Live-Imaging von Dense-Core-Vesikel in Primary hippokampalen Neuronen

Live-Cell-Bildgebung ist besonders nützlich beim Studium der Dynamik des Organellen-Transports. Dieses Video stellt ein Verfahren zur Bildgebung von dichten Kernvesikeln in kultivierten hippokampalen Neuronen vor. Zunächst werden Transfektionskomplexe durch Mischen von D-N-A-M-E-M-Medium und dem Lipofektions-Transfektionsreagenz gewonnen.

Da hippocampale Neuronen auf umgedrehten Deckgläsern kultiviert werden, die einer glialen Monoschicht zugewandt sind, müssen diese Deckgläser umgedreht werden, um sie dem Transfektionsreagenz auszusetzen. Nach einer ausreichenden Inkubationszeit für die Expression von GFP-markierten Proteinen dichter Kernvesikel wird eine Abbildungskammer hergestellt. Die Aufnahme dichter Kern-ICALs in kultivierten Neuronen kann mittels Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden.

Dieses Protokoll ist flexibel und kann angepasst werden, um andere Organellen wie Mitochondrien, Endosomen und Peroxisomen abzubilden. Hallo, ich bin Michael Silverman, und herzlich willkommen in meinem Labor für zelluläre Neurowissenschaften an der Simon Fraser University. Wir interessieren uns dafür, wie Organellen sich in Nervenzellen bewegen.

Um diese Frage zu untersuchen, markieren wir membranumschlossene Organellen, insbesondere Vesikel mit dichtem Kern in kultivierten hippocampalen Neuronen. Und um Ihnen zu zeigen, wie wir dies tun, übergebe ich an David. Hallo, ich bin David aus dem Silverman-Labor.

Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren zur Live-Cell-Bildgebung von dichten Kern-Vesikeln und kultivierten Neuronen mittels Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie. Beginnen wir. Für die meisten Experimente verwenden wir Schalen mit kultivierten Ratten-Hippocampus-Neuronen, die mit einer Zelldichte von 250.000 Zellen pro Sechs-Zentimeter-Schale kultiviert wurden; für jede Transfektion beschriften wir zwei 1,5-Milliliter-Röhrchen, eines für das Plasmid-DNA und das andere für das Transfektionsreagenz.

In einem laminaren Luftstromschrank eine Mikrogramm Plasmid-DNA mit hundert Mikrolitern MEM in einem einzelnen Reagenzglas bei Raumtemperatur mischen; dabei sicherstellen, dass das MEM keine Zusatzstoffe enthält. Sechs Mikroliter Lipidreagenz mit hundert Mikrolitern MEM in einem anderen Reagenzglas kombinieren. Die gleiche Menge kann für eine Doppeltransfektion verwendet werden, auch wenn das Verhältnis von Lipid zu DNA in solchen Fällen halbiert wird.

Um die Haltbarkeit des Lipidreagenz zu bewahren, bewahren Sie es stets gekühlt oder in einem Kühlbehälter auf dem Laborpult auf und inkubieren Sie die Röhrchen fünf Minuten bei Raumtemperatur. Überführen Sie die DNA in MEM in das Lipidröhrchen und mischen Sie vorsichtig mit APE Next; anschließend 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach 25 Minuten fügen Sie 60 Mikroliter 50 Millimolar K-Neuraminsäure hinzu, um zytotoxische Schäden an den kultivierten Neuronen zu minimieren.

Da wir Neuronen auf der Unterseite von Deckgläsern kultivieren, die über einer GL-Monoschicht suspendiert sind, ist es notwendig, die Deckgläser umzudrehen und die Neuronen der Transfektionslösung auszusetzen. Drehen Sie das Deckglas vorsichtig mit sterilen Pinzetten „Fuß nach oben“. Ordnen Sie sie so an, dass sie sich nicht überlappen.

Vermeiden Sie es sorgfältig, die mit Neuronen beschichtete Oberfläche des Deckgläschens oder die mit ggl beschichtete Oberfläche der Petrischale zu berühren. Am Ende der 30-minütigen Inkubation entnehmen Sie etwa N 0,5 Milliliter Medium aus der 6-Zentimeter-Schale und mischen es vorsichtig mit der DNA im Reagenzglas. Geben Sie die DNA-Lösung zurück in die Schale, indem Sie sie gleichmäßig auf die Oberfläche des Mediums tropfen lassen.

