Name: Channelrhodopsin2 vermittelte Stimulation der synaptischen Potentiale an Drosophila Neuromuskulären Endplatten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Erfahren Sie die optogenetische Stimulation synaptischer Potentiale an Drosophila-Neuromuskulären Endplatten mit Channelrhodopsin2. Diese Methode bietet eine kostengünstige Alternative zur Elektrodenstimulation.

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Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewährt RO1GM-33205 und MH-067284 zu LC Griffith und durch eine Brandeis University Sommer Undergraduate Research Stipendium NJ Hornstein unterstützt. In Woods Hole, MA: Erste Experimente für diese Technik wurden am Marine Biological Laboratory im Rahmen des 2008 Neural Systems and Behavior Sommerkurs (R25 MH059472 NIMH Zuschuss) durchgeführt.

Teil 1: Tierpflege und genetische Kreuze <ol><li> Pflegen Sie UAS-ChR2 und OK371-GAL4 fliegen in getrennten Flaschen mit Standard-fly media 8. </li><li> Sammeln Jungfrauen OK371-GAL4 fliegen Linien und Männchen UAS-ChR2 Linien. </li><li> Legen Sie beide Männchen und Weibchen in einem Fläschchen mit Standard-fly-Medien mit 1 mM all-trans-Retinal (ATR) gemischt. ATR Nahrung sollte vorher zu schmelzen regelmäßig fliegen Medien in der Mikrowelle für ca. 1 Minute erfolgen. Sobald geschmolzen, damit für etwa 30 Sekunden bis 1 Minute abkühlen lassen und dann mit 100 ul 100 mM ATR in 100% EtOH für je 10 ml fly Medien. Legen Fläschchen auf dem Eis, dann in einem dunklen Raum lagern bei 4 ° C. </li><li> Lassen Sie fliegt paaren und Eier legen in einem dunklen Raum bei 22-25 ° C. </li><li> Warten Sie 3-4 Tage bis zum 3. Larvenstadium sichtbar sind; an diesem Punkt, der erwachsenen Fliegen zu entsorgen. </li></ol> Teil 2: Rig Setup <ol><li> Fügen Sie alle 10x Binokular Okular (in unserem Fall, von Carl Zeiss Inc., www.zeiss.com, Thornwood, NY), um blaue LED-Lichtquelle mit Kühlkörper (Thor Labs, www.thorlabs.com, Newton, NJ ). Attach to Magnetfuß mit post und klemmen. Abdeckung Kühlkörper mit einem elektrisch geerdeten Abschirmung gegen elektrisches Rauschen von der Lichtquelle erzeugte reduzieren. </li><li> Legen Sie Magnetfuß mit Lichtquelle auf Lufttisch der Elektrophysiologie rig. </li><li> Connect Lichtquelle an den Steuerkreis und verbinden Regelkreis auf externe Spannungsquelle (Powerlab 4 / 30, ADInstruments, www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO). </li><li> Geben Sie 1-5 V Impulse an den Steuerkreis, um blaues Licht zu aktivieren. </li><li> Passen Magnetfuß und Lichtquelle, bis blauen Lichtstrahl auf einer Fläche von Larven Dissektion besetzt werden konzentriert. </li></ol> Teil 3: Dissection <ol><li> Stecken Sie sechs 0,1 mm Insektennadeln in den Boden eines Sylgard gesäumten Gericht. </li><li> Entfernen Sie einen 3 rd Larvenstadium aus der Nahrung Medien aufnehmen und in eine plastische Petri-Schale. </li><li> Spülen Larven mit Kochsalzlösung auf Nahrung zu entfernen. </li><li> Legen Larven in Sezieren Gericht in der Nähe des gezogen Stifte und fügen Kochsalzlösung ½ Ebene. </li><li> Orient die Larven, so dass Sie zwei silberne Röhren (Tracheen), die entlang des Tieres dorsalen Oberfläche sehen können. </li><li> Legen Sie eine grosse Nadel direkt in den Schwanz zwischen die Trachealtuben. Halten Sie die Larven ab und legen Sie eine zweite große Nadel in den Kopf, sicher zu sein, um den Körper ausstrecken Längsrichtung. