Name: Antigen CD4 + הדמיה ספציפיות תאים T באמצעות MHC Class II Tetramers (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 42 s
Description: למד טיהור והרחבה של תאי T CD4+ ספציפיים לאנטיגן מדם היקפי והדמיה שלהם באמצעות טטרמרים מסוג MHC Class II. שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של תאי T באמצעות ציטומטריית זרימה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים דיק פולי ליי קימבל עבור תפקידי מפתח שלהם לצלם ווידאו הייצור.

1. דם היקפיים mononuclear תאים (PBMC) בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג דגימת דם - הדם צריך להיות שנאספו מזרקים או מבחנות דם קרוש אנטי עם הפרין (01:50 יחס) כדי למנוע קרישה. מצפים לתשואה של כ - 1 × 10 6 PBMC לכל מ"ל של דם - כ -40% אשר יהיה חיובי CD4 (CD4 +) ותאי T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot הדם לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל, 25 מ"ל לכל צינור. אם יש דם מופרדים, מערבבים בעדינות לפני aliquoting להפיץ את הפלזמה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף PBS, מביא את סך נפח 40 מ"ל ו ביסוד ידי ציור של עד 11 מ"ל Ficoll, החדרת צינור לתוך הדם, בזהירות הסרת סיוע pipet מן פיפטה. Ficoll יהיה לאט לנקז לתוך החלק התחתון של הצינור. לאחר הרמה יש להשוות, לאט להסיר את פיפטה מהצינור דם וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי צינורות הדם לעבור את המכלים Aerosolve. לסגור היטב את המכלים ו צנטריפוגות ב × 900 גרם במשך 20 דקות - לא בלם. זה קריטי, כי לא בלם מוחל בסוף הסיבוב הזה כמו כוח הבלימה יפריע את שכבת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי ספין, PBMCs צריך ליצור שכבה לבנה ברורים בין פלזמה הצהוב (לעיל) ficoll שקוף (להלן). בעדינות יגרוף כדוריות דם לבנות שכבה באמצעות פיפטה העברה להעביר צינור חדש. חלק פלזמה ו Ficoll ניתן משוכות עם PBMCs, אבל למנוע עריכת כל שכבת תאים אדומים. בדרך כלל שני צינורות דם יכול להיות משולב לתוך צינור תא אחד בשלב זה להגדיל את גודל גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף PBS, מביא את סך נפח 50 מ"ל ו - 500 צנטריפוגות ב × גרם במשך 15 דקות - בלם נמוך בלוני aerosolve. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב נוזלים באמצעות פיפטה פסטר, נזהרת שלא להפריע גלולה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו עם חיץ המוליטית ידי הוספת 5-6 מ"ל לצינור כל ערבוב בעדינות כדי להסיר גושים. דגירה של לא יותר מ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף PBS, מביא את סך נפח 50 מ"ל ו - 230 צנטריפוגות ב × גרם במשך 10 דקות - בלם נמוכה. בלוני Aerosolve אין עוד צורך אלה ספינים איטי יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים: נוזל לשאוב בעזרת פיפטה פסטר, למלא צינור עם PBS ו צנטריפוגות ב × 230 גרם במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השלב הסופי לשטוף, להסיר aliquot מחדש מושעה תאים, לדלל עם trypan כחול, לספור באמצעות hemocytometer. זה לספור תא יכתיבו את הכרכים מגיב המשמשים את הצעד ההפרדה תא T. </li></ol> 2. הפרדה מסוג CD4 + T * תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב נוזלים להוסיף למאגר רץ להביא את הנפח הכולל של עד 40 UL לכל 10 מיליון תאים. בדרך כלל זה דורש 30 UL של חיץ בתוספת נפח שיורית גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה זו נפח צינור חרוטי 15 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף קוקטייל נוגדנים מתיק CD4 הבידוד - 10 UL לכל 10 מיליון תאים, צינור כובע, ומניחים על קרח במשך 10 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת הצינור מן הקרח, להסיר את המכסה, ולהוסיף 30 UL של הפעלת המאגר לכל 10 מיליון תאים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חרוזים מגנטיים מתיק CD4 הבידוד - 20 UL לכל 10 מיליון תאים, צינור כובע, ומניחים על קרח במשך 15 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת עשרה כרכים של הפעלת המאגר לכבס צנטריפוגות ב × 230 גרם במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הסיבוב, להגדיר את מגנט צינור פוליפרופילן 5 מ"ל העבודה שלך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב נוזל מתוך התא גלולה, להוסיף 2 מ"ל חיץ ריצה להסיר גושים בעזרת פיפטה להעביר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה להעביר אותו, להעביר תאים לתוך הצינור 5 מ"ל ו - דגירה של המגנט במשך 15 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות למזוג CD4 + חלק התא לתוך שפופרת 15 מ"ל מסומן על ידי המגנט היפוך וריקון