Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 1

Zeitverlaufsinfektionen von Hela-Zellen mit Vaccinia-Virus beginnen mit der Vorbereitung der Virusinfektionen, der Infektion der Zellen und anschließend der Gewinnung der RNA aus den infizierten Zellen zu mehreren Zeitpunkten nach der Infektion. Diese RNA kann später für die Hybridisierung an Microarrays zur Analyse der Genexpression amplifiziert werden. Hallo, ich bin Judy Ann aus dem Labor von Kate Irvins am Whitehead Institute for Biomedical Research.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für eine Infektion mit Vaccinia-Virus in Säugetierzellen über einen Zeitverlauf sowie die anschließende RNA-Extraktion aus den infizierten Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion. Diese Technik ist ein erster Schritt in einem umfassenderen Protokoll, das darauf abzielt, RNA zu extrahieren und zu amplifizieren, um die Genexpression des Virus während der Infektion zu untersuchen, was in zwei weiteren JoVE-Videos abgeschlossen wird. Beginnen wir damit, für die Infektion HeLa-Zellen in Flaschen anzuziehen und abzuwarten, bis die Zellen etwa 80 % konfluent sind.

Danach sollten Sie sicherstellen, dass ausreichend virales Wachstumsmedium für das Experiment vorbereitet ist. Mithilfe von normalem DMEM mit 2 % FBS und ohne zusätzliche Antibiotika kann die Infektion entweder mit einem verfügbaren Vakzinia-Virus-Stamm mit bekannter Titer oder mit sucroseraffiniertem Virus mit bekannter Titer durchgeführt werden. Falls Sie Bedenken hinsichtlich der Wirtsgenexpression haben und sucroseraffiniertes Virus verwenden, fahren Sie mit der nächsten Sitzung fort.

Wenn Sie einen unkonzentrierten Vaccinia-Virusstamm verwenden, führen Sie eine Beschallung und Aliquotierung des Virus unmittelbar vor der Infektion durch, und verwenden Sie eine Sonikationskammer mit einem Bad aus hauptsächlich Eis und etwas Wasser bei etwa 30 W für 20 Sekunden. Vortexen Sie das Gefäß und wiederholen Sie die Beschallung dreimal, wobei Sie gegebenenfalls mehr Eis hinzufügen, um die Kammer eisgefüllt und gekühlt zu halten. Achten Sie darauf, zwischen jedem Beschallungsschritt erneut zu vortexen. Falls Sie keine Sonikationskammer besitzen, mischen Sie ein gleiches Volumen des unkonzentrierten Virusstamms mit 25 Milligramm pro Milliliter.

Trypsin heftig verwirbeln, den Virusbestand aliquotieren und 30 Minuten lang in einem Wasserbad mit 37 Grad Celsius inkubieren. Alle fünf bis zehn Minuten erneut verwirbeln, um die Zellen zu infizieren. Zunächst berechnen Sie die Menge an Viruspartikeln, die erforderlich ist, um die Zellschicht mit der gewünschten Multiplizität der Infektion zu infizieren.

Oder MOI. Typischerweise wird ein hoher MOI zwischen fünf und 10 für Infektionszeitverläufe verwendet. Anschließend die gewünschte Menge an sucrosegereinigtem Virus oder tryp-rohem Virus zu viralem Wachstumsmedium bei 37 Grad Celsius hinzufügen und gut mischen.

Sie sollten so viel Medium verwenden, dass gerade der Boden des Kolbens bedeckt ist. 10 Milliliter Medium sind ausreichend für einen T-175-Kolben. Entfernen Sie das Medium von den Zellen und waschen Sie mit PBS bei Raumtemperatur.

Geben Sie das Virus oder das virale Wachstumsmedium jedem Kolben für einen Null-Stunden-Placebo-Zeitpunkt hinzu. Fügen Sie nur das virale Wachstumsmedium ohne hinzugefügtes Virus hinzu, schwenken Sie vorsichtig und kippen Sie die Kolben; inkubieren Sie sie 37 Grad Celsius in einem 5 % CO2-Inkubator für eine Stunde. Achten Sie darauf, die Kolben alle 15 Minuten zu kippen und zu schwenken, um das Virus gleichmäßig zu verteilen und die Zellen feucht zu halten.

Nach der Inkubation das Virus enthaltende Medium entfernen und dreimal mit PBS bei Raumtemperatur spülen. Die maximale Menge an viralem Wachstumsmedium zu jedem Kolben hinzufügen.

