Channelrhodopsin2 vermittelte Stimulation der synaptischen Potentiale an Drosophila Neuromuskulären Endplatten

Dieses Verfahren beginnt mit der Züchtung von Drosophila. Drittens, Instar-Maden mit dem entsprechenden Genotyp auf Lebensmitteln, die ausschließlich Trans-Retinol enthalten. Jede Made ist mit Kopf und Schwanz herausgesteckt.

Dann FLA flach. Das Gehirn und die hinteren Nerven werden dann durchtrennt, um die rhythmische Motorik zu stoppen. Als nächstes wird die blaue LED-Lichtquelle mit Steuerbox eingestellt und auf die Vorbereitung fokussiert.

Zum Schluss spießen Sie mit einer scharfen Elektrode Muskel sechs auf. Geben Sie dann mit einer Spannungsquelle Lichtimpulse ab. Hallo, ich bin Nicholas Marstein aus dem Labor von Dr. Leslie Griffith, dem Department of Biology an der Brandeis University.

Hallo, ich bin Stefan Pulver, ebenfalls vom Griffith Lab. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Evokation synaptischer Potentiale mit fehlender Kanalwurzel an der neuromuskulären Verbindung der Drosophila-Larve. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die synaptische Physiologie und Drosophila zu untersuchen.

Wir verwenden es auch, um Studenten synaptische Physiologie und Lehrlabore zu unterrichten. Also lasst uns loslegen. Um mit diesem Protokoll zu beginnen, halten Sie den UAS-Kanal Redsin zwei und okay, 3 7, 1 Gallone vier Fliegenschnüre in separaten Flaschen mit Standard-Fliegenmedien.

Sammle Jungfrauen von der, okay, 3 7, 1 Gal, vier Fliegenschnüre und Männchen aus dem UAS-Kanal Redsin. Zwei Zeilen. Stellen Sie als Nächstes Fliegenmedium her, das mit einem Millimolaren, allen Trans-Retinol oder einem TR.To gemischt wird, indem Sie normales Fliegenmedium etwa eine Minute lang in der Mikrowelle schmelzen.

Lassen Sie das Medium nach dem Schmelzen etwa 30 bis 60 Sekunden abkühlen und fügen Sie dann 100 Mikroliter 100 Millimolar pro TR in 100 % Ethanol pro 10 Milliliter Flugmedium hinzu. Wenn die Durchstechflaschen mit einem TR-Medium fertig sind, geben Sie die gesammelten männlichen und weiblichen Tiere in jede Durchstechflasche. Stellen Sie die Fläschchen an einen dunklen Ort bei 22 bis 25 Grad Celsius, damit sich die Fliegen paaren und Eier legen können, warten Sie vier bis fünf Tage, bis die dritte Sternlarve sichtbar ist.

An dieser Stelle kannst du die ausgewachsenen Fliegen entsorgen. Wir sind nun bereit, mit dem Aufbau des Elektrophysiologie-Rigs fortzufahren. Befestigen Sie ein beliebiges Präparierrohr-Okular an einer blauen LED-Lichtquelle mit einem Kühlkörper.

Verwenden Sie einen Pfosten und eine Klemme, um einen Magnetfuß am Okular und an der LED-Lichtquelle zu befestigen. Platzieren Sie den Magnetfuß auf dem Lufttisch des Elektrophysiologie-Rigs. Schließen Sie als Nächstes die Lichtquelle an einen Steuerstromkreis an und verbinden Sie dann den Steuerstromkreis mit einer externen Spannungsquelle.

Wir verwenden die Spannung, die vom elektrophysiologischen Datenerfassungssystem des Power Labs von ad instruments ausgegeben wird. Sobald Sie an die Spannungsquelle angeschlossen sind, geben Sie ein bis fünf Volt-Impulse an den Steuerkreis, um das blaue Licht zu aktivieren, stellen Sie den Magnetfuß und die Lichtquelle ein, bis der blaue Lichtstrahl auf den Bereich fokussiert ist, der von der Larvendissektion eingenommen werden soll. Nachdem wir die richtigen Einstellungen vorgenommen haben, sind wir bereit, mit der Larvendissektion fortzufahren.

Um mit dem Sezieren zu beginnen, stecken Sie sechs 0,1-Millimeter-Stecknadeln in den Boden einer gleichmäßig ausgekleideten Schale. Nehmen Sie eine dritte Sternlarve aus dem Futtermedium und geben Sie sie in eine Petrischalen aus Plastik. Spülen Sie die Larven mit Kochsalzlösung ab, um alle Lebensmittel zu entfernen, die an den Larven haften.