Bewegen Sie die Schale vorsichtig hin und her in eine Richtung, achten Sie jedoch darauf, das Medium nicht aufzuquellen. Nach dem Mischen in einer Richtung anhalten und den Vorgang in senkrechter Richtung wiederholen, um die DNA-Lipofektionskomplexe gleichmäßig über die Schale zu verteilen. Inkubieren Sie 90 Minuten im Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.

Nach der Inkubation die Deckgläser mit der Unterseite nach unten umdrehen und so anordnen, dass sie sich nicht überlappen. Anschließend die Expression der DNA über die gewünschte Zeit weiterlaufen lassen, die typischerweise über Nacht bis zu 48 Stunden im Inkubator beträgt. Die Live-Bildgebung von GFP-markierten dichten Kernvesikeln in kultivierten hippocampalen Neuronen erfordert ein Fluoreszenzmikroskop, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist.

Eine Abbildungskammer mit einer Temperaturregelung und einer Objektivheizung wird benötigt. Die Kammer sollte keine offenen Anschlüsse enthalten, eine Modifikation, die bei der Bestellung der Kammer berücksichtigt werden kann. Als Nächstes schalten Sie die Mikroskopkamera, die Fluoreszenzlampe und die Software zur Bildaufnahme ein.

Schalten Sie die Stromzufuhr zur Kammerplattform und zu den Objektivheizungen ein. Dies ist auch der geeignete Zeitpunkt, um einen Tropfen Öl auf die Objektive aufzutragen. Bereiten Sie nun die beheizte Plattform und die Abbildungskammer vor.

Zur leichteren Handhabung. Kennzeichnen Sie eine Seite des Kammereinsatzes mit einem Permanentstift. Legen Sie den Kammereinsatz mit der Oberseite nach oben auf den Deckel einer 50-Milliliter-Röhrchen, der sich ideal als Halterung für die Kammer eignet.

Tragen Sie einen Fettfilm auf die Nut auf, die den an der Seite der mit „top“ beschrifteten Kammer befindlichen Durchbruch umgibt. Vermeiden Sie eine übermäßige Verwendung des Fetts, da es in die Kammer gelangen und den Beobachtungsbereich verkleinern könnte. Verwenden Sie Pinzette.

Befestigen Sie eine saubere, unbenutzte 18 cm große Deckglasplatte an der Oberseite der Kammer. Üben Sie sanften Druck auf die Ränder des Deckglases aus, um eine dichte Abdichtung in der vertieften Nut der Kammer zu erzielen. Drehen Sie die Kammer um und tragen Sie einen ähnlichen Fettreifen in die Nut auf der gegenüberliegenden oder unteren Seite der Kammer auf.

Übertragen Sie 750 Mikroliter Imaging-Medium in die Kammer. Dies ist eine überschüssige Menge, aber das Fett sollte verhindern, dass das Medium überläuft, und der Überschuss verhindert, dass Blasen eingeschlossen werden, wenn die mit Zellen bedeckte Deckglasplatte aufgebracht wird. Bewahren Sie die vorbereitete Kammer bis zur Verwendung im Zellkultur-Inkubator auf.

Längere Inkubationen, wie beispielsweise eine Stunde oder mehr, sollten vermieden werden, da das Bildgebungsmedium verdunsten und sich in seiner Zusammensetzung verändern wird. Für die endgültige Kammermontage zur Lebenszyklus-Bildgebung bringen Sie die vorbereitete Kammer und eine Schale mit transfizierten Deckgläsern aus dem Inkubator in die Gewebekulturhaube. Entfernen Sie mit sterilen Pinzetten vorsichtig ein Deckglas aus der Schale mit transfizierten Deckgläsern.

Berühren Sie dann die Kante der Deckglasplatte mit einem Kim-Tuch, um das Wachstumsmedium abzuziehen. Anschließend legen Sie die Deckglasplatte mit der Neuronenseite nach unten in die vorbereitete Kammer. Berühren Sie zuerst eine Seite der Deckglasplatte mit dem Fett und üben Sie Druck entlang der Ränder aus, um die Deckglasplatte flach anzubringen, ohne Blasen einzuschließen.