Zum Beispiel 30 Milliliter Medium für einen T-175-Fläschchen. Sie können an diesem Zeitpunkt mit der Zählung als Zeitpunkt „Nullstunde“ beginnen, und zwar zum gewünschten Zeitpunkt nach der Infektion. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop und notieren Sie eventuelle zytopathische Effekte oder CPE.

Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 30 Milliliter PBS bei Raumtemperatur ab. Geben Sie anschließend 15 Milliliter Trypsin zu den Zellen und inkubieren Sie zwei bis fünf Minuten lang. Überprüfen Sie bei 37 Grad Celsius unter dem Mikroskop die Zellablösung und klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen zu lösen.

Überführen Sie die Zellen mit einer sterilen serologischen Pipette in ein 50-Milliliter-Konischglas. Spülen Sie den Kolben mit einem gleichen Volumen Zellwachstumsmedium und geben Sie das Medium zu den Trypsin-Zellen in das Konischglas. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit 500 × g.

Nach der Zentrifugation entfernen Sie das Tryin-Medium vom Zellpellet, resuspendieren das Zellpellet und fügen entweder Triol-Reagenz oder den Lysepuffer aus Ihrem gewünschten RNA-Isolationskit hinzu. Falls Sie Triol verwenden, teilen Sie die Probe in Ein-Milliliter-Portionen auf und geben Sie sie in 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen mit Beschriftung; anschließend gefrieren Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius ein. Wiederholen Sie dies für alle Zeitpunkte.

Ein Kolben pro Zeitpunkt ernten. Zu diesem Zeitpunkt sollte Ihre Probe resuspendiert und mit Triol-Reagenz versetzt sein und zur Weiterverarbeitung bereitstehen. Geben Sie 200 µL des BCP-Phasentrennreagenzes hinzu.

Für jedes einzelne Milliliter Triol in jedem Röhrchen wird BCP oder ein Brom drei Chlorpropan anstelle von Phenol verwendet. Um eine Kontamination mit genomischer DNA zu verringern, kann es erforderlich sein, die Probe in ein größeres Röhrchen zu überführen. Wenn Sie mit einer großen Menge Triol beginnen, wirbeln oder schütteln Sie kräftig und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für zwei bis drei Minuten. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 ×g für 15 Minuten.

Eine wässrige Phase sollte als klare Schicht oben sichtbar sein. Überführen Sie die wässrige Phase in ein frisches Gefäß. Sie sollten etwa 600 Mikroliter pro Milliliter Triazol, mit dem Sie begonnen haben, zurückgewinnen.

Führen Sie eine zweite Phenol-Chloroform-Extraktion durch. Verwenden Sie diesmal 500 Mikroliter Chloroform pro Milliliter Triazol anstelle von BCP. Die zweite Chloroform-Extraktion dient dazu, geringste Rückstände von organischem Lösungsmittel aus der Extraktion zu entfernen, da bereits Spuren die nachfolgenden Amplifikationsschritte hemmen können.

Vortexen oder kräftig schütteln, dann bei Raumtemperatur zwei bis drei Minuten inkubieren. Die Probe nach der Zentrifugation bei 12.000 ×g 15 Minuten zentrifugieren. Die wässrige Phase in ein frisches Gefäß überführen.

Denken Sie daran, dass die wässrige Phase die klare obere Schicht ist. Geben Sie als Nächstes 20 Mikrogramm lineares Acrylamid zu jeder Probe hinzu. Das lineare Acrylamid wirkt als Träger und hilft, die RNA auszufällen.

Fügen Sie jeder Probe 500 Mikroliter Isopropanol pro Milliliter Triol, mit dem Sie begonnen haben, hinzu und mischen Sie gründlich. Inkubieren Sie die Proben gut bei Raumtemperatur für 10 Minuten; anschließend zentrifugieren Sie in einer Mikrozentrifuge für 10 bis 15 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit. Das RNA-Pellet ist nach der Zentrifugation am Boden des Röhrchens sichtbar.

Entfernen Sie die Überstände sehr vorsichtig entweder mit einem Vakuum-Aspirator oder manuell mit einer Pipette aus dem Röhrchen. Stören Sie das Pellet dabei nicht. Waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter 70%igem Ethanol und zentrifugieren Sie es mit maximaler Geschwindigkeit für fünf bis sieben Minuten.

