Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen

Dieses Verfahren beginnt mit der Vorbereitung einer Drosophila-Larve, die derart umgestülpt wird, dass die Oberfläche der Körperwandmuskulatur sowie assoziierte motorische Neuronen und Gliazellen freigelegt werden. Durch Kombination einer fluoreszierenden Färbung präsynaptischer Neuronenendigungen, der endogenen Expression von GFP und DS-Red, die gezielt auf gliale Zellmembranen und postsynaptische Muskelzellmembranen ausgerichtet ist, sowie der Visualisierung des parasyntaktischen Raums mithilfe fluoreszierender Farbstoffe lässt sich in einer lebenden Präparation ein klares Bild der strukturellen Veränderungen an der glialen neuromuskulären Verbindung beobachten. Hallo, ich bin D. Brink im ALS-Labor von Vanessa am Department für Zoologie der University of British Columbia. Heute zeige ich Ihnen eine Gewebepräparation sowie zwei Zellmarkierungstechniken zur Bildgebung von lebendem Drosophila-Larvengewebe mittels konfokaler Mikroskopie.

Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um Gliazellen an der Nerv-Muskel-Synapse zu untersuchen. Nun etwas völlig anderes: Die In-vitro-Gewebeprophylaxe beginnt mit der Stadieneinteilung der Larven. Dieses Verfahren wird an wandern­den Dritt­larven demonstriert, da sie groß und leicht zu dissezieren sind; verwenden Sie ausschließlich W3-Larven, die aktiv kriechen.

Als Nächstes reinigen Sie die Oberfläche der Larven mit einem sehr weichen Pinsel in einer Petrischale mit doppelt destilliertem Wasser. Die Reinigung der Larven ist wichtig, da sie eine bessere Optik bewirkt und außerdem die Bakterienmenge verringert. Nachdem die Larve gereinigt wurde, überführen Sie sie in eine kleine Petrischale mit drei Milliliter eiskaltem HL6 mit fünf Millimolar Glutamat.

Stellen Sie die Schale auf Eis, bis sich das Tier nicht mehr bewegt und sich entspannt hat, was gewöhnlich etwa zwei Minuten dauert. Sobald sich die Larve nicht mehr bewegt, können Sie die Gewebepräparation unter dem Stereomikroskop beginnen, wobei Sie die Feder-Schere in Ihrer dominanten Hand und die feinspitzige Pinzette halten. Mit der anderen Hand machen Sie mit der Schere eine kleine Öffnung in der Körperwand, um den Druck über die Körperwand auszugleichen, während Sie das Tier vorsichtig auf den Boden der Schale drücken.

Mit der Pinzette die hinteren beiden Segmente abschneiden und die Eingeweide entfernen. Ein Teil des Fettkörpers wird wahrscheinlich durch den Schnitt aus der Körperhöhle austreten. Auch dieses Gewebe entfernen.

Halten Sie die Larven vorsichtig mit der feinen Pinzette weiterhin gegen den Boden der Petrischale. Halten Sie mit der anderen Hand einen stumpfen Insektenpin der Größe Null und drücken Sie ihn gegen die Mundteile der Larven. Drücken Sie die Mundteile durch die Körperhöhle, als würden Sie eine Socke über die Faust nach außen stülpen.

Das Gewebe von der Innenseite nach außen sollte folgendermaßen aussehen. Mit den feinen chirurgischen Feder-Scheren wird der Fettkörper und die Tracheen von der Körperwand abpräpariert. Entfernen Sie so viel Fettkörper wie möglich.

Bemühen Sie sich sehr, die Tracheen nicht zu ziehen oder das Nervensystem zu durchtrennen. Das Zerreißen der Tracheen würde Löcher in der Muskulatur der Körperwand verursachen. Nach Abschluss der Dissektion sollte der Muskel durchscheinend und entspannt sein, nicht trüb oder verkrampft.

Wenn Sie den Muskel bei Raumtemperatur ohne Glutamat in HL 6 geben, zieht er sich wahrscheinlich rhythmisch zusammen. Da die motorischen Musterbildner im ZNS aktiv sind, neigt die intakte, nach außen gestülpte Körperwand dazu, sich entlang der dorsalen und ventralen Mittellinien zur Hälfte zusammenzufalten. Daher erhält man eine linke oder rechte Hemi-Tier-Präparation zur Visualisierung.

Schließlich wird das Gewebe mit einer überbrückten Deckglasanordnung auf einem Objektträger montiert. Die Verfahrensschritte zur Montage des Gewebes werden später gezeigt. Um mit der Markierung neuronaler Batons zu beginnen, pipettieren Sie 30 Mikroliter einer fluoreszenzmarkierten primären Anti-HRP-Antikörperlösung in HL6 und geben einen Tropfen auf eine Petrischale.

Als Nächstes tauchen Sie das mit der Innenseite nach außen gestülpte Körperwandpräparat in das Farbbad. Nach etwa fünf Minuten können Sie eine Markierung der Neuronenendigungen erkennen, züchten Sie jedoch für 10 bis 20 Minuten, um eine vollständige und intensive Färbung zu erzielen.

Um die überschüssige HRP-Markierung abzuwaschen, geben Sie das Gewebe für 10 bis 30 Sekunden bei Raumtemperatur in ein halbes Milliliter HL6. Nicht gebundene Farbstoffe waschen sich schnell ab, daher muss die Waschung weder lang noch intensiv sein. Das markierte Gewebe kann nun montiert und mittels Mikroskopie sichtbar gemacht werden.