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Nähe des Schwanzes, und weiterhin ist die Länge des Körpers. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen der Schere so sind, wie nicht versehentlich geschnitten ventralen Nerven und / oder Körper Wand Muskeln erhöht. </li><li> Legen Sie vier Pins an den vier Ecken des Tieres ist jetzt offen Mittelteil. Setzen Sie diese in das Sezieren Gericht so Filet des Tieres. Pin Zubereitung vermittelt. </li><li> Mit einer Pinzette und Schere, entfernen Sie das Tier guts, der Luftröhre und Fettkörper. </li><li> Spülen Sie die Vorbereitung mit Kochsalzlösung. </li><li> Suchen Sie den Frontallappen (wie in Abb. A aus gesehen) und Bauchganglion des prep. </li><li> Mit Mikro-Schere, schneiden Sie vorsichtig durch die Bauchganglion direkt hinter dem Frontallappen. </li></ol> Teil 4: Muscle Aufnahme und blaues Licht Stimulation <ol><li> Ziehen Sie eine 10-20 μω Elektrode mittels eines elektronischen Elektrode Puller (Sutter Instruments). </li><li> Füllen Sie die Elektrode gezogen mit 3 M KCl. </li><li> Gefüllte Elektrode in Elektrodenhalter und Manöver Elektrodenspitze mit einem Mikromanipulator in der Nähe Larven prep unter Binokular auf Elektrophysiologie rig. </li><li> Identifizieren Muscle 6 (M6) in jede Einrichtung Wandsegment (Abb. A). </li><li> Vorsichtig Elektrode in M6 und achten Sie auf eine schnelle Hyperpolarisation. Muscle Ruhe Membranpotentiale sollte irgendwo zwischen -30 mV bis -70 mV. </li><li> Passen blaues Licht, so dass seziert prep in Lichtstrahl zentriert ist. </li><li> Geben 20-100 ms Spannungsimpulse an den Steuerkreis. Schrittweise zu erhöhen versorgt an den Steuerkreis. Achten Sie auf exzitatorische Kreuzung Potenziale in der Muskelzelle (Abbildung 1B). </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung der Aufnahme-Setup und filetiert Vorbereitung. Abbildung 1B zeigt typische EJP durch kurze Lichtpulse hervorgerufen. EJP Amplitude dargestellt wird Amplitude von zwei motorischen Neuronen bekannt, sowohl innervieren M6 summiert. Geringere Lichtintensitäten nur ein Motor-Einheit (Daten nicht gezeigt) aktiviert. <img src="/files/ftp_upload/1133/figure1.png" alt="Abbildung 1" width="600" height="373" /> Abbildung 1: A) Allgemeines Schema eines intrazellulären Aufnahme rig und mit blauen LED. Brain (Br) wird entfernt, um rhythmische Aktivität im ventralen Ganglion (VG) zu hemmen. ChR2 ist in Motoneuronen mit der GAL4-UAS-System ausgedrückt. B) Intrazelluläre Aufnahme von einem M6 Muskel. 40 ms blaue Lichtblitze (bei ​​127 mW / mm 2) zuverlässig wecken große synaptischen Potentiale (Sternchen) in M6.

