Herstellung von Myogenic Engineered Tissue Konstrukte

Dieses Verfahren beginnt mit der Gewinnung von Skelettmuskelgewebe aus neonatalen Lewis-Ratten. Aus diesem Gewebe isolieren wir Myoblastenzellen. Diese Myoblasten werden zwei Tage lang in Zellkulturschalen kultiviert und anschließend geerntet und in eine kollagenbasierte Gewebekonstrukt-Mischung eingearbeitet.

Diese Mischung wird vorsichtig in eine Form pipettiert, die in Kulturmedium eingetaucht ist, und bei 37 Grad Celsius inkubiert. Hallo, ich bin Christina Pesach aus dem Labor von Douglas Cowan an der Abteilung für Anästhesiologie im Children's Hospital, Boston, und der Harvard Medical School. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung myogener, gewebetechnisch konstruierter Strukturen.

Wir verwenden dieses Verfahren, um ein konstruiertes Gewebe zur Implantation im Herzen herzustellen. Unser Ziel ist es, eine elektrische Verbindung zwischen den oberen und unteren Herzkammern herzustellen, als alternative Therapie zur Implantation eines Herzschrittmachers bei Kindern mit komplettem Herzblock. Beginnen wir also.

Bei der Konstruktion wird eine Gussform verwendet, um eine Form für den chirurgisch implantierbaren, kollagenbasierten Gewebekonstrukt bereitzustellen. In diesem Video wird der Prozess der Herstellung von gewebetechnisch bearbeiteten Konstrukten, die Skelettmuskelvorläuferzellen enthalten, in einem begleitenden Video beschrieben. Die kardiale Implantation des in diesem Protokoll hergestellten zellulären Gewebes wird demonstriert.

Eine Gewebeschablone kann praktisch in jeder Form und Größe hergestellt werden, um den physiologischen Anforderungen jedes Herzens gerecht zu werden, für das das Gewebe konzipiert ist. In dieser Demonstration wird die Schablone ein Gewebestück formen, das so zugeschnitten werden kann, dass es in die AV-Nut eines erwachsenen Rattenherzens passt. Beginnen Sie mit dem Bau der Schablone, indem Sie mithilfe einer Rasierklinge die Silikonschläuche in drei Zentimeter lange Stücke schneiden und jedes Stück dann längs halbieren.

Schneiden Sie ein kleines Stück Polyester-Masche ab. Geben Sie anschließend einen Tropfen implantatverträglichen RTV-Silikonkleber auf die Innenseite des äußersten Endes des Schlauchs. Achten Sie darauf, die Menge des aufgetragenen Klebers möglichst gering zu halten, da dieser für kultivierte Zellen leicht toxisch ist.

Platzieren Sie schnell ein kleines Stück Polyester-Mesh auf dem Tropfen aus Silikonkleber und richten Sie es am Ende des Schlauchs aus. Dies erzeugt eine leicht erhöhte, flache Oberfläche zur Befestigung des Konstrukts. Wiederholen Sie den Vorgang am anderen Ende des Schlauchs.

Lassen Sie die Form bei Raumtemperatur drei Tage lang trocknen. Es ist hilfreich, jeweils 20 bis 30 Formen anzufertigen, da diese im Wesentlichen als Einwegartikel verwendet werden. Sobald der Klebstoff vollständig getrocknet ist, um die Sterilisation der Formen zu unterstützen, lagern Sie diese in einem Behälter mit 70 % Ethanol, bis sie benötigt werden, wobei die Formen bereits vorbereitet sind.

Als Nächstes prüfen Sie, ob alle erforderlichen Lösungen ebenfalls gebrauchsfertig sind, um die Zellisolierung vorzubereiten. Stellen Sie eine verdünnte Laminin-Lösung her, bestehend aus einem Milligramm Laminin in 250 Milliliter 0,2-Mikron-filtersterilisiertem PBS, das Antibiotika und ein Fungizid enthält.

