Dissecting und Aufnahme von C. elegans neuromuskulären Synapse

Ein mit Sogar beschichteter Deckel, der hergestellt wird, indem ein Tropfen Sogar gleichmäßig auf dem Glas verteilt und über Nacht gehärtet wird, wird in die runde Vertiefung der vorgefertigten Ableitkammer platziert und mit Ableitlösung bedeckt. Ein Wurm, der in die Mitte gelegt wird, wird beginnend vom Kopf- oder Schwanzende aus an der Oberfläche der Sogar-Schicht fixiert, wobei der Kleber mithilfe einer Kleberpipette auf die dorsale Seite des Wurms aufgetragen wird. Sobald die Fixierung abgeschlossen ist, wird mit einer Glasnadel ein Schnitt neben der Vulva an der Grenzfläche zwischen Cuticula und Kleber erzeugt und in Richtung Kopf verlängert, nachdem die Eingeweide und Eier aus der Körperhöhle entfernt wurden.

Der Schnittrand des Einschnitts wird mit dem Kleber punktweise an das Sogar fixiert, wodurch der ventrale Nerv und die Körperwandmuskulatur freigelegt werden. Der ventrale mediale Muskel vor der Vulva wird abgedichtet und die stimulierende Elektrode stromaufwärts am Nervenstrang platziert. Hallo, ich bin Janet Richmond, außerordentliche Professorin an der Abteilung für Biowissenschaften an der University of Illinois Chicago.

Heute werde ich Ihnen eine Dissektionstechnik zeigen, die es uns ermöglicht, die neuromuskulären Junctionen des Seespaltens freizulegen, um elektrophysiologische Ableitungen durchzuführen. Mit diesem Präparat untersuchen wir die synaptische Übertragung.

Okay, fangen wir an. Bevor mit den Nematoden gearbeitet wird, müssen einige Geräte mindestens einen Tag vor dem Eingriff hergestellt werden. Dazu gehören eine Dissektions-Aufnahmekammer, mit S-Schild beschichtete Glasobjektträger, alte Pipetten, ein Kleberapplikator und eine Extraktionspipette.

Beginnen Sie mit dem Bau der Kammer. Schneiden Sie eine Platte aus Plexiglas mit einer Dicke von 1/16 Zoll so zu, dass sie der Mikroskopbühne entspricht. Verwenden Sie diese, um die Aufnahmen in der Mitte des Plexiglases durchzuführen.

Bohren Sie ein kreisförmiges Loch, das groß genug ist, um einen kreisförmigen Deckglaskleber mit einem Durchmesser von 22 Millimetern aufzunehmen. Befestigen Sie ein 48 mal 60 Millimeter großes Deckglas an der Unterseite der Kammer unterhalb des Lochs mithilfe eines Pellets aus niedrig schmelzendem Paraplack-Gewebeeinbettungswachs in jeder Ecke des Deckglases. Das Wachs wird schnell auf einer Heizplatte geschmolzen, wodurch nach dem Abkühlen eine dünne Wachsschicht zwischen dem Plexiglas und dem Deckglas entsteht. Schneiden Sie überschüssiges Wachs mit einer Klinge ab.

Der Deckel, der in die Kammer passt, ist ein 22 Millimeter großer S-Guard-beschichteter Deckgläser. Damit Sard funktioniert, muss es frisch gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt werden. Nach der Zubereitung wird ein kleiner Tropfen Sard auf jedes Deckglas gegeben und mit einer Klinge verteilt, um eine gleichmäßige Oberfläche zu erzeugen.

Die beschichteten Deckgläser werden anschließend in abgedeckte Behälter gegeben und über Nacht in einen 65 °C heißen Ofen gestellt, um sie auszuhärten. Am nächsten Tag sind sie bereit für die Dissektion im weiteren Verlauf des Protokolls. Es werden Silikatglas-Pipetten mit einem Außendurchmesser von 1 mm benötigt, die so gezogen sind, dass ihre Spitze einen Widerstand von etwa 4 MΩ aufweist; daher ist es ratsam, eine entsprechende Reserve bereitzuhalten.

Siehe die JoVE-Publikation zur Herstellung von Patches, Pipetten und scharfen Elektroden mit einem programmierbaren Polarisator von Miriam Goodman. Für die technischen Details zur Durchführung der Elektrophysiologie muss der Fadenwurm an Ort und Stelle verklebt werden. Dazu ist ein Klebeapplikator erforderlich.

