Name: Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Lernen Sie die Isolation menschlicher Pankreasinselzellen mit automatisiertem Perfusionsverfahren und Kollagenasen-Verdauung. Diese Methode liefert hochwertige Inseln für die Transplantation bei Diabetes.

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Unterstützt durch Mittel aus dem University of Illinois at Chicago sowie Inselzell Resource Center NIH (RFA-RR 05 bis 003), der Christopher-Stiftung, die Efroymson Foundation, und die Tellabs-Stiftung.

1. Facility-Setup <ol><li> Menschliche Insel Isolation ist ein zeitkritischer Vorgang, dass Teamarbeit beinhaltet, und damit vier Personen werden benötigt, um dieses Verfahren durchzuführen. Das Team wird von den Chirurgen, wer und seziert cannulates der Bauchspeicheldrüse. </li><li> Das Inselchen Isolation beginnt die Minute das Team in die UIC Insel absperrbar. Team-Mitglieder zu gewährleisten, dass alle notwendigen Instrumente, wie die Zentrifuge, wird geprüft und eingeschaltet ist. Sie machen auch sicher, dass alle Hauben und Flächen desinfizieren. </li><li> Zwei Personen richtet die Kanülierung Tisch, Matsch-Maschine, die Verdauung Schaltung, Perfusion Einheit, COBE Reinigung Maschine und OP-Tische. </li><li> Gleichzeitig werden zwei weitere Team-Mitglieder bereiten die Medien, die bei der Isolierung benötigt wird. </li><li> Als nächstes werden die Bakteriologie Röhrchen (Flaschen, Rohre, Form und Tasche), die Probenahme-Röhrchen (mit Wasch-Fertigspritze) und Beurteilung Rohren und Platten hergestellt. </li><li> Bereiten Sie die Reinigung Rohr wie folgt festgelegt: Der 1. Tube leer und markierte bei 150 ml, Röhrchen 2-12 Jahren mit 200 ml M199 Medium mit humanem Albumin (Waschlösung) ergänzt gefüllt und markierte bei 230 ml, und schließlich eine 50 ml konischen Rohr gefüllt mit 50 ml Waschlösung. Sobald diese vorbereitenden Schritte abgeschlossen sind wir bereit sind, beginnt die Vorbereitung und Perfusion des Pankreas. </li></ol> 2. Pancreas Vorbereitung und Perfusion <ol><li> Zu Beginn der Zubereitung und Perfusion des Pankreas entfernt ein Bediener die Orgel aus der Verpackung mit sterilem Technik. Der Chirurg wird in der Bauchspeicheldrüse die Dekontamination Tabelle zu übertragen. </li><li> Der Chirurg wird eine 60 ml Spritze mit der ursprünglichen Bauchspeicheldrüse Konservierungslösung und geben es an einen Betreiber, die es benutzen werden, um vorbereitet &quot;Procurement&quot; Bakteriologie Flaschen füllen zu füllen. </li><li> Nach einer Sichtkontrolle zu prüfen, ob die Orgel geeignet für kleine Insel-Isolierung (Wenn die Bauchspeicheldrüse bei der Beschaffung beschädigt oder anatomisch abnormal, sie dürfen nicht für Insel Isolierung verwendet werden), wird der Chirurg bitten, die Kollagenase vorzubereiten. Denken Sie daran, dass Resuspension Zeit zwischen verschiedenen Enzym Marken und viel variiert. </li><li> Wenn der Chirurg fertig ist, bringen die Dekontaminationslösungen (Betadine, Fungizone / Cefazolin und HBSS), die Dekontamination Tisch und gießt sie in die entsprechenden Container. Chirurg führt Bauchspeicheldrüse Dekontamination Waschen für eine Minute der Bauchspeicheldrüse in jedem der Dekontaminationslösung. Die Bauchspeicheldrüse ist dann in einem kleinen sterilen Glas, in dem sie gewogen werden gestellt. Nach dem Gewicht in die Batch eingetragen ist, ist die Bauchspeicheldrüse in die Kanülierung Pfanne mit etwas Erhaltung Lösung gegeben. </li><li> Der Chirurg wird ausgesetzt und teilweise incise den Hauptkanal und kanülieren jeweils die Hälfte der Bauchspeicheldrüse mit einer Kanüle. Die Kanüle wird durch Naht gesichert werden. Um perfuse der Bauchspeicheldrüse, bewegen sie die Durchblutung Einheit und