כל אבל הטיפה האחרונה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף עוד 2 מ"ל של ריצה חיץ צינור 5 מ"ל ולהסיר מגנט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות ולשטוף את CD4 תאים את הצדדים של הצינור להעביר צינור 15 מ"ל מסומנים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ"ל בינוני T לתא צינור אחד, להסיר aliquots עבור ספירת התאים צנטריפוגות ב × 230 גרם במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל aliquots תא עם trypan כחול לספור באמצעות hemocytometer. ספירת תאים אלה יכתיבו את מספר בארות המשמשים צעד התרבות הרחבה. </li></ol> * לחילופין, MACS עמודות וחרוזים (Miltenyi BIOTEC), מפריד תא AutoMACS (Miltenyi BIOTEC), או מפריד Robosep תאים (Cell Technologies גזע) ניתן להשתמש בו על פי הוראות מייצרת במקום צעדים 2.2-2.11. 3. בתרבות הרחבה חוץ גופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב נוזל מסוג CD4 + ו-CD4 ו - תא כדורי, המבוססת על ספירת התאים, להוסיף מדיה ותרבות (בדרך כלל 3,000,000 תאים מסוג CD4 + לכל מ"ל ו - 10,000,000 CD4 תאים מ"ל לכל עובד היטב עבור הגדרת התרבות). התרבות דורשת הרחבה 3-5000000 CD4 תאים לכל היטב 2-3000000 CD4 + תאים לכל היטב בהיקף כולל של 1 מ"ל תרבות התקשורת בצלחת 48 תרבות היטב. בדרך כלל, תאים מסוג CD4 + הם מגבילים את האוכלוסייה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, מקרינים CD4 תאים (5000 ראד ים). Aliquot CD4 תאים למספר המתאים של בארות בצלחת 48 היטב על ידי הוספת 300-500 μL זה. מניחים את צלחת 37 ° C בחממה במשך שעה 1. חסיד CD4 תאים ישמש התאים המציגים אנטיגנים בתרבות הרחבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת מן החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות על ידי הוספת 500 UL התקשורת טריים pipetting בעדינות מעלה ומטה 12-20 פעמים באמצעות pipet העברה והסרה של כל הנוזל. לשטוף את זה ישאיר שכבת התאים המציגים אנטיגנים חסיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הכביסה תושלם, להוסיף מדיה מספיק רק כדי להרטיב את החלק התחתון של כל טוב (בערך 100 UL) - אחרת התאים חסיד יתייבש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2-3000000 CD4 + התאים היטב כל אחד. במידת הצורך, להוסיף מדיה נוסף כדי להביא את הנפח הכולל של כל מ"ל עד 1 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הפפטיד הרצוי היטב כל אחד. ריכוז אופייני לגירוי הוא 10 UG / mL הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת בתוך 37 ° C החממה למשך 7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 7 ימים, להוסיף 50 UL Hemogen של IL-2 (או שווה ערך, כגון רקומביננטי IL-2, 10 IU / mL) זה טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום אחד לאחר מכן, לפקח גדילת התאים באמצעות מיקרוסקופ. פיד בארות שעדיין אינן ומחוברות על ידי הסרת מחצית התקשורת, והוסיף התקשורת טריים 50 UL של IL-2. פיצול בארות ומחוברות על ידי resuspending התאים, העברת מחצית התאים היטב ריק, הוספת מדיה טריים 50 UL של IL-2. חזור התאים חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים הרחבת יהיה מוכן tetramer לאחר 13-15 ימים של תרבות. </li></ol> 4. לדמיין שתאי T על ידי מכתים tetramer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישה או להרכיב tetramers כדי להתאים את הפפטיד / MHC השילובים המתאימים מגורה CD4 + T תאים (ראה דיון על מקורות tetramer ריאגנטים). Tetramers יש ~ 0.5 מ"ג / מ"ל ​​פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת של חממה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לצייר את חצי התקשורת מכל טוב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת aliquot של תאים מכל טוב - בדרך כלל 75 μL או כ -50,000 תאים - לתוך צינור קלקר 5 מ"ל FACS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף tetramer - בדרך כלל 1 μL לפי נפח 50 סך μL - ו - מקום 37 ° C חממה 1-2 שעות. כמו כן, מומלץ להכתים aliquot השני של התאים היטב עם כל tetramer תואמים כביקורת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים עם תווית אנטי CD3, אנטי CD4, אנטי CD25 נוגדנים על ידי הוספת 3-10 μL של נוגדן זה. סמנים נוספים נוגדן או אלטרנטיבה ניתן להשתמש. עם זאת, אין להשתמש נוגדנים PE שכותרתו מאז הערוץ הזה צריך להיות שמור tetramers. בשלב זה, אף אחד צבע התווית או אלוטיפ שולטת באמצעות תאים עודפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים נוגדן הנקרא עבור 15-30 דקות על הקרח או 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל צינור עם 0.5-2 מ"ל ריצה