herzkammern (D). Einige Embryonen mit dem Morpholino heg_e4i4_egfr2 gespritzt haben vergrößerten Zufluss Traktate und Vorhöfe (E, F). HEG-Mutanten eine stark vergrößerte Zufluss Traktate und Vorhöfe (G, H). (A), (C), (E) und (G) sind 4x DIC Bilder; (B), (D), (F) und (H) sind 20x DIC Bilder. a = Atrium, it = Einflusstrakt. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> Abbildung 3. Nach 24 Stunden nach der Befruchtung, nicht injizierten Embryonen haben einen langen, geraden Körper ohne Nekrose oder Spaltbildungen (A) und zwei klar definierte Augen mit einem Neuralrohr zwischen ihnen (B). Einige Embryonen mit heg mRNA injiziert, zeigen dagegen eine verkürzte Körperachse, Nekrose, deformierte Somiten (C), und Zyklopie (D). (A) und (C) sind 4x DIC Bilder; (B) und (D) sind 20x DIC Bilder.

<ol><li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li>
</ol>

Eine der Stärken des Zebrafisch-Modell ist die Leichtigkeit, mit der bestimmte Genprodukte hinzugefügt werden können oder eliminiert aus dem Embryo durch Mikroinjektion. Um ubiquitär überexprimieren ein bestimmtes Protein, das mRNA ist es in den Dotter an der 1-Zell-Stadium injiziert. Während des Embryos weitere Entwicklung wird die RNA in der gesamten Organismus verteilt und übersetzt. Umgekehrt an ein bestimmtes Protein zu beseitigen, sind Morpholinos verwendet. Morpholinos werden synthetische Oligonukleotide mit Antisense-Komplementarität auf bestimmte RNAs konzipiert. Wie mRNAs sind Morpholinos in den Dotter an der 1-Zell-Stadium injiziert. Im Inneren des Embryos binden sie ihre Ziel-RNAs, die Verhütung Übersetzung. Die wichtigste Änderung, die für jede Morpholino-oder mRNA vorgenommen werden muss, ist die Konzentration des injizierten Materials. Eine zu hohe Konzentration von entweder Morpholino-oder mRNA kann unspezifische Toxizität, während jeder Morpholino muss empirisch überprüft werden, um seine optimale Konzentration, in der Regel Morpholino-Konzentrationen zwischen 200 um und 500 um festzustellen, knock down Genaktivität effektiv, ohne dass nicht-spezifische Defekte. Die genaue Größe der Nadel Öffnung ist nicht entscheidend. Innerhalb eines Bereichs von Nadelgrößen, Einspritzdruck und Einspritzzeitpunkt können angepasst werden, um ein Bolus von der richtigen Lautstärke zu produzieren. Morpholinos haben viele Anwendungen, einschließlich der funktionalen Zerlegung der Domänen innerhalb eines Proteins. Wenn entwickelt, um spezifische Exon-Intron-Übergänge Ziel wird Morpholinos Spleißen von dort vorkommenden verhindern. Wir untersuchten die Auswirkungen von zwei Morpholinos binden Exon-Intron-Übergänge in der prä-mRNA von heg. Der Morpholino heg_e3i3_egfr1 bindet die Verbindung zwischen Exon 3 und Intron 3, verhindert das Spleißen Maschinen aus Einbeziehung Exon 3 zu reifen Transkripte. Der Morpholino heg_e4i4_egfr2 ähnlich entfernt Exon 4. Beide Exons 3 und 4 kodieren Domains mit EGF-ähnliche Wiederholungen. Einige Embryonen mit heg_e4i4_egfr2 mäßig Phänokopie der Mutante injiziert; weitere Experimente erforderlich, um die Rolle der Heg Exon 4 in die Entwicklung des Herzens zu verstehen. Überraschenderweise wurden Embryonen mit heg_e3i3_egfr1 injiziert Hirnödem, ein Feature nicht in heg Mutanten zu sehen. Dies kann darauf zurückzuführen sein, die Fähigkeit der Morpholinos von Müttern Transkripte, die nicht betroffen sein würde in zygotischen Mutanten binden.

<table><tbody><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Werkzeug</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI 100</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Werkzeug</td><td>Narishige International</td><td>MN 153</td><td></td></tr><tr><td>Nadelextrahierer</td><td>Werkzeug</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P 97</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Kapillaren</td><td>Werkzeug</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100 F6</td><td></td></tr><tr><td>Mikrolader-Pipetten</td><td>Werkzeug</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>Werkzeug</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH310</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroinjektion von zebrafisch-embryos, um gene function analyze