gießen Sie die Enzymlösung in das Becken. Insgesamt Perfusion beträgt ca. 10 Minuten, bei 80 mmHg für 5 Minuten, dann bei 180 mmHg für 5 Minuten. Pancreas aufgetrieben nach Perfusion. </li><li> Bewegen Sie den perfundierten Pankreas der Kanülierung pan, wo das Fettgewebe aus der Bauchspeicheldrüse getrimmt wird sorgfältig. Dann schneiden Sie die Pankreas in 10-12 Stück und Transfer zum Ricordi Kammer für die Verdauung. </li></ol> 3. Pankreas Verdauung <ol><li> Zu Beginn der Verdauung Schritt übertragen die Bauchspeicheldrüse an, die leeren Ricordi Kammer, fügen Sie eine 2,5 ml-Fläschchen von Pulmozyme, auf dem Bildschirm put (Vermeidung großes Stück Gewebe Block der Kammer), in der Nähe der Kammer, und füllen Sie das System. </li><li> Starten Sie pumpt die Lösung für 5 Minuten. Schütteln Sie die Kammer gleichmäßig verteilen warme Lösung über. Nach fünf Minuten schütteln die Kammer für die gesamte Verdauung Phase. Pflegen Sie die Temperatur bei 37 ˚ C. </li><li> Rock the Kammer leicht, bis die Temperatur erreicht 37 °, dann schütteln die Kammer. Nehmen Sie eine Probe alle zwei Minuten und erkennen, ob freie Inselchen in den Anwendungsbereich zu finden sind. Notieren Sie sich den Inselzellen Evaluation Informationen bei der Verdauung Tisch des Chargenprotokolls. Fahren Sie mit dem Prozentsatz der Inseln überwachen, bis es 50% von ihnen frei schwebend und isoliert in der Lösung sind. </li></ol> 4. Tissue-Sammlung <ol><li> Sobald 50% der Inseln zu finden sind kostenlos in den Proben, die Verdauung durch Zugabe von kaltem RPMI Verdünnungslösung in den Kreis gestoppt. Das Gewebe wird in 500 ml konische Röhrchen mit 30 ml Humanalbumin vorgefüllten gesammelt. Nachdem die Rohre sind gesponnen, Absaugen des Überstandes und Waschen des Pellets mit kalter Waschlösung. Drehen Sie das konische Röhrchen bei 1100 RPM (Umdrehungen pro Minute) für 1 Minute, 4 ˚ C. </li><li> Kombinieren Sie alle Sammelröhrchen mit verdaut Pankreasgewebe in einer Einzeldosis von 500 ml konische ausgesetzt. Wenn ein Rohr voller gewaschen Gewebe, Spin und wiederholen Sie den Waschvorgang bis alle Gewebe hat mehrfach gewaschen worden. Spin dieses Rohr und den Transfer des Gewebes in einem 250 ml konischen Rohr. Bringen Sie das Volumen bis zu 250 ml mitM199 Waschlösung mit HA ergänzt und vorbereitet für die Probenahme. </li><li> Nehmen Sie eine 1 ml Probe mit einer Pipette und hinzufügen, um eine 15 ml konische Röhrchen mit 9 ml Waschlösung vorgefüllt. Dann durch vorsichtiges Umdrehen des 15 ml konischen Rohr und aus dieser Mischung, Probe aus 1 ml direkt in ein Raster Zählschale. Zählen Sie die Zellen, und berechnen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Verdünnungsfaktor von 2500 (10x250). </li><li> Drehen Sie das 250 ml konischen Rohr, und fügen Sie 150 ml UW (University of Wisconsin)-Lösung, die normalerweise für die Organkonservierung verwenden. Wenn UW hinzugefügt wird, mischen die Zellsuspension gründlich mit der Pipette. Record und kommunizieren, um die Reinigung Betreiber der Startzeit in UW. Verlassen Sie die Röhre (n) auf Eis und Strudel gelegentlich. Jetzt den Inseln kann weiter gereinigt werden. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).</li>
<li>Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+and+isolation+variables+predicting+human+islet+isolation+success%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor and isolation variables predicting human islet isolation success.</a> Transplantation. 85, 950-955 (2008).</li>
<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+human+islet+of+Langerhans+isolation+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields.</a> Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).</li>
</ol>