חיץ צנטריפוגות ב × 230 גרם במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות למזוג נוזל מתוך צינורות FACS. אחסן את כל צינורות במיכל מכוסה (רצוי על קרח) לניתוח FACS הבאים. </li></ol> 5. Cytometer תזרים רכישת וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את Cytometer זרימה באמצעות חרוזים התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקת הגדרות המכשיר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתאי לשלוט בלא כתם או פקדים אלוטיפ, להתאים את המיקום של השער הלימפוציטים קיימא (FSC מול SSC). הסרה אוטומטית של הקרינה מן כל הערוצים על ידי מרכוז של האוכלוסייה (על ידי שינוי הגדרות רווח) להלן בעשור הראשון על כל ציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש יחיד מלאה שפופרות צבע, מרכז אירועים בתוך הרביעים הנכון עבור כל צבע בודד (על ידי שינוי הגדרות פיצוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם הסתגלות קנס של הגדרות המכשיר באמצעות צינור מוכתם tetramer רלוונטי. בהגדרות במיוחד עבור ערוץ PE ייתכן שיהיה צורך הסתגלות כי tetramers לעתים קרובות כתם בהיר יותר לשלוט נוגדן. Tetramer רלוונטי צריך כתם &lt;0.5% CD4 + תאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת את הנתונים עבור כל שפופרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף אירועים עבור כל שפופרת מדגם צינור בקרה שלילית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת ולשמור לפחות 20,000 אירועים Analysys </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני ייבוא ​​קבצים לתוך תוכנת ניתוח FACS (למשל תוכנה CellQuest, WinMDI, או FlowJo). התחל את הניתוח שלך באמצעות צינור מוכתם באמצעות tetramer רלוונטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש FSC מול SSC וצייר השער סביב לימפוציטים חיים (איור 1, פאנל למעלה משמאל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש מול CD3 CD4 (מגודרת להראות לימפוציטים לחיות בלבד) ולהסיק השערים סביב + CD3 ו CD4 + אוכלוסיות (1 איור הפאנל הימנית העליונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD4 מגרש מול Tetramer (מגודרת להראות CD3 לימפוציטים + בלבד) ולהגדיר את גבולות ברבע כך CD4 + + Tetramer האוכלוסייה הוא פחות מ 0.5% (1 איור הפאנל התחתון משמאל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש CD25 לעומת Tetramer (מגודרת להראות לימפוציטים מסוג CD4 + בלבד) ולהגדיר את גבולות ברבע כך + CD25 האוכלוסייה Tetramer + הוא פחות מ -0.5% (1 איור הפאנל התחתון מימין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של כל דוגמיות מבלי לשנות את השערים. </li></ol></li></ol>% 1167/JOVE 20FIGURE% 201.png "alt =" איור 1 "רוחב =" 600 "גובה =" 342 "/&gt; באיור 1. הנציג שלילי tetramer לשלוט בתוצאות מכתים. הפאנל השמאלי העליון מראה קדימה פסוקים פיזור בצד פיזור השער גודל הלימפוציטים (R1). הפאנל הימנית העליונה היא מגודרת עבור R1 ומראה נמלים CD4 לעומת אנטי CD3 ואת CD3 + (R2) ו CD4 + (R3) שערים. לוח השמאלית התחתונה היא מגודרת עבור R2 ומראה אנטי CD4 לעומת tetramer. הפאנל הימנית התחתונה היא מגודרת עבור R3 ומראה אנטי CD25 לעומת tetramer. הרביעים עבור שתי חלקות tetramer נקבעו על 0.5%. 6. נציג תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים tetramer חיובית צריכה להיות ברורה בקרב האוכלוסייה CD4 + מורחבת התאים (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Tetramer חיובי בדרך כלל CD25 + CD4 גבוה ולעיתים קרובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרים מסוימים, שילוב MHC / פפטיד יכול לתת רקע מכתים (לעיתים קרובות נגרמת על ידי הפפטיד עם מסיסות עניים). מכתים רקע כאלה ניתן להבדיל בין חיובי נכון כי "חיובית כוזבת" התאים אינם אוכלוסיה שונים אחד על אחד מול Tetramer CD4 או CD25 לעומת חלקות Tetramer (איור 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%202.png" alt="" width="600" height="362"> איור 2. הנציג חיובי מכתים תוצאות tetramer. פריסת פאנל אסטרטגיה gating זהים באיור 1. התאים tetramer חיובי להופיע אוכלוסייה שונות CD4 גבוה על אנטי CD4 מול פאנל tetramer ואוכלוסייה ברורים + CD25 על אנטי CD25 מול פאנל tetramer. <img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%203.png" alt="איור 3" width="600" height="336"> איור 3. נציג "חיובית כוזבת" מכתים תוצאות tetramer. פריסת פאנל אסטרטגיה gating זהים באיור 1. אנטי CD4 מול פאנל tetramer מראה ברור מכתים "תלוליות". אנטי CD25 לעומת tetramer גם מראה מכתים "תלוליות", ללא מגמה ברורה כלפי להיות CD25 +.