Als Nächstes beschichten Sie 150-Millimeter-Zellkulturplatten mit vier Milliliter der verdünnten Laminin-Lösung und inkubieren sie vor der Verwendung mindestens vier Stunden bei 37 Grad Celsius. Zwei weitere Lösungen müssen ebenfalls hergestellt werden: das Myoblastenmedium und die Skelettmuskel-Digestionslösung.

Beziehen Sie sich auf den Textteil des Protokolls für deren Zusammensetzung. Sterilisieren Sie den Verdauungspuffer, indem Sie eine 0,2-Mikron-Filtermembran an einer 10-Milliliter-Spritze verwenden. Aliquots des Verdauungspuffers können bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Schätzen Sie, dass Sie fünf Milliliter Digestionspuffer pro Lewis-Rattenwurf benötigen. Inkubieren Sie die erforderliche Menge an Gewebe-Digestionspuffer sowie 10 Milliliter Myoblasten-Medium bei 37 Grad Celsius. Fahren Sie anschließend mit der Dissektion der Rattenjungen fort.

Entnehmen Sie zunächst mindestens einen Wurf neugeborener, getöteter Lewis-Ratten mithilfe von Pinzette und kleiner Schere. Entfernen Sie die paraspinalen Muskeln von toten neugeborenen Lewis-Ratten, indem Sie entlang des Rückenmarks den Rücken aufschneiden, die Haut- und Faszienschichten zurückklappen und anschließend die Muskeln herausschneiden. Geben Sie die herauspräparierten Muskeln in ein 50-Milliliter-Kegelrohr, das mit 40 Milliliter 1× H-BSS auf Eis gefüllt ist.

Lassen Sie die Muskelstreifen auf den Boden des Reagenzglases absinken und entfernen Sie vorsichtig den größten Teil der Flüssigkeit und Blutreste durch Vakuumsaugung mit einer sterilen Pasteurpipette in einer Zellkultur. Gießen Sie anschließend die gewonnenen Muskelstücke auf eine 150 Millimeter große Kulturschale und aspirieren Sie so viel wie möglich der restlichen Flüssigkeit ab. Zerkleinern Sie das Gewebe mit zwei einseitig geschliffenen Rasierklingen zu einer dicken Paste.

Die Musenpaste wird in vorgewärmter Verdauungslösung verdaut. Gießen Sie etwas von der Verdauungslösung auf die Musenpaste und überführen Sie das Gemisch aus Lösung und Musenpaste in ein frisches 50-Milliliter-Gefäß. Für eine effiziente Verdauung der Muskulatur von drei Litern Lewis-Ratten verwenden wir in der Regel 10 bis 15 Milliliter Lösung mit einer 10-Milliliter-Pipette.

Stellen Sie das Röhrchen auf eine schwingende Plattform und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius für etwa 30 Minuten. Während der enzymatischen Verdauung wird das Gewebe gelegentlich ohne Blasenbildung umgepipettiert. Verwenden Sie dazu eine 10-Milliliter-Pipette, die an eine kabellose Pipette angeschlossen ist.

Wenn der Muskel verflüssigt ist, wird die Lösung durch einen Zellfilter mit 70 Mikron durchläuft. Anschließend werden die filtrierten Zellen 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 600 × g zentrifugiert. Mit einer Pasteurpipette und Absaugung wird so viel wie möglich der überstehende Flüssigkeit abgenommen und das Zellpellet in 10 Milliliter warmer Myoblasten-Medium resuspendiert. Die Zellen werden für 15 Minuten auf eine nicht beschichtete 150 Millimeter-Zellkulturplatte ausgesät, um verbleibende Fibroblasten zu entfernen, da diese schneller anheften als Myoblasten.

Stellen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator, der auf 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid eingestellt ist. Entnehmen Sie die Platte dem Inkubator und überführen Sie die Zellen, die noch nicht angeheftet sind, in die auf Lamin beschichtete Kultur. Verdünnen Sie sie in Myoblasten-Medium, sodass eine Platte für jedes ein bis zwei Ratten-Welpen vorliegt.

Wenn die Zellen zu dicht ausplattiert werden, differenzieren sie sich zu Myoröhren. Abschließend lassen Sie die Zellen in einer befeuchteten Inkubationskammer bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid wachsen. Nach ein bis zwei Tagen Inkubation sind die Zellen bereit, in Gewebekonstrukte eingegossen zu werden.

