Channelrhodopsin2 vermittelte Stimulation der synaptischen Potentiale an Drosophila Neuromuskulären Endplatten
16. März 2009
Bei diesem Verfahren wird ein blaues Licht aktiviert Algen Kanal-und Zell-spezifische genetische Expression Tools zur synaptischen Potentiale mit Lichtimpulsen evozieren an der neuromuskulären Synapse (NMJ) in Drosophila Larven. Diese Technik ist eine kostengünstige und einfach zu bedienende Alternative zu Saugelektrode Stimulation für die synaptische Physiologie Studien in Forschung und Lehre Labors.
Dieses Verfahren beginnt mit dem Aufziehen von Drosophila. Dritte-Instar-Maden mit dem entsprechenden Genotyp werden auf Nahrungsmittel, die All-trans-Retinol enthalten, gezüchtet. Jede Made wird am Kopf- und am Schwanzende fixiert.
Danach FLA flach legen. Gehirn und hintere Nerven werden dann durchtrennt, um die rhythmische motorische Aktivität zu stoppen. Anschließend wird die blaue LED-Lichtquelle mit Steuerbox angepasst und auf das Präparat fokussiert.
Verwenden Sie abschließend eine scharfe Elektrode, um den Muskel sechs zu penetrieren. Anschließend geben Sie Lichtpulse mittels einer Spannungsquelle ab. Hallo, ich bin Nicholas Marstein aus dem Labor von Dr. Leslie Griffith am Fachbereich Biologie der Brandeis University.
Hallo, ich bin Stefan Pulver, ebenfalls aus dem Griffith-Labor. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Hervorrufung synaptischer Potentiale mit channelrhodopsin-2 an der neuromuskulären Verbindung der Drosophila-Larve. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die synaptische Physiologie bei Drosophila zu untersuchen.
Wir verwenden es außerdem, um Studierenden synaptische Physiologie beizubringen, und in Lehrpraktika. Beginnen wir also. Um mit diesem Protokoll zu beginnen, halten Sie UAS channel redsin zwei und okay, 3 7, 1 gal vier Fliegenlinien in separaten Flaschen mit Standard-Fliegenmedium.
Sammeln Sie Jungfrauen aus den Fliegenlinien 3-7, 1 gal4, und Männchen aus den UAS-Channels-Redsin-Linien. Stellen Sie anschließend ein Fliegenmedium her, das mit einem Millimolar all-trans-Retinol oder aTR vermischt ist. Erwärmen Sie hierzu normales Fliegenmedium in einer Mikrowelle für etwa eine Minute, bis es geschmolzen ist.
Nach dem Schmelzen das Medium etwa 30 bis 60 Sekunden abkühlen lassen und dann 100 Mikroliter einer 100 Millimolar a TR in 100 % Ethanol pro 10 Milliliter Fliegenmedium hinzufügen. Sobald die Gefäße mit a TR-Medium bereit sind, die gesammelten Männchen und Weibchen in jedes Gefäß geben. Die Gefäße an einen dunklen Ort bei 22 bis 25 Grad Celsius stellen, damit die Fliegen paaren und Eier legen können; vier bis fünf Tage warten, bis Larven des dritten Instars sichtbar sind.
An dieser Stelle können die adulten Fliegen entsorgt werden. Nun sind wir bereit, mit dem Aufbau der Elektrophysiologie-Apparatur fortzufahren. Befestigen Sie ein beliebiges Okular eines Stereomikroskops an einer blauen LED-Lichtquelle mit einem Wärmespeicher.
Verwenden Sie eine Stange und eine Klemme, um eine magnetische Basis am Okular und an der LED-Lichtquelle zu befestigen. Platzieren Sie die magnetische Basis auf dem Lufttisch der Elektrophysiologievorrichtung. Schließen Sie anschließend die Lichtquelle an eine Steuerschaltung an und verbinden Sie die Steuerschaltung mit einer externen Spannungsquelle.