<ol><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4%2B+T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer-guided+epitope+mapping%3A+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4%2B+T+cell+epitopes+from+complex+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).</li>
</ol>

הבנת התפקיד של תאים מסוג CD4 + T בחסינות חשוב ביסודו. עם זאת, אנטיגן ספציפי CD4 + T תאים יכול להיות קשה לזהות ולבודד בשיטות מסורתיות. לעומת זאת, בכיתה tetramers MHC II לאפשר הדמיה ישירה של תאים מסוג CD4 + T עם סגוליות את האנטיגן הרצוי. וידאו זה מדגים את הבידוד, טיהור, וכן הגברה במבחנה של תאים מסוג CD4 + T ו להדמיה הבאים שלהם באמצעות tetramers. מחלקה Tetramers השנייה הם חלבון פלואורסצנטי conjugates המורכב מסיסים biotinylated בכיתה השנייה α / β הדימרים מצומדות סביב ליבה פלורסנט stre...

<table><tbody><tr><td>מCב בטיחות ביולוגית עם זרימה למינרית Class 2</td><td>ציוד</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>1200</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>מבחנה קונית 50 mL</td><td>ציוד</td><td>VWR international</td><td>47747-182</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>1X PBS (ללא Ca/Mg)</td><td>ריאגנט</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Ficoll-paque PLUS</td><td>ריאגנט</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>עטוף בנייר אלומיניום להגנה מאור</td></tr><tr><td>Pipet Aid XP</td><td>ציוד</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>פיפט 10 mL</td><td>ציוד</td><td>Corning</td><td>CLS4492</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>מכלי Aerosolve</td><td>ציוד</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>359481</td><td>עם מבטי 50 mL</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>ציוד</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>GS-6R</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>פיפטות העברה</td><td>ציוד</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>202-20S</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>פיפטות פסטור</td><td>ציוד</td><td>VWR international</td><td>14672-200</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>בופר המוליטי</td><td>ריאגנט</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA</td></tr><tr><td>טריפאן בלו (Trypan blue)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>0.2% ב-PBS</td></tr><tr><td>המ ציטומטר</td><td>ציוד</td><td>VWR international</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>מבחנה קונית 15 mL</td><td>ציוד</td><td>VWR international</td><td>05-527-90</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>בופר ריצה</td><td>ריאגנט</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA</td></tr><tr><td>ערכה לבידוד תאי MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II</td><td>ריאגנט</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-155</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>מגנט EasySep&amp;#174;</td><td>ציוד</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>מבחנת פוליפרופילן 5 mL</td><td>ציוד</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>22400-089</td><td>עם 25 mM HEPES</td></tr><tr><td>סרום אנושי מאוחד</td><td>ריאגנט</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>נשאב מתורמים בריאים, עבר