Überwachung Pflanzenhormone bei Stress Responses

Dieses Verfahren beginnt mit der Homogenisierung von Pflanzenmaterial mithilfe keramischer Kügelchen und anschließender Extraktion mit Dichlormethan, um die organische Phase zu gewinnen. Nach der Zentrifugation werden die Proben unter Luftstrom getrocknet und für die Dampfphasenextraktion vorbereitet. Nach der Elution aus den Filtern der Dampfphasenextraktion kann man zur Analyse von Pflanzenhormonen mittels Massenspektrometrie und Gaschromatographie übergehen.

Hallo, ich bin Marie Engelberg vom JU-Engelberg-Labor am Fachbereich Biologie der University of Texas hier in San Antonio, und ich bin Ju Engelberg. Heute zeigen wir Ihnen ein einfaches Verfahren zur gleichzeitigen Quantifizierung wichtiger Pflanzenhormone. Wir verwenden diese Methode routinemäßig, um Veränderungen dieser Hormone in Pflanzen im Zusammenhang mit der Insektenabwehrtechnik zu überwachen.

Wir können auch Veränderungen in der Fettsäurezusammensetzung überwachen. Beginnen wir also. Für die Extraktion müssen Sie zunächst 2 ml-Vials mit Schraubverschluss vorbereiten.

Fügen Sie hierzu 400 Mikroliter Extraktionslösung und 10 Mikroliter des jeweiligen internen Standards mit einer Konzentration von 10 Nanogramm pro Mikroliter in ein Gefäß hinzu. Gefrieren Sie anschließend die Gefäße in flüssigem Stickstoff ein. Fügen Sie nach dem Einfrieren die Keramikkügelchen den Gefäßen hinzu.

Während sich die Vials noch in flüssigem Stickstoff befinden, geben Sie pflanzliches Material zwischen 50 und 200 Milligramm hinzu. Beachten Sie, dass das Gewicht des zugegebenen pflanzlichen Materials vor der weiteren Verarbeitung geschätzt werden muss, um eine exakte Quantifizierung anhand des Frischgewichts später zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass der gesamte flüssige Stickstoff verdampft ist, bevor Sie das Vial mit einem Verschluss fest verschließen.

Stellen Sie sicher, dass der Verschluss über eine Gummidichtung verfügt, um Verschütten von Lösungsmitteln und extrahierten Verbindungen während der Homogenisierung zu verhindern. Homogenisieren Sie das Gewebe in einem Fast-Prep- oder PSUs-Kugelmühle. Homogenisierer mit einer Geschwindigkeit von 6.000 für PSUs für 30 Sekunden.

Nach der Homogenisierung die Gefäße einzeln aus dem Homogenisator nehmen und die Verschlusskappen vorsichtig öffnen, um jedem Probengefäß ein Milliliter Dichlormethan zuzusetzen. Danach die Gefäße erneut fest verschließen und 10 bis 15 Sekunden bei 6.000 erneut homogenisieren. Anschließend die Gefäße in eine Tischzentrifuge überführen und die organische Phase von der wässrigen Phase bei 10.000 × g für 60 Sekunden trennen. Nach der Phasentrennung die untere grüne Schicht aus den einzelnen Gefäßen in ein sauberes vier Milliliter fassendes Glasgefäß überführen.

Dies ist die organische Phase, die die Hormone und die internen Standards enthält. Vermeiden Sie die Übertragung von Wasser oder der oberen Phase, und verdampfen Sie das Lösungsmittel mit Luft über ein Verteilerrohr etwa 10 bis 25 Minuten lang. Die Dauer hängt von der Probe ab.

Überprüfen Sie mit einer einzelnen Luftstromspitze sorgfältig, ob die Proben trocken sind. Achten Sie darauf, die Proben nicht zu stark zu trocknen, da dies zu einem Verlust von Verbindungen führen könnte. Sobald die Proben getrocknet sind, können wir mit der Methylierung der Carbonsäure enthaltenden Verbindungen in unseren Proben beginnen.

Fügen Sie zunächst 100 µL einer Mischung aus Diethylether und Methanol im Volumenverhältnis 9:1 zu jedem Gefäß hinzu. Geben Sie anschließend 4 µL einer 2-molaren Trimethylsulfoniumdiazomethan-Lösung in Hexan hinzu. Verschließen Sie die Gefäße unverzüglich mit einem offenen Schraubverschluss, der mit einer Teflon-gefärbten Silikonmembran ausgestattet ist, schütteln Sie die Gefäße vorsichtig und inkubieren Sie sie 25 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Schalten Sie ein Heizblock ein und stellen Sie es auf die gewünschte Sammeltemperatur ein. Die Flüchtigkeit der methylierten Verbindungen variiert je nach ihrer Größe und der Anzahl polarer Gruppen. Die Temperaturen können zwischen 80 und 200 Grad liegen. Stoppen Sie nach einer 30-minütigen Inkubation die Methylierungsreaktion, indem Sie vier Mikroliter einer zwei Molaren Essigsäurelösung in Hexan zu jedem Gefäß hinzufügen.