Sehr vorsichtig. Entfernen Sie das Ethanol aus dem Reaktionsgefäß entweder mit einem Vakuum-Aspirator oder manuell mittels Pipette. Entsorgen Sie den Überstand.

Überprüfen Sie, ob das Pellet am Boden des Röhrchens sichtbar ist. Wiederholen Sie diesen Waschschritt, nachdem das Überstand entfernt wurde. Markieren Sie die Position des Pellets am Röhrchen.

Trocknen Sie das Pellet nicht länger als fünf Minuten an der Luft. Trocknen Sie es nicht zu stark, da sonst die RNA schwer wieder aufzulösen sein wird. Als Nächstes, falls eine DNA-Behandlung geplant ist, suspendieren Sie das Pellet in 17 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser.

Wenn keine D'S-Behandlung geplant ist, resuspendieren Sie in 20 Mikrolitern. Für die D'S-Behandlung verwenden Sie das KaiGen RNA-freie DNA-Set. Geben Sie zwei Mikroliter Puffer RDD und ein Mikroliter rekonstituierte RNA-freie Lösung hinzu.

Die DNA wird zu der resuspendierten RNA gegeben, vorsichtig gemischt und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert. Als Nächstes fügen Sie zwei Mikroliter einer 2,5-Millimolar-EDTA-Lösung hinzu und inkubieren fünf Minuten bei 65 Grad Celsius. Um die DNA zu inaktivieren, überschreiten Sie weder die Inaktivierungszeit noch die Temperatur, da längere Zeiten und höhere Temperaturen zur Degradation der RNA führen können.

Jetzt haben Sie die Behandlung der DNA abgeschlossen. Überprüfen Sie die RNA-Konzentration mittels Spektrophotometer. Spuren von Phenol oder BCP können als Anstieg bei 270 Nanometern jenseits des Standardpeaks bei 260 Nanometern nachgewiesen werden.

Bei der Messung der Absorption von Gesamt-RNA nach der Extraktion sollten Sie die RNA mithilfe einer Filter- oder Säulen-basierten RNA-Extraktionsmethode erneut gewinnen, falls eine solche Kontamination auftritt, bevor Sie mit der Amplifikation fortfahren. Sie können die RNA-Probe bei minus 80 Grad Celsius lagern. Falls gewünscht, können Sie die RNA-Qualität überprüfen, indem Sie einen Agilent Bioanalyzer verwenden oder die Probe auf einem denaturierenden Gel laufen lassen und die OD-Lesewerte am Bioanalyzer prüfen.

Eine gute RNA-Qualität wird durch die RNA-Integritätszahl oder RIN angegeben. Die RIN basiert auf einem Skala von eins bis 10, wobei eins das stärkste degradierte Profil und 10 die höchste Integrität darstellt. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine Zeitreiheninfektion mit dem Vaccinia-Virus durchführt und wie man die RNA zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion aus infizierten Zellen extrahiert.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass mehrere kritische Schritte bei der Einrichtung einer synchronen Vaccinia-Infektion zu beachten sind. Zunächst die sorgfältige Beschallung oder Trypsinisierung des Virus. Es ist wichtig, Viruspartikel zu disaggregieren, da Vaccinia stark zur Aggregation neigt, was eine gleichmäßige Infektion der Zellen verhindern würde.

Zweitens sollte zur Erzielung einer asynchronen Infektion ein hoher MOI von mehr als zwei verwendet werden, um sicherzustellen, dass jede Zelle infiziert wird. Eine Mischung aus infizierten und nicht infizierten Zellen führt zu mehreren Infektionsrunden, heterogenen Zeitpunktmischungen sowie asynchronen viralen und Wirtszell-transkriptionellen Reaktionen. Drittens sollte die Infektion in minimalen Mediummengen durchgeführt werden, um eine maximale Adsorption des Virus an die Zellen zu ermöglichen.

Zusätzlich ermöglicht das regelmäßige Schütteln der Kolben oder Kulturschalen alle 10 Minuten eine gleichmäßige Verteilung des Virus im Kolben und stellt sicher, dass die Zellen nicht austrocknen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

Seien Sie sicher, die anderen Videos dieser Reihe anzusehen, in denen wir das Verfahren zur linearen Amplifikation von RNA-Proben sowie die Herstellung und Aufreinigung fluoreszenzmarkierter RNA zeigen.