אינאקטיבציה בחום וסינון</td></tr><tr><td>פנסט repression (Pen Strep)</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>1570-063</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>מסנן מכס בקבוק 500mL, 0.22 מיקרון</td><td>ציוד</td><td>Nalge Nunc international</td><td>595-3320</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>פלטה בעלת 48 בארות</td><td>ציוד</td><td>Costar</td><td>3548</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>אינקובטור 37&amp;#x00B0;C CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>ציוד</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>פפטיד סינתטי 20 mg/mL</td><td>ריאגנט</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>סינתזה בהזמנה מכל ספק פפטידים</td></tr><tr><td>מבחנת FACS 5 mL</td><td>ציוד</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>פוליסטירן</td></tr><tr><td>טטראמר Class II טעון פפטיד (כמתואר)</td><td>ריאגנט</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>הוכן על ידי ה-BRI tetramer core</td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>ריאגנט</td><td>BD Biosciences</td><td>347344</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>ריאגנט</td><td>eBioscience</td><td>17-0049-73</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Anti-CD25</td><td>ריאגנט</td><td>eBioscience</td><td>11-0259-73</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה Facs Calibur</td><td>ציוד</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>או שווה ערך</td></tr></tbody></table>

antigen cd4 + הדמיה ספציפיות תאים t באמצעות mhc class ii tetramers

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

סרן מורכב histocompatibility (MHC) בכיתה tetramers השנייה לאפשר להדמיה ישירה של אנטיגן ספציפי CD4 + T תאים על ידי cytometry הזרימה. שיטה זו מסתמכת על האינטראקציה בין פפטיד ספציפי מאוד טעון MHC לבין הקולטן המתאים T-cell. למרות הזיקה של מולקולת MHC / פפטיד בודד הוא נמוך, cross-linking קומפלקסים MHC / פפטיד עם streptavidin מגביר את הלהיטות של האינטראקציה, המאפשרת את השימוש בהם כמו מכתים ריאגנטים. בגלל בתדרים נמוכים יחסית של תאים מסוג CD4 + T (~ 1 ב 300.000 עבור סגוליות אחת) assay זה מנצל בשלב הגברה חוץ גופית כדי להגדיל את סף של גילוי. תאים mononuclear הם מטוהרים מן הדם ההיקפיים על ידי ביסוד Ficoll. CD4 + תאים מופרדים ולאחר מכן על ידי סלקציה שלילית באמצעות קוקטייל נוגדנים biotinylated ואנטי ביוטין חרוזים מגנטיים שכותרתו. שימוש בתאי חסיד מן חלק CD4 תאים כמו תאים הצגת אנטיגן, ותאי T מסוג CD4 + מורחבות בתקשורת ידי הוספת הפפטיד antigenic ו IL-2. התאים מורחבת מגואלות בכיתה המקבילה II tetramer ידי דוגרים ב-C 37 למשך שעה אחת ומוכתמת לאחר מכן באמצעות נוגדנים משטח כגון אנטי CD4, אנטי CD3, אנטי CD25. לאחר תיוג, התאים ניתן לנתח באופן ישיר על ידי cytometry הזרימה. התאים tetramer חיובי בדרך כלל בצורה ברורה בקרב האוכלוסייה CD4 + תאים מורחבת. תאים Tetramer חיובי בדרך כלל CD25 + CD4 גבוה ולעיתים קרובות. בגלל רמת מכתים tetramer הרקע יכול להשתנות, מכתים תוצאות חיוביות תמיד צריך להיות לעומת צביעה של התאים אותו דבר עם tetramer רלוונטי. וריאציות מרובות של assay בסיסי זה אפשרי. תאים Tetramer חיובי עשוי להיות מיון לניתוח פנוטיפי נוספת, הכללה ELISPOT או מבחני שגשוג, או מבחני משנה נוספים. מספר קבוצות הראו גם שיתוף מכתים באמצעות tetramers ואו אנטי ציטוקינים או אנטי FoxP3 נוגדנים.