<ol><li>Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).</li>
<li>Lagow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+a+hydrophobic+layer+by+a+point+mutation+in+syntaxin+1A+regulates+the+rate+of+synaptic+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion.</a> PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).</li>
<li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).</li>
<li>Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+neuronal+cell+ablation+in+the+Drosophila+embryo%3A+pathfinding+by+follower+growth+cones+in+the+absence+of+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers.</a> Neuron. 14 (4), 707(1995).</li>
<li>Ralph Greenspan, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRalph+Greenspan%2C++%22Fly+Pushing%3A+The+Theory+and+Practice+of+Drosophila+Genetics%2C+2nd+ed%22">Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).</li>
</ol>

Wir haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Kritische Schritte umfassen sowohl die ursprüngliche Dissektion und das Eintreten von Muskelzellen. Wenn die Nerven abgeschnitten werden oder Muskel beschädigt ist während der ersten Sektion ist es schwierig, den Rest das Experiment fortzusetzen. Während Dissektion, muss man sehr vorsichtig sein, um Winkel Präparierscheren nach oben so viel wie möglich während der dorsale Inzision. Während der zweite entscheidende Schritt in eine Muskelzelle, muss man für eine Hyperpolarisation letzten ~ 30 mV zu beobachten. Werte über ...

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>&lt;a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank"&gt;www.ellsworth.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Minuten-Nadeln</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Präparationschale</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"&gt;www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Neuroprobe Intrazellulärverstärker und Kopfverstärker</td><td>A-M Systems</td><td>680100</td><td>&lt;a href="http://www.a-msystems.com" target="_blank"&gt;www.a-msystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;Powerlab 4/30 Datenerfassungssystem&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"&gt;www.adinstruments.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Grass-Stimulator</td><td>Grass Technologies</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.grasstechnologies.com" target="_blank"&gt;www.grasstechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Desktop-Computer</td><td>Dell</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.dell.com" target="_blank"&gt;www.dell.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Präparationsmikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Lichtquelle</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>41446-062</td><td>&lt;a href="http://www.dolan-jenner.com" target="_blank"&gt;www.dolan-jenner.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Fliegenmedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>All-trans-Retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>116-31-4</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;OK-371 Gal4&lt;/em&gt; Fliegen</td><td>Bloomington Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-ChR2&lt;/em&gt; Fliegen</td><td>Fiala-Labor, Griffith-Labor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED-Steuerungsschaltung</td><td>Im Griffith-Labor gebaut</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.ledsupply.com" target="_blank"&gt;http://www.ledsupply.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href="http://www.futureelectronics.com" target="_blank"&gt;http://www.futureelectronics.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;Besteht aus: &lt;br/&gt;1. 200 mA Buck Puck&lt;br/&gt;2. Blaue LED&lt;br/&gt;3. Isolierter Draht&lt;br/&gt;4. Steckplatine für Schaltungen&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>LED-Kühlkörper</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"&gt;http://www.thorlabs.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Lufttisch</td><td>TMC</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html" target="_blank"&gt;http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Faraday-Käfig</td><td>Im Griffith-Labor gebaut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Leitz M Mikromanipulator</td><td>Leica Microsystems</td><td>ACS01</td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Elektrodenhalter</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.axon.com" target="_blank"&gt;www.axon.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Borsilikatglas</td><td>FHC, Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fh-co.com/p14-15.pdf" target="_blank"&gt;www.fh-co.com/p14-15.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Elektrodenzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.sutter.com" target="_blank"&gt;www.sutter.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>HL 3.1-Salzlösung mit 0,8 mM Ca2+</td><td></td><td></td><td>Inhaltsstoffe (mM):&lt;br/&gt; NaCl:70 KCl:5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;: 0,8&lt;br/&gt; MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;:4 Saccharose:115&lt;br/&gt;NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;: 10 Trehalose: 5 HEPES</td></tr><tr><td>Präparationswerkzeuge</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

channelrhodopsin2 vermittelte stimulation der synaptischen potentiale an drosophila neuromuskulären endplatten