Wir verwenden die Spannungsausgabe des von AD Instruments hergestellten PowerLab-Elektrophysiologie-Datenerfassungssystems. Nachdem es mit der Spannungsquelle verbunden wurde, geben Sie ein bis fünf Volt Impulse an die Steuerschaltung ab, um das blaue Licht zu aktivieren, und justieren Sie die magnetische Halterung und die Lichtquelle, bis der blaue Lichtstrahl auf den Bereich fokussiert ist, der für die Larvenpräparation vorgesehen ist. Nachdem die richtigen Einstellungen vorgenommen wurden, können wir mit der Larvenpräparation fortfahren.
Um mit der Dissektion zu beginnen, bringen Sie sechs 0,1-Millimeter-Nadeln in den Boden einer mit Sogar ausgekleideten Schale an. Entnehmen Sie eine dritte Instar-Larve dem Nährmedium und legen Sie sie in eine beliebige Kunststoff-Petri-Schale. Spülen Sie die Larven mit Salzlösung, um anhaftende Nahrung zu entfernen.
Danach die Larven in die Schnellschneide-Schale in die Nähe der gezogenen Nadeln legen und die Schale zur Hälfte mit Salzlösung füllen. Nun die Larven so ausrichten, dass zwei silbrige Röhren entlang der dorsalen Oberfläche des Tieres sichtbar sind. Diese silbrigen Röhren sind die Tracheen.
Stecken Sie eine große Nadel direkt in das Schwanzende zwischen den Tracheenröhren hinein. Halten Sie die Larven fest und setzen Sie eine zweite große Nadel in den Kopf ein. Achten Sie darauf, den Körper beim Einführen der Nadel in Längsrichtung zu strecken.
Verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen Einschnitt in der Nähe des Schwanzes anzulegen. Fahren Sie mit dem Einschnitt entlang der Körperlänge fort. Achten Sie darauf, dass die Scherspitzen angehoben sind, um die ventralen Nerven und/oder die Körperwandmuskulatur nicht zu verletzen.
Platzieren Sie vier Nadeln an den vier Ecken des Tieres. Öffnen Sie nun die Mittelregion. Befestigen Sie die Nadeln in der Präparierschale, um das Tier auszuweiden.
Fixieren Sie die Präparation ebenfalls, sodass sie mit Pinzette und Schere bearbeitet werden kann. Entfernen Sie die Verdauungsorgane, die Tracheen und die Fettkörper des Tieres. Spülen Sie die Präparation mit Salzlösung ab.
Nach dem Spülen mit einer Mikroschere die Frontallappen und das ventrale Ganglion der Präparation lokalisieren. Vorsichtig direkt hinter den Frontallappen durch das ventrale Ganglion schneiden. Sobald die Dissektion abgeschlossen ist, mit der Blaulichtstimulation und der Muskelableitung fortfahren.
Ziehen Sie eine Elektrode mit einem Widerstand von 10 bis 20 Megaohm, um die Muskelableitung durchzuführen. Füllen Sie die gezogene Elektrode mithilfe eines elektronischen Elektrodenziehers mit dreimolarer KCL-Lösung. Setzen Sie die gefüllte Elektrode in den Elektrodenhalter ein.
Platzieren Sie nun das larvale Präparat unter einem Stereomikroskop auf der Halterung. Justieren Sie das blaue Licht so, dass das präparierte Objekt mittig im Lichtstrahl liegt. Identifizieren Sie mit einem Mikromanipulator den Muskel sechs oder M sechs in einem beliebigen Körperwandsegment der Larve, führen Sie vorsichtig die Elektrode in M sechs ein und beobachten Sie eine schnelle Hyperpolarisation des Muskels.
Die Ruhemembranpotentiale sollten zwischen minus 30 Millivolt und minus 70 Millivolt liegen. Sobald die Elektrode korrekt eingeführt ist, geben Sie 20 bis 100 Millisekunden lange Spannungsimpulse an die Steuerschaltung ab. Erhöhen Sie die der Steuerschaltung zugeführte Spannung schrittweise.