הליך זה מדגים את טיהור בהרחבת במבחנה של אנטיגן ספציפי CD4 + T תאים מדם היקפי שלם להדמיה שלהם באמצעות MHC בכיתה tetramers השנייה. Tetramers לאפשר הדמיה ישירה של תאים T עם סגוליות לאנטיגן יחיד ומוגדר הגבלה MHC Class II.

Antigen CD4 + הדמיה ספציפיות תאים T באמצעות MHC Class II Tetramers

טטרמרים של קומפלקס התאימות הרקמית הגדולה (MHC) מסוג II מאפשרים ויזואליזציה ישירה של תאי T מסוג +CD4 ספציפיים לאנטיגן באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו ...

ובכן, מה שבאמת ייחודי בבדיקת ה-Teer הוא שהיא מאפשרת לדמיין באופן ישיר תאי T ספציפיים לאנטיגן. ה-te, ה-teer הוא ההיבט הייחודי המרכזי של הבדיקה שלנו. דבר זה משולב עם שלב הגברה שאנו מבצעים.אתם יודעים, אנו מבודדים את תאי ה-T ולאחר מכן מגדלים אותם בסביבה המעשירה את הדגימה בתאי ה-T שמעניינים אותנו. לאחר מכן, אנו מסוגלים לסמן באופן ספציפי רק את אותם התאים ולהדמות אותם במכשיר flow cytometer. ובכך, במדידות קודמות, כמו CFSE או בדיקות פroliferation שהיו קיימות במשך עשורים, מה שקיבלתם היה מעין מדידה כוללת של המצב של כל써 אוכלוסיית תאי ה-T.אך ישנם מיליוני תאי T בגוף והם מזהים קשת מגוונת של תבניות. אם תהיו ברי מזל, אולי אחד מכל 200,000 עד 300,000 תאים בדגימה יהיה התא שאתם מחפשים. זו הסיבה שבדיקה זו כוללת את שלבי ההעשרה.ולכן, עם מספר בדיקה מסוים, ומכיוון שמדובר בצביעה ישירה, ניתן למעשה להבחין, מעבר לרקע, באוכלוסייה המהווה פחות מ-1% מכלל התאים. כך ניתן לזהות הבדלים קטנים מאוד ולהגיע לספירה מדויקת למדי של מספר תאי ה-T שבדגימת הדם, כלומר, אלו שבאותו הפרט המזהים את התבנית המבוקשת. אך זה לא נגמר שם, שכן ה-tetramers מאפשרים לא רק לסמן את תאי ה-T הללו, אלא גם לבודד אותם לצורך ניתוח המשכי.והטטרים שאתם משתמשים בהם מיוצרים למעשה כאן ב-BRI, זה נכון? כן. אנחנו אחת מקומץ קטן של מעבדות במדינה שהצליחו לייצר טטרי

visualizing-antigen-specific-cd4-t-cells-using-mhc-class-ii-tetramers

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקה המשלבת ב מכתים tetramer באתרו של הכלאה באתרו (ISTH) מאפשר, הדמיית מיפוי וניתוח של הקרבה המרחבי של ספציפיים וירוס CD8 תאים + T ליעדים הנגועים בנגיף שלהם, וקביעת היחסים הכמותיים בין effectors מטרות החיסונית לתוצאות זיהום.

טכניקה במקביל דמיינו ספציפיות וירוס CD8 + T ו-תאים הנגועים בווירוס תאים באתרו</em

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בפפטיד: tetramers MHC וmicrobeads המגנטי לבודד אוכלוסיות בתדירות נמוכה של תאי T epitope ספציפיים ולנתח אותם על ידי cytometry זרימה. שיטה זו מאפשרת למחקר הישיר של אוכלוסיות תאי T אנדוגני עניין...

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

סרטון זה מדגים שיטה לאפיון תאי זיכרון CD8+ מסוג T ספציפיים לנגיף הכשל החיסוני סימיאן (SIV) באמצעות טטרמרים מסוג pMHC-I (pMHC-I). טטרמר pMHC-I הוא קומפלקס של ארבע מולקולות MHC-I הקשורות לפפטידים ספציפיים ל-SIV ומצומדות לפלואורופור. טטרמרים אלה נקשרים באופן סלקטיבי לקולטני תאי T (TCRs) על תאי T CD8+ ספציפיים ל- SIV, מה שמקל על אפיון תאים אלה.