Dann legten Sie die Larven in die Präparierschale in der Nähe der gezogenen Stecknadeln und füllten die Schale zur Hälfte mit Kochsalzlösung. Richten Sie nun die Larven so aus, dass Sie zwei silbrige Röhren sehen können, die entlang der Rückenfläche des Tieres verlaufen. Diese silbrigen Röhren sind die Luftröhre.

Führen Sie einen großen Stift direkt in den Schwanz zwischen den Trachealtuben ein. Halten Sie die Larven fest und stecken Sie eine zweite große Nadel in ihren Kopf. Achten Sie darauf, den Körper der Länge nach zu dehnen, während die Nadel eingeführt wird.

Mache mit einer Schere einen kleinen Schnitt in der Nähe des Schwanzes. Setzen Sie den Schnitt über die gesamte Länge des Körpers fort. Achten Sie darauf, dass die Spitzen der Schere angehoben sind, um ein Durchtrennen der Bauchnerven und/oder der Körperwandmuskulatur zu vermeiden.

Platzieren Sie vier Stecknadeln an den vier Ecken der Tiere. Öffnen Sie nun den Mittelteil. Legen Sie die Stecknadeln in die Präparierschale, um das Tier zu filetieren.

Stecke das Präparat auch so fest, dass es mit Pinzette und Schere gelehrt wird. Entfernen Sie die Verdauungsorgane, die Luftröhre und die Fettkörper des Tieres. Spülen Sie die Zubereitung mit Kochsalzlösung ab.

Lokalisieren Sie nach dem Spülen die Frontallappen und das Ventralganglion des Präparats mit einer Mikroschere. Schneiden Sie vorsichtig durch das Ventralganglion direkt hinter den Frontallappen. Sobald die Dissektion abgeschlossen ist, fahren Sie mit der Blaulichtstimulation und der Muskelaufzeichnung fort.

Um die Muskelaufzeichnung durchzuführen, ziehen Sie an einer 10 bis 20 Megaohm Widerstandselektrode. Füllen Sie die gezogene Elektrode mit einem elektronischen Elektrodenabzieher mit drei molaren KCL. Legen Sie die gefüllte Elektrode in den Elektrodenhalter.

Lege nun die Larvenvorbereitung unter ein Präpariermikroskop auf das Rig. Stellen Sie das blaue Licht so ein, dass die präparierte Vorbereitung im Lichtstrahl zentriert ist. Identifizieren Sie den Muskel sechs oder M sechs in einem beliebigen Körperwandsegment der Larve mit einem Mikromanipulator, führen Sie vorsichtig die Elektrode in M sechs ein und achten Sie auf einen schnellen Hyperpolarisationsmuskel.

Die Potentiale der ruhenden Membran sollten zwischen minus 30 Millivolt und minus 70 Millivolt liegen. Sobald die Elektrode richtig eingesetzt ist, geben Sie 20 bis 100 Millisekunden Spannungsimpulse an den Steuerstromkreis ab. Erhöhen Sie schrittweise die dem Steuerkreis zugeführte Spannung.

Achten Sie auf Exci-Junction-Potentiale in der Muskelzelle. Hier ist ein repräsentatives Ergebnis, das ein Exci-Junction-Potential zeigt, das durch kurze Lichtpulse hervorgerufen wird. Die hier gezeigte Amplitude des Exci-Übergangspotentials ist die summierte Amplitude von zwei Motoneuronen, von denen bekannt ist, dass sie beide essen.

M sechs. Niedrigere Intensitäten oder kürzere Lichtdauern können das exzitatorische Übergangspotential mit kleinerer Amplitude von einem einzelnen Motoneuron freilegen. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Kanalstraße ohne zwei vermittelte Stimulationen der synaptischen Potentiale an der neuromuskulären Schnittstelle oph durchführen können.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Körperwand des Präparats während der Dissektion nicht zu beschädigen. Es ist auch wichtig, sich daran zu erinnern, dass eine Vorbereitung zwar schon nach einer Dissektion überdreht sein kann, aber mit der Zeit ruhiger wird und gute Aufnahmen ermöglicht. Achten Sie beim Aufspießen von Muskeln darauf, nicht unter die erste Muskelschicht in die Körperwand zu gelangen.

Wenn Ihre Elektrode in die Körperwand gesteckt ist. Sie können manchmal hyperpolarisierte Potentiale erhalten, befinden sich aber nicht wirklich in einer Muskelzelle. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.