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

Die<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvalen neuromuskulären Vorbereitung hat sich als ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung synaptischer Physiologie<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. Derzeit ist das nur für exzitatorische junctional Potentiale (EJPs) in dieser Zubereitung auslösen beinhaltet die Verwendung von Saug-Elektroden. In Forschung und Lehre Labore, Studenten haben oft Schwierigkeiten, Rangieren und manipulieren diese Art der stimulierenden Elektrode. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir, wie aus der Ferne zu stimulieren synaptischen Potentiale an den Larven NMJ ohne den Einsatz von Saug-Elektroden. Durch die Expression Channelrhodopsin2 (ChR2)<sup&gt; 4,5,6</sup&gt; In<em&gt; Drosophila</em&gt; Motoneuronen mit dem<em&gt; GAL4-UAS</em&gt; System<sup&gt; 7</sup&gt;, Und kleinere Änderungen an einer grundlegenden Elektrophysiologie rig, konnten wir zuverlässig wecken EJPs mit Impulsen von blauem Licht. Diese Technik könnte von besonderem Nutzen in der Neurophysiologie Lehre Labors, in denen Schüler rig Praxis Zeit und Ressourcen sind begrenzt.

Bei diesem Verfahren wird ein blaues Licht aktiviert Algen Kanal-und Zell-spezifische genetische Expression Tools zur synaptischen Potentiale mit Lichtimpulsen evozieren an der neuromuskulären Synapse (NMJ) in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven. Diese Technik ist eine kostengünstige und einfach zu bedienende Alternative zu Saugelektrode Stimulation für die synaptische Physiologie Studien in Forschung und Lehre Labors.

Channelrhodopsin2 vermittelte Stimulation der synaptischen Potentiale an Drosophila Neuromuskulären Endplatten

Die neuromuskuläre Präparation von Drosophila-Larven hat sich als nützliches Instrument zur Untersuchung der synaptischen Physiologie erwiesen1,2,3. Derzeit ist das einzige verfügbare Mittel ...

Dieses Verfahren beginnt mit dem Aufziehen von Drosophila. Dritte-Instar-Maden mit dem entsprechenden Genotyp werden auf Nahrungsmittel, die All-trans-Retinol enthalten, gezüchtet. Jede Made wird am Kopf- und am Schwanzende fixiert.Danach FLA flach legen. Gehirn und hintere Nerven werden dann durchtrennt, um die rhythmische motorische Aktivität zu stoppen. Anschließend wird die blaue LED-Lichtquelle mit Steuerbox angepasst und auf das Präparat fokussiert.Verwenden Sie abschließend eine scharfe Elektrode, um den Muskel sechs zu penetrieren. Anschließend geben Sie Lichtpulse mittels einer Spannungsquelle ab. Hallo, ich bin Nicholas Marstein aus dem Labor von Dr. Leslie Griffith am Fachbereich Biologie der Brandeis University.Hallo, ich bin Stefan Pulver, ebenfalls aus dem Griffith-Labor. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Hervorrufung synaptischer Potentiale mit channelrhodopsin-2 an der neuromuskulären Verbindung der Drosophila-Larve. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die synaptische Physiologie bei Drosophila zu untersuchen.Wir verwenden es außerdem, um Studierenden synaptische Physiologie beizubringen, und in Lehrpraktika. Beginnen wir also. Um mit diesem P

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Elektrophysiologischen Methoden für die Aufzeichnung Synaptic Potentials aus dem NMJ von Drosophila-Larven

Dieses Video demonstriert die Technik zur Aufzeichnung synaptischer Ströme von einem synaptischen Bouton an der neuromuskulären Verbindung der Drosophila-Larve. Diese Technik ermöglicht die Überwachung der Aktivität eines einzelnen synaptischen Boutons, was für die Untersuchung mutierter Fliegenlinien mit erhöhter spontaner oder asynchroner synaptischer Aktivität wichtig ist.

Aufzeichnung synaptischer Ströme an der neuromuskulären Verbindung der Drosophila-Larve

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Optogenetische Störung der neuronalen Aktivität mit Laser Illumination in Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion

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Fokale Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme aus der Drosophila larvalen neuromuskulären Synapse

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Channelrhodopsin2 vermittelte Stimulation der synaptischen Potentiale an Drosophila Neuromuskulären Endplatten

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