Der Klebeapplikator ist einfach ein zwei Millimeter langer Kunststoffschlauch mit einem Innendurchmesser von einem Millimeter. Ein Ende des Schlauchs wird mit dem Mund gehalten. Es kann mit einem Mundstück ausgestattet werden, und das andere Ende des Schlauchs hält eine ein Millimeter große Pipette, die mit Klebstoff gefüllt ist.

Eine spezialisierte Extraktionspipette wird ebenfalls während der Dissektion verwendet. Diese besteht aus einem Schlauch und einer Pipette, genau wie der Klebstoffapplikator, mit dem Unterschied, dass die Pipette leicht zurückgebrochen ist, um die Eier und das Viscerum aufzunehmen. Beginnen Sie damit, eine Wachslinie entlang des Randes der Kammer zu ziehen.

Drücken Sie nun einen mit S-Guard beschichteten Deckgläsern Syl-Guard nach oben gerichtet auf. Die Wachsschicht fixiert das Deckglas und verhindert, dass die Aufzeichnungslösung unter das Deckglas sickert und es während der Dissektion und Aufzeichnung löst. Anschließend wird die Kammer mit extrazellulärer Ableitungslösung gefüllt. Lesen Sie den begleitenden Text zur Zusammensetzung, nachdem die Kammer vorbereitet wurde.

Unter Verwendung eines Nematoden-Picks, um mehrere Nematoden in die Lösung zu geben. Mit etwas Übung können die schwimmenden Nematoden fixiert werden, ohne dass zusätzliche Verfahren zur Bewegungsverhinderung erforderlich sind. Füllen Sie einen aus einer PCR-Kappe bestehenden Klebebehälter, der in Wachs oder Modellierknete befestigt ist, mit einer Arbeitslösung des Sano-Acrylklebers, um damit arbeiten zu können.

Beenden Sie den Bau des Klebeapplikators, indem Sie Ihre Aufzeichnungspipette an dessen Ende befestigen. Füllen Sie anschließend unter dem Dissektionsmikroskop den Klebeapplikator durch Mundabsaugung. Das Anbringen des Klebstoffs an einen Nematoden ist schwierig und erfordert Übung, da der Klebstoff beim Kontakt mit der extrazellulären Ableitungslösung polymerisiert.

Um dies zu beheben, muss ein gleichmäßiger Abfluss des Klebstoffs gewährleistet werden, da er sonst aushärtet und die Pipette verstopft. Falls die Pipette verstopft ist, kann manchmal eine Entblockung erreicht werden, indem die Spitze vorsichtig auf dem Deckglas angetippt wird. Üben Sie den Umgang mit dem Klebstoff.

Und wenn Sie Ihren Namen mit Klebstoff auf der Silikonabdeckung schreiben können, sind Sie vermutlich bereit, die Nematodenhaut zu verkleben, um einen Nematoden zu fixieren. Wählen Sie zunächst einen Wurm nahe dem Zentrum der Kammer, wo genügend Platz zum Arbeiten vorhanden ist. Bringen Sie anschließend eine kleine Menge Klebstoff entweder am Kopf oder am Schwanz des Nematoden an und ziehen Sie den Nematoden schnell auf die Oberfläche der Silikonabdeckung herunter.

Tragen Sie dann einen Klebestreifen entlang der dorsalen Kante des Nematoden-Cuticula auf. Dadurch wird der Nematode in eine C-Form gezwungen, wobei die Vulva nach innen zeigt. Eventuelle Lücken in dieser Klebelinie sollten für eine maximale Adhäsion zwischen Nematode und Syl-Schutz geschlossen werden.

Dieser Vorgang ist schwierig und es kann hilfreich sein, an hypo-motilen Mutanten zu üben. Wie auf 31 befindet sich direkt rechts eine Birne. Jetzt werde ich dieses Präparat drehen und dann die Glasnadel einführen, um den Einschnitt zu beginnen. Um den Einschnitt in der Cuticula vorzunehmen, wechseln Sie zu einer manuell gehaltenen Dissektionspipette.