Es gibt eine Vielzahl von Faktoren, die die Isolierung Ergebnis 9,10. Unter ihnen spielt die Verdauung der Pankreasgewebe eine herausragende Rolle. Basierend auf unserer eigenen menschlichen Inselzellen isoliert Erfahrung, fassen wir folgende kritische Punkte, die potenziell beeinflussen könnten das Inselchen Ertrag und Qualität. <ol><li> Die Verdauung ist unterschiedlich, wenn verschiedene Arten von Enzymen genutzt werden. </li><li> Sobald 40-50% der Inseln komplett aus acinärem Gewebe getrennt, sollte die Verdauun...

<table><tbody><tr><td>Eisschlamm-Maschine</td><td>Gerät</td><td>Taylor Company</td><td>K4036546</td><td>steriles Eis herstellen</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Gerät</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>MZ6 Invertiertes Mikroskop TLBD4.1</td><td>Gerät</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale mit 2-mm-Raster</td><td>Gerät</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>Bestimmung der Inselzellanzahl</td></tr><tr><td>Digitaler Wasserbad EX7</td><td>Gerät</td><td>NesLab</td><td>105361058</td><td></td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Gerät</td><td>IBI:IR</td><td>60444</td><td></td></tr><tr><td>MonoBloc-Waage AB 104-S</td><td>Gerät</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119430864</td><td>Pankreasgewicht messen</td></tr><tr><td>MasterFlex II Drehzahlregler</td><td>Gerät</td><td>Cole-Parmer</td><td>J00006445</td><td>Fließgeschwindigkeit während der Digestion einstellen</td></tr><tr><td>Digital Sight DS L1</td><td>Gerät</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionsanlage</td><td>Gerät</td><td>Individuell angefertigt</td><td>n/v</td><td></td></tr><tr><td>Kühlvorrichtung für Perfusionsanlage</td><td>Gerät</td><td>Fisher Scientific</td><td>3013P</td><td></td></tr><tr><td>Ricordi-Kammer</td><td>Gerät</td><td>University of Miami</td><td>n/v</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-Verdünnungslösung</td><td>Reagenz</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99783024</td><td></td></tr><tr><td>University of Wisconsin (UW)-Lösung</td><td>Reagenz</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s gepufferte Salzlösung (HBSS)</td><td>Reagenz</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>25 % menschliches Albumin</td><td>Reagenz</td><td>GRIFOLS</td><td>NDC 61953-0002-2</td><td></td></tr><tr><td>M199-Medium (Spüllösung)</td><td>Reagenz</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase NB1 GMP-Grad</td><td>Reagenz</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002937</td><td></td></tr><tr><td>Neutrale Protease NB1 GMP-Grad</td><td>Reagenz</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002936</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Reagenz</td><td>Cardinal Health</td><td>29906-004</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolin</td><td>Reagenz</td><td>West-Ward Pharmaceutical</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>Dithizon</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

menschliche inselzellen der bauchspeicheldrüse isolation: part i: verdauung und sammlung von pankreasgewebe