טכניקת צביעת טטרמר פפטיד-MHC-I לניתוח תאי זיכרון מסוג CD8+ ספציפיים ל-SIV

הפרוטוקול כדי לזהות תאי T מסוג CD4 עצמי תגובתי במוח ולב על ידי צביעה ישירה עם הכיתה השנייה dextramers המורכב histocompatibility הגדול תואר בדוח זה. לניתוח מקיף, שיטה אמינה כדי למנות את התדרים של תאים מסוג CD4 + T אנטיגן הספציפי באתר היא גם המציאה.

באתרו איתור של תאים אוטוריאקטיבים T מסוג CD4 במוח ולב באמצעות מחלקה מורכבת השני Dextramers סרן histocompatibility

אנו מתארים הדמיה של בעלי חיים שלמים וטכניקות מבוססות ציטומטריית זרימה לניטור התרחבות של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן בתגובה לחיסון עם ננו-חלקיקים במודל חיסון עכברי.

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור ספירת ואפיון מקוק רזוס CD8 + T תאים נגד נגיף האיידס. מאמר זה הוא שימושי לא רק בתחום האימונולוגיה HIV, אלא גם לאזורים אחרים של המחקר הביו-רפואי שבו התגובות תא CD8 + T ידועים בהשפעתם התוצאה המחלה.

ניתוח של CD8 וירוס ספציפי החיסוני Simian + T-התאים קופי רזוס ידי פפטיד-MHC-I tetramer מכתים

כאן, אנו מתארים שיטה המשלבת בחיי עיר MHC-tetramer מכתים עם אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע לוקליזציה, פנוטיפ וכמות תאי T אנטיגן ספציפי ברקמות. פרוטוקול זה משמש כדי לקבוע את המאפיינים המרחבי, פנוטיפי של אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T ביחס אחרים סוג התא ומבני ברקמות.

בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשם זיהוי איכותי vivo של אנטיגן ספציפי CD8+ T תאים. ניתוח אפשרי עם המתלים תא בודד איברים או כמויות קטנות של דם. מגוון רחב של מחקרים דורשות הניתוח של תגובות תא T ציטוטוקסי (חיסון, מחקרים חיסוני סרטן).

כימות סימולטני של CD8 וקטור נגד ו- Anti-transgene-ספציפי+ T תאים דרך MHC אני Tetramer מכתים לאחר החיסון עם וקטור ויראלי

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של רשת יחיד MHC מחלקה אני מתחמי לחקור מולקולרית באינטראקציה האנושית CD8 + T תאים הפעלה: דור של הנדסה אנטיגן הצגת תאים המבטאים שרשרת אחת בונה, תרבות של שיבוט אנושי של תא CD8 + T וניסויים תא T הפעלה.

שימוש בטכנולוגיה MHC שרשרת אחת לחקור Co-agonism ב אנושי CD8 + T Cell הפעלה

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור הדור של תאים CD8 T ספציפיים אנטיגן, ואת התרחבות שלהם בתוך מבחנה, עם מטרה של מספר גבוה מניב של תאי T פונקציונלי לשימוש מבחנה ובvivo.

יעילות גבוהה הדור של העכבר העיקרי של אנטיגן בתאי T ציטוטוקסיים לבדיקות פונקציונליות במודל סוכרת אוטואימוניות

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי אוכלוסיות נדירות של תאי T ספציפיים לאנטיגן בריאות עכברים באמצעות העשרת תאי T מבוססי חרוזים מגנטיים וטטרמרים מסוג peptide:major histocompatibility complex (MHC).

זיהוי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מריאות עכבר באמצעות פפטיד:טטרמרים מורכבים עיקריים של היסטותאימות

למד טיהור והרחבה של תאי T CD4+ ספציפיים לאנטיגן מדם היקפי והדמיה שלהם באמצעות טטרמרים מסוג MHC Class II. שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של תאי T באמצעות ציטומטריית זרימה.

Antigen CD4 + הדמיה ספציפיות תאים T באמצעות MHC Class II Tetramers

גלה סרטונים נוספים