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Einer der Vorteile eines Studiums Zebrafisch ist die Leichtigkeit und Schnelligkeit der Bearbeitung Protein-Spiegel in den Embryo. Morpholinos, die synthetische Oligonukleotide mit Antisense Komplementarität zur Ziel-RNAs sind, kann der Embryo hinzugefügt werden, um die Expression eines bestimmten Gens Produkt zu reduzieren. Umgekehrt können verarbeitet mRNA um den Embryo hinzugefügt werden, um Werte eines Gens zu erhöhen. Das Fahrzeug zum Hinzufügen entweder mRNA oder Morpholino, um einen Embryo ist die Mikroinjektion. Mikroinjektion ist eine effiziente und schnelle, sodass für die Injektion von Hunderten von Embryonen pro Stunde. Dieses Video zeigt alle Schritte in Mikroinjektion beteiligt. Kurz gesagt, werden Eier sofort nach der Verlegung gesammelt und gegen einen Objektträger in eine Petrischale ausgekleidet. Als nächstes wird ein spitzen Nadel mit Injektionsmaterial bestückt mit einem Mikroinjektor und eine Luftquelle verbunden, und die Mikroinjektor Bedienelemente sind angepasst, um eine wünschenswerte Injektionsvolumen zu produzieren. Schließlich wird die Nadel in die Embryos Eigelb getaucht und die Morpholino-oder mRNA ist ausgeschlossen.

Dieses Video zeigt, wie Morpholino-oder mRNA in Zebrafisch-Embryonen können bei der Ein-Zell-Stadium zu verringern oder zu erhöhen das Niveau der spezifischen Genprodukte bei der späteren Entwicklung injiziert werden.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

Einer der Vorteile bei der Untersuchung von Zebrabärblingen ist die Leichtigkeit und Geschwindigkeit, mit der Proteinspiegel im Embryo manipuliert werden können. Morpholinos, bei denen es sich um synthetische ...