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management von Typ 1 Diabetes ist belastend, sowohl für den Einzelnen und die Gesellschaft, im Wert von über 100 Milliarden Dollar jährlich. Trotz der weit verbreiteten Verwendung von Glukose-Monitoring und neue Insulin-Formulierungen, viele Menschen immer noch zu entwickeln verheerenden Folgekomplikationen. Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Transplantation kann bei normalen Blutzuckerspiegels bei Diabetes-Patienten wiederherstellen<sup&gt; 1</sup&gt;, Ohne das Risiko schwerer Hypoglykämien, die mit einer intensivierten Insulintherapie assoziiert sind. Die ausreichende Insel Masse ist für eine erfolgreiche Inseltransplantation wichtig. Allerdings wirken sich Spender charakteristischen, Orgel Beschaffung und Erhaltung der Isolation Ergebnis<sup&gt; 2</sup&gt;. An der University of Illinois at Chicago (UIC) haben wir eine erfolgreiche Isolierung Protokoll mit einer verbesserten Reinigung Gradienten entwickelt<sup&gt; 3</sup&gt;. Das Programm startete im Januar 2004, und mehr als 300 Isolierungen wurden bis November 2008 durchgeführt. Der Bauchspeicheldrüsen wurden in kaltem Konservierungslösungen geschickt (UW, University of Wisconsin-oder HTK, Histidin-Tryptophan Ketoglutarat)<sup&gt; 4-7</sup&gt; Zu den Cell Isolation Laboratory an UIC für Inselzellen isoliert. Langerhans-Inseln wurden isoliert mit der UIC-Methode, die eine modifizierte Version der Methode ursprünglich von Ricordi beschrieben wird<em&gt; Et al</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. Kurz gesagt, nach der Reinigung der Bauchspeicheldrüse aus dem umgebenden Gewebe wurde mit Enzym-Lösung (Serva Collagenase + Neutral Protease oder Sigma V Enzym) perfundiert. Die aufgetrieben Pankreas wurde dann auf die Verdauung Ricordi Kammer übertragen, verbunden mit einer modifizierten, geschlossenen Kreislauf Schlauchsystem und erwärmt auf 37 ° C. Während der Verdauung wurde die Kammer leicht geschüttelt. Die Proben wurden kontinuierlich die Verdauung Fortschritt zu überwachen genommen. Einmal frei Inseln unter dem Mikroskop erkannt wurden, die Verdauung wurde durch Spülen kalt gestoppt (4 ° C) RPMI Verdünnungslösung (Mediatech, Herndon, VA) in den Kreislauf, um das Enzym zu verdünnen. Nach gesammelt und gewaschen in M199 Medien mit Humanalbumin ergänzt wurde das Gewebe für die Vorreinigung zählen abgetastet und inkubiert mit UW-Lösung vor der Reinigung. Reinigung und Kultur der Menschenrechte Islets: Reinigung Prozess wird in Teil II beschrieben werden.

Das Erreichen hoher Qualität und ausreichender Menge menschlicher Inselchen ist einer der führenden Voraussetzungen für eine erfolgreiche Inseltransplantation. In diesem Video, beschreiben wir Schritt für Schritt die Verfahren für die menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation (Teil I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe) mit einem modifizierten automatisierte Methode.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe

Das Management von Typ-1-Diabetes ist sowohl für den Einzelnen als auch für die Gesellschaft belastend und verursacht jährlich Kosten von über 100 Milliarden Dollar. Trotz des weit verbreiteten Einsatzes von ...