Nach ein bis zwei Tagen der Inkubation vier der 150 Millimeter Myoblasten-Gewebekulturplatten aus dem Inkubator entfernen. Nicht länger als 48 Stunden warten, da sonst Fibroblasten die Myoblastenpopulation verdrängen. Das Medium von den Zellen abpipettieren.

Anschließend die Zellen zweimal mit jeweils einem XPBS, das auf 37 Grad Celsius erwärmt wurde, spülen, um die Myoblasten von der Platte zu lösen, und vier Milliliter erwärmte 0,05 %ige Trypsin-EDTA-Lösung zu jeder Platte geben. Die Platten für fünf Minuten in den Inkubator zurückstellen. Die Myoblasten im Zellkulturwerk abholen und die Flüssigkeit in einem 50-Milliliter-Röhrchen sammeln. 10 Milliliter Myoblasten-Medium verwenden, um alle Platten auszuspülen, und diese Flüssigkeit mit den Zellen im Zentrifugenröhrchen vereinigen.

Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 600 ×g und aspirationieren Sie so viel überschüssige Flüssigkeit wie möglich. Resuspendieren Sie die Myoblasten nun in 1,4 Milliliter Myoblastenmedium und stellen Sie sie auf Eis. Entfernen Sie mithilfe einer Pinzette vorsichtig eine Konstruktform aus dem Ethanolbad und spülen Sie sie durch zweimaliges Eintauchen zweimal mit 1× PBS ab. Entfernen Sie alle Reste von PBS mit einer Pasteurpipette, bevor Sie die Form in eine leere Vertiefung einer sechswelligen Zellkulturplatte geben.

Zu diesem Zeitpunkt muss eine Lösung hergestellt werden. Sammeln Sie die folgenden Reagenzien auf Eis. 10 x hams F 10 Pilzzone Penicillin Streptomycin.

Kollagen Typ I-Zellen, die in Myoblasten, mittlerem Natriumbikarbonat und Gel resuspendiert sind. Kombinieren Sie die Reagenzien gemäß dem schriftlichen Protokoll. Vortexen Sie die Mischung 20 Sekunden lang; sie wird rosa.

Beachten Sie, dass die kommerziell verfügbaren Varianten von Typ-I-Kollagen unterschiedliche Auswirkungen auf Mischung, Verfestigung und Konsistenz haben. Stellen Sie das Röhrchen für einige Minuten zurück in den Eisbehälter, um die Lösung von Blasen zu befreien.

Der Typ-I-Kollagen wird nicht bestrahlt, da er sonst gelatinisieren würde. Hier verwenden wir ein Produkt, das aus Fischhaut gewonnen wird. Bevor die Mischung erstarrt, die Mischung vorsichtig in die Form in der Kulturplatte gießen.

Jede Form enthält etwa ein Milliliter der viskosen Flüssigkeit. Versuchen Sie, während dieses Vorgangs die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Bringen Sie die Platte mit den Konstruktformen vorsichtig in den Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Während die Mischung erstarrt, verändert sich ihre Farbe von dunkelrosa zu hellrosa, während die Form warmes Myoblasten-Medium auf 37 Grad Celsius erwärmt. Nach etwa einer halben Stunde Inkubation tauchen Sie jeden Gewebe-Konstrukt vorsichtig in das erwärmte Myoblasten-Medium ein und stellen die Platte zurück in den Inkubator. Wenn dieses Protokoll korrekt durchgeführt wurde, ist der Myoblasten-enthaltende Gewebe-Konstrukt bereit für die In-vivo-Implantation oder weitere Analysen.

Nach zwei Tagen der Inkubation haben wir Ihnen soeben gezeigt, wie man einen myogenen, gewebetechnisch hergestellten Konstrukt präpariert. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, daran zu denken, alle für die Konstrukt-Lösung erforderlichen Reagenzien auf Eis zu halten, um eine vorzeitige Verfestigung zu verhindern. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.