Eine Abwandlung des soeben gezeigten Protokolls zur lebenden Antikörperfärbung besteht darin, ein fluoreszenzmarkiertes Dextrin zu verwenden, um flüssigkeitsgefüllte extrazelluläre Räume hervorzuheben. Um dieses Verfahren zu beginnen, verdünnen Sie die fluoreszenzmarkierte Dextrinfarbe in HL6 auf 0,001 Milligramm pro Milliliter. Möglicherweise müssen Sie die Dextrinkonzentration variieren, wenn es Ihnen nicht auf die exakte Zeitpunkte des Eintritts in den extrazellulären Raum ankommt.

Pipettieren Sie einen 20-Mikroliter-Tropfen Farbstoff auf ein überbrücktes Deckglas und überführen Sie die Gewebeprobe in das Farbbad. Falls das invertierte Gewebe nicht perfundiert werden muss oder das Volumen von HL6 klein gehalten werden soll, kann es auf einem doppelt überbrückten Objektträger montiert werden. Beginnen Sie damit, zwei quadratische 18-Millimeter-Deckgläser mit Sekundenkleber auf einen sehr sauberen Objektträger zu kleben.

Lassen Sie einen zwei Millimeter großen Abstand zwischen den Rändern der Deckgläser und zentrieren Sie die Lücke ungefähr in der Mitte des Objektträgers. Lassen Sie den Klebstoff vollständig trocknen, da er sonst einen Film über dem wässrigen Medium um Ihre Gewebeprobe herum bildet.

Als Nächstes geben Sie einen Tropfen von 30 µL HL sechs in den Spalt zwischen den Deckgläsern. Positionieren Sie das umgestülpte Gewebe in dem Tropfen HL sechs. Möglicherweise müssen Sie das Gewebe diagonal positionieren, wenn die Larve groß ist und Ihr Bildaufnahmesystem über eine begrenzte Pixelanordnung verfügt.

Tragen Sie eine kleine Menge Vaseline auf die Ränder eines dritten 18-Millimeter-Deckgläschens auf und legen Sie es mit der fetthaltigen Seite nach unten auf die beiden verklebten Deckgläser über dem Gewebe, und drücken Sie vorsichtig darauf. Hier sind die Ergebnisse unserer beiden Methoden zur akuten fluoreszenten Markierung der Innen-Außen-Larvenpräparation, die mit einem Spinning-Disc-Konfokalmikroskop gewonnen wurden. Die erste Aufnahme ist ein optischer Stapel eines glialen Nerv-Muskel-Synapsenbereichs mit lebenden, anti-HRP-markierten Bouton-Termini.

An der Oberfläche der Muskelzelle sind hell gefärbte neuronale Bouton-Typ-Terminale zu sehen, die künstlich blau dargestellt sind. In der Mitte des Bildstapels finden wir GFP-gefärbte gliale Fortsätze, die grün dargestellt sind, sowie blau mit HRP markierte Boutons. Umkreisend die Boutons, sind Querschnitte des taschenartigen SSR, des subsynaptischen Retikulums, sichtbar, die ebenfalls in der Bildmitte rot gefärbt sind, und tief im Stapel befinden sich das rot mit DS markierte SSR.

Die SSR sind die spezialisierten synaptischen Bereiche der Muskelzelle. Die BNS liegen in den Vertiefungen der Muskelzellen, ebenso wie einige Teile der grünen glialen Fortsätze. Die Fortsätze der Gliazellen fügen sich um die BNS und SSR herum ein, bedecken jedoch die Oberfläche der Synapse nicht wie eine Decke in den tiefsten Schichten des Stapels.

Wir finden grüne gliale Fortsätze und das rote SSR, jedoch nicht so viele Buton-Terminale. Außerdem können wir Querschnitte des motorischen Nervs finden, der den Muskel innerviert. Gliazellen umhüllen den motorischen Nerv, weshalb dieser ebenfalls grün ist.

Das zweite Ergebnis der akuten fluoreszenten Markierung der inside-out-Larvenpräparation ist die fluoreszierend markierte Synapse. Hier ist die Flüssigkeit im perisynaptischen Raum oder synaptischen Spalt rot markiert. In den oberflächennahen Schichten des optischen Stack-Bildes befindet sich eine Flüssigkeitsschicht aus rotem Dextrin-Farbstoff, und man kann erkennen, wo sie sich in den wellenförmigen Vertiefungen der Muskelplasmamembran ansammelt.

In tieferen Schichten des Stapels ist der fluoreszierende Dextrinfarbstoff in die synaptischen Spalten eingedrungen, kleine ringförmige, donutförmige Ansammlungen des Farbstoffs entstehen zwischen den Neuronenendigungen und den blau markierten SSR-Taschen. Dies ist die mit Farbstoff hervorgehobene synaptische Spalte. Die grüne gliale Lamelle verhindert nicht das Eindringen des Farbstoffs in die Spalte in den tieferen Schichten des Bildstapels.

Die auffälligsten Merkmale sind die SSR oder synaptische Region des Muskels, die in Blau markiert ist, sowie die flachen, grün gefärbten Fortsätze der Gliazellen. Ebenso erscheint die Glialhülle um die Nervenachsen in tieferen Schichten grün. Die Glialhülle scheint den Dextrin-Farbstoff auszuschließen.

Ich habe Ihnen soeben eine neuartige Methode gezeigt, um die gliale Nerv-Muskel-Synapse in einer umgestülpten Gewebepräparation von Drosophila-Larven sichtbar zu machen. Bei der Gewebepräparation ist es wichtig, stets behutsam mit dem Gewebe umzugehen und sicherzustellen, dass der Muskel entspannt ist und die peripheren Nerven nicht beschädigt werden. Abschließend möchte ich mit einem Zitat von Marx schließen.

Die Zeit vergeht wie ein Pfeil. Angst vergeht wie eine Banane.