Dieses Verfahren beginnt mit der Gewinnung von normalem Pankreasgewebe von Spendern. Nach einem kurzen Beschneideschritt wird das aufgeblähte Pankreas in gleichmäßige Stücke geschnitten und in die Verdauungskammer überführt. Das Pankreas wird kanüliert, und eine Kollagenase-Lösung wird über die Kanüle mittels einer automatisierten Perfusionsmaschine zugeführt.Schließlich wird das Pankreasgewebe in großen, kegelförmigen Röhrchen gesammelt und anschließend weiter für die Inseltransplantation aufgereinigt, was in einem späteren Video gezeigt wird. Hallo, ich bin American Chief aus dem Labor des Humanen Inselprogramms der Abteilung für Chirurgie an der University of Illinois in Chicago. Hallo, mein Name ist Barbara Barbero und ich bin ebenfalls beim Humanen Inselprogramm tätig.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolation menschlicher Pankreasinseln. Wir verwenden dieses Verfahren in unserer Einrichtung, um hochwertige menschliche Inseln für den klinischen Einsatz zu gewinnen. Beginnen wir.Die Isolierung menschlicher Inseln ist ein zeitaufwändiges Verfahren, das Teamarbeit erfordert, weshalb vier Personen notwendig sind, um diesen Vorgang durchzuführen. Das Team wird von einem Chirurgen geleitet, der die Bauchspeicheldrüse disseziert und katheterisiert. Die Inselisolation beginnt unmittelbar, sobald das Team die UIC-Einrichtung zur Inselisolation betritt.Die Teammitglieder stellen sicher, dass alle erforderlichen Geräte, wie die Zentrifuge, überprüft und eingeschaltet werden. Sie desinfizieren zudem alle Sicherheitswerkbänke und Oberflächen. Zwei Personen richten den Kanülierungstisch, die Schneemischmaschine für die Verdauung, die Kreislaufperfusion, die Reinigungsmaschine für die Einheit, sowie die chirurgischen Tische ein.Gleichzeitig bereiten zwei weitere Teammitglieder das während der Isolierung benötigte Medium vor. Anschließend werden Bakteriologie-Röhrchen, Probenröhrchen sowie Beurteilungs-Röhrchen und -platten vorbereitet. Bereiten Sie den Satz zur Reinigung wie folgt vor: das erste Röhrchen leer lassen und bei 150 Milliliter markieren.Röhrchen zwei bis zwölf mit 200 Milliliter M199-Medium, ergänzt mit humanem Albumin oder Waschlösung, gefüllt und bis zur Marke von 230 Milliliter gekennzeichnet. Und schließlich ein 50-Milliliter-Konischglas, gefüllt mit 50 Milliliter Waschlösung.Nach Abschluss dieser Vorbereitungsschritte sind wir bereit, mit der Vorbereitung und Perfusion der Bauchspeicheldrüse zu beginnen. Um die Vorbereitung und Perfusion der Bauchspeicheldrüse einzuleiten, entnimmt ein Bediener das Organ der Verpackung. Unter Einhaltung steriler Technik überträgt der Chirurg die Bauchspeicheldrüse auf den Dekontaminationstisch.Der Chirurg füllt eine 60-cc-Spritze mit der ursprünglichen Pankreaserhaltungslösung und übergibt sie einem Bediener, der damit vorbereitete bakteriologische Abnahmefläschchen befüllt. Nach einer visuellen Inspektion zur Beurteilung der Eignung des Organs für die Inselzellisolierung bittet der Chirurg einen Bediener, Kollagenase für den heutigen Tag vorzubereiten. Vorbereiten ist ein vollständiger Akt.Wenn die Bauchspeicheldrüse während der Gewinnung beschädigt wird oder anatomisch abnormal ist, kann sie nicht für die Inselzellisolierung verwendet werden. Beachten Sie, dass die Resus-Suspensionszeit je nach Enzymmarke und Charge variiert. Wenn der Chirurg bereit ist, bringen Sie die Dekontaminationslösungen zum Dekontaminationstisch und geben Sie sie in die entsprechenden Behälter. Der Chirurg deskontaminiert die Bauchspeicheldrüse, indem er sie eine Minute lang wäscht. Anschließend wird die Bauchspeicheldrüse in jede der Deskontaminationslösungen gegeben und in ein kleines steriles Gefäß gestellt, in dem sie gewogen wird. Nachdem das Gewicht in die Chargenunterlage eingetragen wurde, wird die Bauchspeicheldrüse in die Kanülierwanne gelegt.Bei Verwendung einer bestimmten Konservierungslösung legt der Chirurg den Hauptgang frei, führt einen teilweisen Einschnitt durch und katheterisiert jede Hälfte der Bauchspeicheldrüse mit einer Kanüle, die mit einer Naht befestigt wird, um die Bauchspeicheldrüse zu perfundieren. Bringen Sie sie zunächst zur Perfusionsanlage und geben Sie die Enzymlösung in das Becken. Die gesamte Perfusionszeit beträgt etwa 10 Minuten bei 80 Millimeter Quecksilber für fünf Minuten.Dann erscheint die Bauchspeicheldrüse nach fünf Minuten bei 180 Millimeter Quecksilbersäule geschwollen. Nach der Perfusion überführen Sie die perfundierte Bauchspeicheldrüse in die Kanülierungsschale, wo das Fettgewebe vorsichtig