Männliche und weibliche Zebrafische werden in einem Brutkäfig gepaart, wobei befruchtete Eier auf den Boden fallen, wo sie leicht gesammelt werden können. Anschließend werden die Eier in einer Petrischale an einem Objektträger ausgerichtet. Danach wird die beladene Injektionsnadel abgeschnitten und die Injektionseinstellungen werden angepasst, sodass das Injektionsbolus eine gewünschte Größe aufweist, wenn es mit einem Mikrometer gemessen wird.Schließlich werden die Eier nacheinander einzeln injiziert. Hallo, ich bin Jonathan Rosen aus dem Labor von John MA in der Abteilung für Kardiologie im Bostoner Kinderkrankenhaus. Und ich bin Michael Sweeney, ebenfalls im VY-Labor.Heute werden wir demonstrieren, wie mRNA oder Morpholino in Zebrafischembryonen injiziert werden kann. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Auswirkungen einer Herunterregulation oder Überexpression bestimmter Genprodukte zu untersuchen. Beginnen wir also.Zunächst müssen die Fische und die Zuchtbecken bereits am Abend vor der Injektion mit eingebauten Trennwänden vorbereitet werden, um die Gesamteiproduktion zu erhöhen. Falls gewünscht, können die Fische im Verhältnis von zwei Weibchen auf ein Männchen zusammengestellt werden. Am nächsten Morgen, nachdem das Raumlicht eingeschaltet wurde, ziehen Sie die Trennwände aus mehreren Becken heraus und gewähren Sie etwa 20 Minuten ungestörter Paarungszeit. Sammeln Sie mithilfe eines Siebs die Eier aus den Zuchtkäfigen, spülen Sie sie mit Ei-Wasser ab und gießen Sie sie anschließend in eine Petrischale.Mit Ei-Wasser können die Fische in größeren Tanks neu gruppiert werden, um zusätzliche Eierchargen für die Injektion zu erhalten. Passen Sie den Zeitpunkt der Eiersammlung so an, dass die maximale Anzahl an Eiern produziert wird, ohne dass sie das Einzelzellstadium überschreiten. Legen Sie abschließend einen Objektträger in den umgedrehten Deckel einer 100 Millimeter Petrischale.Verwenden Sie eine Transferpipette, um die Eier entlang der Seite des Objektträgers in einer einzelnen Spalte auszurichten, und entfernen Sie anschließend das überschüssige Ei-Wasser, indem Sie ein Kim-Tuch an der gegenüberliegenden Seite des Objektträgers anlegen. Danach bereiten wir die Mikroinjektionsnadeln mit einem Mikropipettenzug vor. Wir ziehen eine Glas-Kapillare mit einem Außendurchmesser von einem Millimeter zu zwei Nadeln auseinander und lagern diese Nadeln in einer 150-Millimeter-Petri-Schale. Indem wir sie über Rampen aus Knetmasse legen, können die Nadeln im Voraus gezogen werden.Wir verwenden die folgenden Einstellungen. Hitze 6 45 Pol 60 Geschwindigkeit 80. Beladen Sie das breite Ende der Nadel mit drei Mikrolitern Injektionsmaterial unter Verwendung einer Mikrolader-Pipette.Schütteln Sie den Bolus in Richtung der Nadelspitze, bis nur noch wenige oder keine Bläschen mehr übrig sind. Als Nächstes schalten wir die Luftzufuhr und den Mikroinjektor ein. Führen Sie die Nadel in den Mikroinjektor ein und stellen Sie sicher, dass sie im Gehäuse dicht abschließt.Überprüfen Sie, ob der Mikromanipulator in einer geeigneten Position ist, um einen weiten Bewegungs- und Einstellbereich zu ermöglichen. Bringen Sie die Nadelspitze in die Fokusebene des Mikroskops ein. Heben Sie sie weit vom Objekttisch an und fokussieren Sie auf den dünnsten Bereich der Spitze.Verwenden Sie ein Paar scharfer Pinzetten, um die Nadel an einer Stelle abzuknipsen, an der die Nadel schmal genug bleibt, um die Chorionhaut und die Eigelbmasse zu durchdringen, aber dennoch in der Lage ist, eine gleichmäßige Tröpfchengröße abzugeben. Um das Volumen jeder Injektion zu berechnen, bringen wir einen Tropfen Mineralöl auf ein Messmikrometer auf, führen die Nadel in das Öl ein und betätigen das Fußpedal, um eine Tröpfchenlösung in das Öl zu injizieren. Überwachen Sie die Größe des Tröpfchens, während Sie die Nadel kürzen und den Injektionsdruck anpassen, falls erforderlich, wenn in das Öl injiziert wird.Ein Kügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 Millimeter enthält 500 Pikroliter Injektionsmaterial. Üblicherweise werden Injektionsvolumina von 500 Pikrolitern oder einem Nanoliter verwendet. Ideale Injektionsvolumina füllen etwa 10 % des Eivolumens aus.Die Qualität der Nadelspitze ist entscheidend sowohl für die Leichtigkeit der Injektion als auch für die Qualität und Konsistenz der Ergebnisse. Nun ist es an der Zeit, mit der Injektion zu beginnen. Stellen Sie sicher, dass sich die Embryonen nicht über das Vierzellstadium hinaus entwickelt haben.Im Idealfall sollte sich das Embryo im Ein-Zell-Stadium befinden. Senken Sie danach die Nadel in Richtung der Eiersäule ab, durchstechen Sie in einer flüssigen Bewegung unter Beobachtung die Oberfläche des Chorions und dringen Sie in das Eigelb ein. Sollte die Eigelbhaut zerquetscht oder zerrissen werden, injizieren Sie das Injektionsmaterial in das Eigelb.Vermeiden Sie das Einspritzen von Luftblasen und achten Sie auf Embryonen, die während des Injektionsvorgangs sichtbar beschädigt werden. Stellen Sie den Druck bei Bedarf so ein, dass eine gleichmäßige Tröpfchengröße beibehalten wird, und entfernen Sie mit einer Pipettenspitze Eier, die unbefruchtet erscheinen oder während des Injektionsvorgangs zerstört wurden. Nachdem eine Reihe Eier injiziert wurde, spülen Sie die injizierten Eier mit einem sanften Strom von Ei-Wasser in eine saubere Petrischale und wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf.Behalten Sie mehrere nicht injizierte Embryonen als Kontrolle bei. Entfernen Sie später am ersten Tag tote Embryonen und notieren Sie die Anzahl der injizierten Embryonen. Ersetzen Sie das Ei-Wasser in der Petrischale regelmäßig, um die Gefahr einer Infektion zu verringern.Beachten Sie, dass die Embryonen je nach Art der Injektion eine geringere Überlebensrate aufweisen können als ihre nicht injizierten Geschwister. Zum Glück ist es einfach, eine große Anzahl von ihnen zu injizieren, sodass dies selten ein Problem darstellt. Nun zeigen wir einige repräsentative Ergebnisse sowohl der Morpholinoinjektion als auch der mRNA-Injektion.Der unbehandelte injizierte Kontrollstamm 48 Stunden nach der Befruchtung sieht normal aus, wie erwartet. Allerdings weisen Embryonen, die mit dem Morpholino HG E drei i drei eeg FFR eins injiziert wurden, das die HG-Isoformen herunterreguliert, welche die erste von zwei EEG-ähnlichen Wiederholungen enthalten, Hirnödeme und Herzinsuffizienz auf. Mr.NA verursachte ebenfalls ein offensichtliches Phänotyp 24 Stunden nach der Befruchtung.Die Köpfe der uninjizierten Kontrollen sahen normal aus. Umgekehrt weisen einige der mit M NNA injizierten Embryonen Opia auf. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie die Injektion von Morpholinos oder mRNA während des Ein-Zell-Stadiums die Expression spezifischer Gene in der späteren Entwicklung erhöhen oder verringern kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, auch dies zu beachten.Eine hohe Konzentration entweder von mRNA oder Morpholino kann eine unspezifische Letalität in den Embryonen mit dem Morpholino verursachen. Jede dieser Konzentrationen muss empirisch getestet werden, aber typischerweise liegen die Konzentrationen zwischen 200 und 500 Mikromolar, um die Genaktivität spezifisch zu reduzieren, ohne eine allgemeine Letalität hervorzurufen. Das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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