Dies geschieht, um unerwünschte sekundäre Reaktionen zu vermeiden. Die für die Dampfphasenextraktion verwendeten Filter sind handgefertigt und bestehen aus Teflonrohren.

Von einer Seite wird ein passendes Glasrohr mit einer Länge von etwa vier Zentimetern eingeführt. Sie können die beiden Scheiben aus Edelstahlgewebe sehen, die etwa 20 bis 30 Milligramm Absorptionsmittel enthalten. Spülen Sie die Filter, die zur Sammlung der methylierten und flüchtigen Pflanzenhormone verwendet werden, mit 200 Mikrolitern Methanol.

Anschließend die Filter zweimal mit je 200 µL Dichlormethan waschen. Danach den verbleibenden Lösungsmittelrest an der Luft trocknen lassen. Die Filter können nun zur Abscheidung flüchtiger Hormone mittels Dampfphasen-Extraktion verwendet werden.

Nach 30 Minuten Inkubation der Proben werden die Gummisepten der 4-Milliliter-Vialkappen mit einem Skalpell durchtrennt. Nun ist das extrahierte Material bereit, um die Pflanzenhormone mittels Dampfphasenextraktion zu gewinnen. Die gereinigten Filter werden an einzelne Vakuumleitungen mit einer Flussrate von etwa 800 Milliliter pro Minute angeschlossen.

Die Filter werden anschließend durch die eingeschnittenen Septen in das Gefäß eingeführt. Ebenso wird eine kleine Pipettenspitze als Luftzulauf eingeführt. Während dieses ersten Teils des Verfahrens müssen die Gefäße mit den eingefügten Filtern aufrecht gehalten werden, um zu verhindern, dass die Flüssigkeit im Inneren des Gefäßes mit der Filterpitze in Kontakt kommt, was den Filter verunreinigen würde.

Anschließend halten die GCMS die Vials von Hand, bis die gesamte Flüssigkeit durch den Filter verdunstet ist. Danach werden die Vials mit den angebrachten Filtern auf den Heizblock gestellt, und die verdampften Verbindungen werden drei Minuten lang gesammelt. Nach diesem letzten Extraktionsschritt in der Dampfphase werden die Vials mit den weiterhin angebrachten Filtern auf ein Gestell gestellt und abkühlen gelassen.

Stellen Sie 1,5-Milliliter-GC-Vials mit Einsätzen bereit, sobald die Filter Raumtemperatur erreicht haben. Geben Sie erneut mit einer Schleife 150 Mikroliter Dichlormethan in die Vials. Nachdem das verbleibende Lösungsmittel vom Filter ausgeblasen wurde, werden die Vials verschlossen und können nun mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie analysiert werden.

Verwenden Sie zur Analyse ein Gaschromatographiegerät mit einem Split-Splitless-Injektor, das an ein Massenspektrometer angeschlossen ist und im chemischen Ionisationsmodus betrieben wird. Nach der Injektion werden die Verbindungen an einer HP-1-MS-Säule getrennt, die eine Minute lang bei 40 °C gehalten wird. Die Temperatur wird mit 15 °C pro Minute auf 250 °C programmiert und dort 10 Minuten lang gehalten, wobei Helium als Trägergas mit einem konstanten Fluss von 0,7 mL/min verwendet wird. Für die massenspektrometrische Analyse können sowohl ein Quadrupol- als auch ein Ionenfallen-Massenspektrometer als CI-Gas verwendet werden.

Es kann entweder Isobutan oder Methanol verwendet werden. In jedem Fall sollten jedoch die Fragmente der Ionisationsreaktion überprüft werden, bevor die Programme zur Zählung ausgewählter Ionen erstellt werden. Wir verwenden ein modifiziertes GC 3,900-Gaschromatographie-System, gekoppelt mit einem Saturn-MS-2200-Massenspektrometer, und Methanol als CI-Reagenz.

Bitte beachten Sie unseren schriftlichen Protokolltext zur Beschreibung unseres Programms. Stellen Sie sicher, dass alle Verbindungen durch Vergleich mit authentischen, im Handel erhältlichen Standards identifiziert werden. Die Quantifizierung von JA, SA und ABA erfolgt durch Korrelation der Peakfläche extrahierter Ionen mit der Peakfläche extrahierter Ionen des jeweiligen internen Standards und basiert zudem auf dem Frischgewicht des verwendeten Pflanzenmaterials.

Nach der Extraktion der Daten aus den GCM-S-Dateien und einigen Berechnungen stellten wir fest, dass Ethin im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen beträchtliche Anreicherungen von Salicylsäure, Moninsäure und außerdem Abscisinsäure hervorruft. Die Daten für jedes einzelne Hormon stammten aus einem einzigen Durchlauf und zeigen die Eignung dieser Methode für die multiplexe Hormonanalyse. Wir haben Ihnen soeben ein einfaches, aber dennoch effektives Verfahren zur Extraktion und Quantifizierung wichtiger Pflanzenhormone und anderer Signalstoffe vorgestellt.

Es ist einfach durchzuführen, und die meisten der gezeigten Werkzeuge können leicht aus Standardlaborbedarf hergestellt werden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.