von der Bauchspeicheldrüse entfernt wird. Anschließend schneiden Sie die Bauchspeicheldrüse in 10 bis 12 Stücke und überführen sie in die Aufnahmekammer zur Verdauung.Um den Verdauungsschritt zu beginnen, überführen Sie die Bauchspeicheldrüse in die leere Aufzeichnungskammer. Geben Sie ein Fläschchen mit eineinhalb Milliliter Pulmozyme auf den Bildschirm, wobei darauf geachtet werden muss, die Kammer nicht zu blockieren, schließen Sie die Kammer und füllen Sie das System auf. Beginnen Sie damit, die Lösung fünf Minuten lang zu pumpen.Bewegen Sie die Kammer sanft, um die warme Lösung gleichmäßig zu verteilen. Nach fünf Minuten schütteln Sie die Kammer während der gesamten Verdauungsphase vorsichtig. Halten Sie die Temperatur bei 37 Grad Celsius. Entnehmen Sie alle zwei Minuten eine Probe und prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob freie Augen gefunden werden. Tragen Sie die Bewertungsergebnisse der Augen in die Verdauungstabelle des Chargenprotokolls ein. Überwachen Sie weiterhin den Prozentsatz der Augen, bis 50 % von ihnen frei schwebend und isoliert in der Lösung vorliegen. Sobald in den Proben 50 % der Augen frei vorliegen, wird die Verdauung durch Zugabe kalter RPMI-Verdünnungslösung gestoppt.Das Circuit-Gewebe wird in 500-Milliliter-Konischflaschen gesammelt, die zuvor mit 30 Millilitern Humanalbumin gefüllt wurden. Zentrifugieren Sie die Konischflaschen eine Minute lang bei 1100 U/min und vier Grad Celsius.Nach dem Zentrifugieren saugen Sie den Überstand ab und waschen Sie das Pellet. Mit kalter Waschlösung vereinigen Sie alle Sammelröhrchen mit suspendiertem, verdautem Pankreasgewebe in einem einzigen 500-Milliliter-Konischglas. Wenn ein Röhrchen mit gewaschenem Gewebe gefüllt ist, zentrifugieren Sie es und wiederholen Sie den Waschvorgang, bis das gesamte Gewebe mehrfach gewaschen wurde.Zentrifugieren Sie dieses Reagenzglas und überführen Sie das Gewebe in ein einzelnes kegelförmiges 250-Milliliter-Gefäß. Füllen Sie das Volumen mit M1-99-Waschlösung, angereichert mit menschlichem Albumin, auf 250 Milliliter auf und bereiten Sie die Probenahme vor. Entnehmen Sie mit einer Pipette eine Ein-Milliliter-Probe und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Kegelgefäß, das vorab mit neun Millilitern Waschlösung befüllt wurde.Danach durch vorsichtiges Umstülpen des 15-Milliliter-Konikalrohrs vermischen. Einen Milliliter direkt aus dieser Probe in eine Zählkammer geben. Die Zellen zählen und die Zellzahl berechnen.Unter Verwendung eines Verdünnungsfaktors von 2,500 die 250-Milliliter-Konischflasche zentrifugieren und 150 Milliliter UW, der University of Wisconsin-Lösung, hinzufügen. Nach Zugabe von UW die Zellsuspension gründlich mit der Pipette mischen und dies dem Reinigungsoperator mitteilen.Die Startzeit in uw. Lassen Sie die Röhrchen auf Eis und schwenken Sie sie gelegentlich. Nun können die Ösen in diesem Schritt weiter gereinigt werden; eine Probe aus ungeklärtem Pankreasgewebe wird zur Zählung entnommen.Wenn die Dionslösung zur Probe hinzugegeben wird, färben sich ausschließlich die Augenlidpopulation rot. Anschließend können ihre Qualität und Menge bewertet werden. Wir haben soeben ein Verfahren zur Isolierung einer hohen Anzahl qualitativ hochwertiger menschlicher pankreatischer Inseln demonstriert, das für eine erfolgreiche Inseltransplantation von Bedeutung ist.Basierend auf unserer Erfahrung müssen wir die Verdauung so schnell wie möglich stoppen, sobald 40 bis 50 % der menschlichen Augenbläschen frei von dem umgebenden inneren Gewebe sind, indem wir das Verdauungsgemisch verdünnen und abkühlen. Es ist außerdem wichtig, das Gewebe während der Sammlung, des Waschens und des Mischens schonend zu behandeln. Wir empfehlen die U University really nice Chicago-Reinigungsmethode, die eine hervorragende Ausbeute an hochreinen menschlichen Augenbläschen ermöglicht.Diese Methode verkürzte auch die Isolationszeit erheblich, wodurch die ischämieassoziierten Schäden am Auge minimiert werden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das Erreichen hoher Qualität und ausreichender Menge menschlicher Inselchen ist einer der führenden Voraussetzungen für eine erfolgreiche Inseltransplantation. In diesem Video, beschreiben wir Schritt für Schritt die Verfahren für die menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation (Teil II: Reinigung und Kultur der menschlichen Inseln) mit einer modifizierten automatisierte Methode.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part II: Reinigung und Kultur der Menschenrechte Islets