Diese Pipette muss schärfer sein als die Pipetten für die Klebstoff-Aufnahme und bei höchster Vergrößerung einen kurzen, stabilen Schaft aufweisen. Am Stereomikroskop wird die Pipette parallel zur Längsachse des Nematoden ausgerichtet und die Spitze in der Nähe der Vulva an der Grenzfläche zwischen Cuticula und Klebstoff eingeführt. Dieser Schnitt setzt den hydrostatischen Druck des Nematoden frei, wodurch Eier und Darm durch die Schnittstelle herausgedrückt werden.

Setzen Sie den Schnitt der Cuticula in Richtung des Kopfes des Nematoden mit einer schneidenden Bewegung, die dem Öffnen eines Briefes ähnelt, fort, bis Sie die Speiseröhre erreichen. Wechseln Sie nun zur Extraktionspipette, um die inneren Organe des Nematoden abzusaugen. Nachdem die Schnittstelle freigelegt ist, behält die geöffnete Cuticula ihre zylindrische Form bei.

Als Nächstes nehmen Sie eine neue Klebepipette. Verwenden Sie sie, um das Cuticula-Stück am Rand des Einschnitts durch Punktverklebung auf der Sylgard-Oberfläche zu befestigen. In diesem Stadium ist es wichtig, minimale Klebestellen zu verwenden, um die Nervenstränge (njs) nicht zu beschädigen oder zu verdecken.

Das ventrale Nervenstrang und die Muskulatur der Körperwand sind nun freigelegt, jedoch muss noch die Basalmembran, die die neuromuskuläre Endplatte bedeckt, entfernt werden. Um dies zu erreichen, saugen Sie die extrazelluläre Ableitungslösung aus der Kammer ab und geben eine extrazelluläre Ableitungslösung mit 0,4 Milligramm pro Milliliter hinzu. Nach 10 bis 20 Sekunden entfernen Sie die Kollagenase und spülen das Präparat mehrmals mit frischer Ableitungslösung aus.

Der Nematode ist nun bereit für elektrophysiologische Ableitungen. Am NMJ-Positionieren Sie die Aufzeichnungskammer auf dem Objekttisch eines aufrechten Mikroskops mit einem 10-fachen Objektiv, um den Nematoden zu zentrieren. Wechseln Sie dann zu einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv mit DIC-Optik und prüfen Sie, ob die Körperwandmuskulatur und der Nervenstrang intakt sind. Positionieren Sie den Nematoden horizontal, sodass die Elektroden sowohl von der linken als auch von der rechten Seite eingeführt werden können.

Typischerweise führen wir die Patch-Clamp-Messung an der ventralen mittleren Körperregion durch, während sich Muskeln im Inneren der Vulva befinden, jedoch können sowohl die Muskeln an der dorsalen als auch an der ventralen Seite des Wurms problemlos geclamt werden, zusammen mit einigen Neuronen, die wie Halbkreise direkt an den Muskeln anliegen. Führen Sie nun die Patch-Clamp-Messung am Muskel unter Verwendung standardmäßiger Patch-Clamp-Techniken durch, um eine Gigaseal zu erhalten. Nach unserer Erfahrung eignen sich Aufzeichnungselektroden mit einem Widerstand von etwa vier Megohm gut für die Ganzzell-Spannungsclamp-Aufzeichnung.

Erhöhen Sie die Saugkraft und zappen Sie die Membran, bis der Giga-Seal platzt. Wir haben über einen Widerstand von vier Mega gesprochen. Wenn Sie dort hinschauen, ja, das zeigt 4,9 Mega.

Es ist größer, normal. Es liegt im Bereich, den wir verwenden. Okay. Ja. Jetzt werden wir versuchen, groß vorzugehen, also was dann?

Was? Wir wollen, dass es ganz nach unten kommt. Ja. Verstanden. Yay.

Bei einer guten Aufnahme weisen die Körperwandmuskeln von adulten Wildtyp-Nematoden typischerweise eine Zellmembrankapazität von etwa 70 Picofarad auf und können mindestens 10 Minuten lang bei einem Haltepotential von minus 60 Millivolt mit minimalen Haltestromwerten, etwa 50 Pikroampere, stabil aufgezeichnet werden. Sobald eine Muskelzelle angeschlossen wurde, erzeugen Reize von einer zweiten Elektrode, lichtaktivierten Kanälen, Rodin oder die Zugabe einer hyperosmotischen Lösung alle messbare Antworten. Um eine elektrisch hervorgerufene Antwort auszulösen, platzieren wir typischerweise eine Stimulations-Elektrode, die extrazelluläre Lösung enthält, am ventralen Nervenstrang innerhalb der angeschlossenen Muskulatur.