Es ist damit zu rechnen, dass überschüssiges Bildgebungsmedium austritt. Wischen Sie das überschüssige Bildgebungsmedium ab, achten Sie jedoch darauf, das Deckglas nicht aus seiner Position zu verschieben. Bewegen Sie die Kammer auf die vorgeheizte Heizplattform und befestigen Sie die Kammer dort. Anschließend übertragen Sie die Kammer auf die Mikroskopbühne, um Photobleichen und Phototoxizität zu reduzieren.

Stellen Sie die Lampe auf die minimale Intensität ein, die erforderlich ist, um die transfizierten Zellen zu finden. Suchen Sie nun eine Zelle von Interesse. Bei Verwendung eines Ölimmersionsobjektivs mit niedriger Vergrößerung, beispielsweise 40 x, ist es vorteilhaft, ein geplantes Suchmuster beizubehalten, um eine maximale Abdeckung des Deckgläschens sicherzustellen und redundante Bildaufnahmen zu vermeiden.

Sobald ein gewünschtes Feld lokalisiert wurde, wechseln Sie auf den Kanal des fluoreszenzmarkierten Proteins der Untersuchung. Wechseln Sie zu einem hochauflösenden Öl-Objektiv, beispielsweise 60- bis 100-facher Vergrößerung, und stellen Sie die Lampenintensität wieder auf eine hohe Stufe ein. Verwenden Sie die Stream-Aufnahme oder eine vergleichbare Funktion Ihrer Bildgebungssoftware, um die Dynamik des fluoreszenzmarkierten Proteins bei schnell bewegten Organellen aufzuzeichnen. Die Belichtungszeit und die Verzögerung zwischen den Einzelbelichtungen sollten minimiert werden, um Aufnahmen mit einer hohen Bildfrequenz zu erzeugen.

Ein fokaler Drift, der in der Bildschirmvorschau beobachtet wird, kann durch manuelle Fokusjustierung in Echtzeit korrigiert werden. Stellen Sie sicher, dass Sie ein Phasenbild und alle anderen erforderlichen Begleitbilder für die spätere Analyse und Präsentation aufnehmen. Speichern Sie alle Bilder, bevor Sie die Deckglasprobe weiter untersuchen und die nächste Aufnahme durchführen.

Üblicherweise gelten drei bis fünf Aufnahmen von einem Deckglas als erfolgreich, und die Deckgläser werden jeweils 30 bis 60 Minuten lang abgebildet. Dabei sollte allgemein die Phototoxizität hinsichtlich der Zellgesundheit berücksichtigt werden, da Transporter in geschädigten Zellen reduziert sein können. Beobachtungen an lebenden Zellen bestehen typischerweise aus Aufnahmen, auch bekannt als Bildstapel, die die Bewegung fluoreszenzmarkierter Organellen innerhalb des Sichtfeldes zeigen. Hier ist ein repräsentativer Film zum Transport dichter Kerne von iCal.

Die Farbe wurde zur einfacheren Beobachtung invertiert. Achten Sie auf die sich bewegenden Teilchen. CH-Diagramme sind Abbildungen, die die Teilchenbewegung veranschaulichen, indem sie Linienscans gegenüberstellen, wobei jeder Zeitpunkt durch eine Spalte im Diagramm dargestellt wird.

Diese Abbildung zeigt, wie zwei Teilchen, die sich in entgegengesetzte Richtungen bewegen, in einem CH-Diagramm dargestellt werden. Eine weitere Analyse von Chronogrammen kann Informationen über die Teilchenflussgeschwindigkeit, die Länge von Bewegungsabschnitten, Richtungsumkehrungen und stationäre Teilchen liefern. Hallo, wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Hochgeschwindigkeitsaufnahmen des Transportvorgangs von Dsco-Vesikeln in kultivierten Hippocampus-Neuronen aufnimmt.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Bestandteile der Abbildungskammer und der Plattform vorzuwärmen, um die Belastung der Zellen während ihres Transfers vom Inkubator auf die Mikroskopbühne zu verringern. Sie sollten schnell, aber sorgfältig arbeiten. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.