Achten Sie auf erregende Endplattenpotentiale in der Muskelzelle. Hier ist ein repräsentatives Ergebnis, das ein durch kurze Lichtpulse hervorgerufenes erregendes Endplattenpotential zeigt. Die hier dargestellte Amplitude des erregenden Endplattenpotentials ist die summierte Amplitude von zwei Motoneuronen, von denen bekannt ist, dass sie beide aktiv sind.
M sechs. Geringere Intensitäten oder kürzere Dauer der Beleuchtung können das kleiner amplitudehabende exzitatorische Endplattenpotential eines einzelnen Motoneurons sichtbar machen. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man die Kanalstraße ohne zwei vermittelte Stimulation von synaptischen Potentialen an der oph-neuromuskulären Verbindung durchführt.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, die Körperwand des Präparats während der Dissektion nicht zu beschädigen. Ebenso wichtig ist es zu beachten, dass das Präparat, obwohl es unmittelbar nach der Dissektion übererregt sein kann, im Laufe der Zeit ruhiger wird und somit gute Ableitungen ermöglicht. Beim Einstich in die Muskulatur sollte darauf geachtet werden, nicht unter die erste Muskelschicht in die Körperwand vorzudringen.
Wenn Ihre Elektrode in der Körperwand steckt, können Sie manchmal hyperpolarisierte Potentiale messen, befinden sich jedoch nicht unbedingt in einer Muskelzelle. Das war's also.
Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
Dieses Verfahren nutzt einen blaulichtaktivierten Algenkanal und zellspezifische genetische Expressionswerkzeuge, um mit Lichtimpulsen an der neuromuskulären Verbindung (NMJ) bei Drosophila-Larven synaptische Potentiale hervorzurufen. Diese Technik stellt eine kostengünstige und einfach zu handhabende Alternative zur Saugelektrodenstimulation für die Untersuchung der synaptischen Physiologie in Forschungs- und Lehrlaboren dar.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Synaptische Physiologie
- Genetische Expression
Hintergrund
- Drosophila-Larven werden häufig in der Neurowissenschaftsforschung verwendet.
- Lichtaktivierte Kanäle bieten eine nichtinvasive Methode zur Untersuchung synaptischer Aktivität.
- Herkömmliche Methoden wie die Stimulation mittels Saugelektrode können komplex und kostspielig sein.
- Dieses Verfahren zielt darauf ab, den Prozess der Auslösung synaptischer Potentiale zu vereinfachen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Untersuchung der synaptischen Physiologie mittels Lichtstimulation.
- Bereitstellung einer zugänglichen Alternative für Bildungs- und Forschungszwecke.
- Verbesserung des Verständnisses synaptischer Mechanismen an der neuromuskulären Junction (NMJ).
Verwendete Methoden
- Züchtung von Drosophila-Larven auf spezifischem Nahrungsmittel.
- Fixierung der Larven zur Vorbereitung der Stimulation.
- Durchtrennung von Gehirn und hinteren Nerven, um die motorische Aktivität zu stoppen.
- Verwendung einer blauen LED-Lichtquelle, um synaptische Potentiale hervorzurufen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Hervorrufung synaptischer Potentiale mittels Lichtimpulsen.
- Nachweis der Wirksamkeit des blaulichtaktivierten algenbasierten Kanals.
- Bestätigung der Methode als zuverlässige Alternative zu herkömmlichen Techniken.
- Potenzial für weiterreichende Anwendungen in der synaptischen Physiologie-Forschung.
Schlussfolgerungen
- Die lichtaktivierte Methode ist wirksam zur Untersuchung der NMJ-Physiologie.
- Dieser Ansatz kann die Forschung und Lehre in der Neurowissenschaft fördern.
- Zukünftige Studien könnten weitere Anwendungen dieser Technik erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht eine nichtinvasive, lichtbasierte Stimulation synaptischer Aktivität in einem genetisch zugänglichen Modell und reduziert technische Hürden in neurophysiologischen Arbeitsabläufen. Sie unterstützt die reproduzierbare Erzeugung von Daten zur Zielvalidierung in der frühen Entdeckungsphase, insbesondere dort, wo die manuelle Handhabung von Elektroden die Durchsatzrate oder die Effizienz der Ausbildung einschränkt. Der Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit, indem er eine standardisierte, skalierbare Alternative zur Saug-Elektroden-Stimulation in Studien an der neuromuskulären Verbindung von Drosophila bietet.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen der synaptischen Übertragung durch präzise, lichtgesteuerte neuronale Aktivierung.