Die Versorgung von Typ-2-Diabetes Inseln für die Forschung ist nicht ausreichend. Hier teilen wir unser Protokoll zur Isolierung von Inseln aus Patienten partielle Pankreatektomie. Dieser Ansatz stellt einen einzigartigen Ort für den Erhalt von kleinen Inseln von Typ 2 Diabetes und klinisch abgestimmt nicht-diabetischen Patienten in ausreichender Zahl für die Grundlagenforschung und klinische Studien.

Isolierung humaner Inselzellen aus teilweise Pankreatektomierten

Pankreasinseln, auch Langerhans-Inseln genannt, sind eine Ansammlung von endokrinen Zellen, die Hormone für die Glukoseregulierung und andere wichtige biologische Funktionen produzieren. Dieses Protokoll erklärt eine Methode zur Isolierung von Pankreasinseln, indem zuerst Kollagenase über Ampulla von Vater perfundiert wird, um das exokrine Pankreasgewebe zu verdauen, und eine vereinfachte Dichtegradientenzentrifugation, um die Inselzellen von Mäusen zu reinigen.

Isolierung von Pankreasinseln durch Kollagenase-Perfusion: Eine enzymatische Methode zur Isolierung von Pankreas-Inselzellen

Kritische Herausforderungen für die Diabetesforschung Bereich sind die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Insel β-Zellreplikation regulieren und β-Zellregeneration zur Stimulierung der Methoden zu entwickeln. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und der β-Zellreplikation fördernden Aktivität von kleinen Molekülen bewerten dargestellt.

Ein hoher Gehalt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-Zell-Replikation-Discovery-Plattform

Wir beschreiben ein Protokoll hier für intakte Inseln von neugeborenen Mäusen zu isolieren. Bauchspeicheldrüsen wurden teilweise mit Kollagenase, gefolgt von Waschen und Hand picking verdaut. 20-80 islet Cluster können pro Bauchspeicheldrüse von neugeborenen Mäusen erhalten werden, die für mehrere islet Studien geeignet sind.

Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Generierung hochwertiger, großflächiger Transkriptomdaten einzelner Zellen aus isolierten menschlichen Pankreasinseln unter Verwendung einer tropfenbasierten mikrofluidischen einzelligen RNA-Sequenzierungstechnologie vor.

Einzellige RNA-Sequenzierung und Analyse menschlicher Pankreas-Inseln

Metaplastische Zellen der Bauchspeicheldrüse sind Vorläufer bösartiger Zellen, aus denen Pankreastumoren entstehen. Die Isolierung intakter, lebensfähiger Pankreaszellen ist jedoch eine Herausforderung. Hier stellen wir eine effiziente Methode zur Dissoziation von Pankreasgewebe vor. Die Zellen können dann für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) oder für die zwei- oder dreidimensionale Co-Kultivierung verwendet werden.

Pankreasgewebedissektion zur Isolierung lebensfähiger Einzelzellen

Diese Studie entwickelte eine vereinfachte Methode, um funktionelle primäre Inselchen und Acinarzellen effizient aus der Bauchspeicheldrüse der Maus zu extrahieren, was ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der interzellulären Kommunikation in der Pathogenese des akuten Pankreatitis-induzierten Diabetes bietet.

Eine einfache und schnelle Methode zur gleichzeitigen Isolierung von primären Inselchen und primären Pankreas-Acinarzellen von Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Methode zur chirurgischen Entnahme, enzymatischen Verdauung und Dichtegradientenreinigung von Lewis-Rattenpankreasinseln, die ertragreiche, hochreine Präparate für den direkten Einsatz bei Transplantationen oder in vitro-Studien ermöglicht.

Isolierung und Reinigung von Pankreasinseln bei Lewis-Ratten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradiententrennung

Lernen Sie die Isolation menschlicher Pankreasinselzellen mit automatisiertem Perfusionsverfahren und Kollagenasen-Verdauung. Diese Methode liefert hochwertige Inseln für die Transplantation bei Diabetes.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe

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