Bei dieser loose-patch-Konfiguration sind Stromimpulse von ein bis zwei Millisekunden zwischen 10 und 40 Volt erforderlich. Leider wird nach einigen evozierten Antworten das Nervenstrang irreversibel geschädigt, und aus bislang unbekannten Gründen können mit dieser Konfiguration ausschließlich cholinerge evozierte Antworten hervorgerufen werden. Alternativ können Nematoden, die einen lichtaktivierten Kanal mittels eines Transgens in unterschiedlichen neuronalen Populationen exprimieren, zur Auslösung der Freisetzung verwendet werden.

Beachten Sie zur Vorbereitung dieser Methode, dass die für diese Anwendung verwendeten Nematoden auf mit Retinol angereicherten Bakterien kultiviert werden müssen. Bei dieser Vorbereitung wird eine leistungsstarke 470 Nanometer LED, die durch einen GFP-Anregungsfilter von 450 bis 490 Nanometern gefiltert ist, verwendet, um wiederholt den Kanalopsin zu aktivieren, wodurch die Freisetzung verschiedener Neurotransmitter ausgelöst wird, abhängig davon, welche Zelltypen den Kanal exprimieren. Die letzte zu betrachtende Technik kann verwendet werden, um die Größe des leicht freisetzenden Pools synaptischer Vesikel von mehreren Neuronen auf den aufgezeichneten Muskel zu messen.

Dies wird erreicht, indem für ein bis drei Sekunden eine hyperosmotische extrazelluläre Lösung durch Druckimpulse auf den präparierten Muskel aufgebracht wird. Das Ergebnis ist eine Serie asynchroner postsynaptischer Ereignisse. Ganzzell-Voltage-clamp-Aufnahmen der Körperwandmuskulatur sind für jede der oben beschriebenen drei Stimulationsprotokolle dargestellt: elektrisch hervorgerufene, lichtinduzierte und hyperosmotische Antworten.

In allen Fällen wird der ventrale mediale Körperwandmuskel bei minus 60 Millivolt geklemmt. Wildtyp-Muskelzellen weisen typischerweise hohe Raten endogener, nach innen gerichteter, miniaturhafter synaptischer Ströme auf. In unseren Standard-Aufzeichnungslösungen verursacht eine zwei Millisekunden dauernde Depolarisation des vorderen ventralen Nervenstrangs eine synchrone Freisetzung aus mehreren Synapsen, was zu einer großen evozierten Antwort von etwa zwei bis 2,5 Nanoampere führt.

Bei Wildtyp-Würmern zeigen repräsentative Spuren rechts neben den Wildtyp-Spuren in A und B die synaptische Freisetzung bei einem stark unkoordinierten Mutanten. In Panel C wird eine lichtinduzierte Antwort aus der neuromuskulären Verbindung eines Wildtyp-Wurms dargestellt, der Channelrhodopsin in cholinergen Neuronen exprimiert. Ein zwei Millisekunden langer Lichtimpuls erzeugt typischerweise eine Antwort von 1,5 bis 1,8 Nanoampere. Die Druckeinspritzung von 850 Milliosmol hyperosmotischer Kochsalzlösung auf den Muskel für eine Sekunde führt zu einem asynchronen Schauer von miniaturhaften synaptischen Strömen, die den leicht freisetzenden Pool an Vesikeln repräsentieren.

Ich habe Ihnen soeben die Dissektionstechnik gezeigt, die wir verwenden, um die neuromuskulären Junctionen von *Elysia sea* freizulegen und elektrophysiologische Ableitungen durchzuführen. Es ist wichtig zu bedenken, dass diese Technik anspruchsvoll ist und es wahrscheinlich Monate dauern wird, bis Sie sie beherrschen. Sobald sie jedoch erlernt ist, ist es wie Fahrradfahren.

Die Techniken werden Ihnen erhalten bleiben, und je häufiger Sie sie anwenden, desto schneller und zuverlässiger wird die Vorbereitung. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.