- Operativer Wert: Verringert die Abhängigkeit von technisch anspruchsvollen Saugelektroden-Manipulationen und verbessert so die Konsistenz des Assays zwischen verschiedenen Anwendern.
- Strategischer Wert: Unterstützt die hochpräzise phänotypische Bildschirmung genetischer oder pharmakologischer Modulatoren der synaptischen Funktion.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare exzitatorische junctionale Potentiale (EJPs) als direkten Messwert für die Wirksamkeit der neuromuskulären Übertragung.
- Operativer Wert: Ermöglicht standardisierte Stimulationsparameter durch Steuerung von blauen LED-Impulsen und verbessert damit die Reproduzierbarkeit zwischen Experimenten.
- Strategischer Wert: Ermöglicht die Miniaturisierung und Anpassung des Assays für Wirkstoffscreenings bei neurotoxischen oder neurotherapeutischen Untersuchungen an Drosophila.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet ein krankheitsrelevantes System zur Untersuchung konservierter synaptischer Signalwege mit genetischer Zugänglichkeit.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die longitudinale Verfolgung synaptischer Phänotypen in larvalen Modellen mit minimaler Vorbereitungsvariabilität.
- Strategischer Wert: Unterstützt die mechanistische Ent-Risikobewertung von Zielstrukturen, die an der neuromuskulären Transmission oder der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows als Stimulationsmodalität zur Beurteilung der synaptischen Funktion vor den Stadien der Leitstruktur-Optimierung.
- Entdeckungsbereich Biologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung neuronaler Erregbarkeit und Mechanismen der synaptischen Vesikel Freisetzung durch kontrollierte Lichtimpulse.
- Screening: Liefert standardisierte, quantifizierbare EJP-Amplituden, die zur Bewertung genetischer oder chemischer Störungen geeignet sind.
- Analytik: Erzeugt kontinuierliche Spannungsspuren, die eine Analyse der Amplitude, Anstiegszeit und Frequenz synaptischer Ereignisse ermöglichen.
- Translationale Forschung: Stellt eine Verbindung zu konservierten synaptischen Mechanismen her, die für menschliche neuromuskuläre Erkrankungen aufgrund genetischer Orthologie relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine wiederverwendbare Stimulationsplattform dar, die an verschiedene larvale Genotypen und experimentelle Bedingungen angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Zuverlässigkeit der Zielvalidierung, indem die Messvariabilität aufgrund von Artefakten durch Elektrodenplatzierung verringert wird.
- Operativer Wert: Verbessert die Laborproduktivität und die Effizienz der Schulung in Lehr- und Forschungsumgebungen durch eine vereinfachte Stimulationsanordnung.
- Strategischer Wert: Verringert die technischen Hürden bei Assays zur synaptischen Physiologie und ermöglicht einem breiteren Teamzugang sowie eine kollaborative Zusammenarbeit über Fachbereiche hinweg.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt Entscheidungen über die Weiterverfolgung oder Einstellung von Projekten bei der Priorisierung von Zielstrukturen, indem zuverlässige und hochauflösende synaptische Messsignale bereitgestellt werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Drosophila-Genetik, Elektrophysiologie und optischen Stimulationsystemen.
- Benötigt eine blaue LED-Lichtquelle, eine Spannungsregelschaltung und eine elektrophysiologische Vorrichtung mit Salzlösung.
- Setzt eine Standardisierung der Retinal-Fütterung, der larvalen Stadienbestimmung und der Dissektionsprotokolle über verschiedene Anwender hinweg voraus.
- Aufgrund der begrenzten Lichtdurchdringung in intakten Präparaten auf oberflächlich gelegene Muskelziele beschränkt.
- Hängt vom funktionellen ChR2-Ausdruck und der Verfügbarkeit des Cofaktors (all-trans-Retinal) in den motorischen Neuronen ab.
